Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour les ARN interférents et des microarn
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- Aline Hébert
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1 Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour les ARN interférents et des microarn Coordinateur-Equipe 1: Fabienne LE PROVOST, GABI Equipe 2: Geneviève JOLIVET, BDR Equipe 3: Hubert LAUDE, VIM INRA, Jouy-en-Josas
2 Inhiber l expression d un gène de façon spécifique par mécanisme d interférence à ARN - Petits ARN simples brins nt Soit dégradation de l ARN si appariement parfait Soit inhibition de la traduction si appariement imparfait - Issus de structures en épingle à cheveux, en provenance de la transcription de gènes naturels (mirna) ou artificiels (shrna) premir-30 UGAAG A UC G C 5 CGGAAUUCCG GGCUUUGGUGG CUACAUGUUCU C GGC CCGGAACCACC--GAUGUACGAGG A 3 CCUAUAG C GUAGAC shrna CCCCCCCAACAAAGAGUGCUCTTAA UUC AA U GGGUUGUUUCUCACGAGAAUU A G G A U UUUU
3 Comment obtenir des animaux transgéniques produisant des ARN interférents? λ In vitro (cellules): promoteur de type Pol III (U6, H1) λ Excellents résultats in vivo uniquement après intégration dans des vecteurs lentiviraux ou retroviraux Promoteur Pol III (U6) cible boucle shrna CCCAACAAAGAGUGCUCTTAA UUC AA U GGGUUGUUUCUCACGAGAAUU A G G A U UUUU Produire des ARN interférents par des vecteurs non lentiviraux
4 λ 1ere stratégie : introduire la construction pol III-shRNA dans une construction «cargo» Promoteur Pol III cible boucle isolateur Promoteur ef1α Terminateur de transcription
5 λ 2ème stratégie : le gène chimère contient un gène marqueur (egfp) et le gène pol III-shRNA Promoteur CMV egfp PA Promoteur Pol III (U6) cible sélection Production de shrna
6 λ 3ème stratégie : transcription sous la dépendance d un promoteur de type pol II Promoteur hprnp mirna (mir30) Terminateur de transcription isolateur Promoteur ef1α mirna (mir30) isolateur Promoteur ef1α shrna
7 Les gènes ciblés Gène Prnp impliqué dans les maladies à Prion. Gène IE180 (immediate-early gene) du virus de la maladie d Aujeszky.
8 Modèles expérimentaux λ cellules en culture + gène cible + vecteur sirna λ souris transgéniques produites par microinjection d ADN dans l embryon unicellulaire
9 Résultats λ Mise au point d une technique quantitative de dosage pour mesurer les taux de sirna produits
10 Comparaison de l efficacité de vecteurs d expression différents exprimant la même séquence cible; exemple du gène IE du virus d Aujeszky mirna isolateur Promoteur ef1α mirna (mir30) U6-shRNA Prom pol III (U6) 100 % expression du gène IE Production de sirna - mirna U6-shRNA U6-shRNA mirna
11 λ Mise en évidence de deux séquences particulièrement efficaces dans l ARNm du gène IE ARNm du gène IE 5 3 ATG TGA
12 Gène Prnp λ Production de souris transgéniques exprimant un ARN interférent dirigé contre le gène Prnp murin Promoteur CMV egfp PA Prom pol III (U6) Pas de lignées cible de souris exprimant le gène egfp Promoteur hprnp mirna (mir30) Terminateur de transcription 7 lignées de souris transgéniques
13 Gène Prnp λ Etude des souris transgéniques exprimant un ARN interférent dirigé contre le gène Prnp murin Promoteur hprnp mirna (mir30) qrt-pcr western blot F+/ Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference, Gallozzi et al, 2008, Transgenic Res, 17:
14 Gène IE180 λ Production de souris transgéniques exprimant un ARN interférent dirigé contre le gène IE du virus de la maladie d Aujeszky ARNm du gène IE 5 3 ATG TGA U6-shRNA Promoteur isolateur ef1α Pas de lignée de souris transgéniques utilisables Promoteur ef1α mirna isolateur mirna (mir30) 2 lignées de souris transgéniques A Sawafta, thèse de doctorat, 2008
15 Gène IE180 λ Production de souris transgéniques exprimant un ARN interférent dirigé contre le gène IE du virus de la maladie d Aujeszky ARNm du gène IE 5 3 ATG TGA U6-shRNA 5 lignées de souris transgéniques Toutes les lignées de souris transgéniques expriment le sirna dans le cerveau
16 Gène IE180 λ Essai de mise au point d un test pour évaluer in vitro la résistance des souris à une infection par le virus - Culture de fibroblastes primaires préparés à partir de prélèvements de peau de fœtus de souris transgéniques - Infection des fibroblastes par le virus d Aujeszky : toutes les cellules meurent. Mais production 100x plus faible du sirna dans ces cellules que dans le cerveau des animaux transgéniques! L infection de cellules en culture ne peut pas être utilisée comme test in vitro permettant de prévoir l efficacité Du 21 au 23 octobre 2009 de Toursla protection.
17 Gène IE180 λ Infection des souris transgéniques par le virus de la maladie d Aujeszky ARNm du gène IE 5 3 ATG TGA % de survie des souris J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 jours après l infection J18 J20 Lignée 15 témoins
18 Gène IE180 λ Infection des souris transgéniques par le virus de la maladie d Aujeszky : prévue en janvier 2010 ARNm du gène IE 5 3 ATG TGA % de survie des souris J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 jours après l infection J18 J20 Nouvelles lignées? Lignée 15 témoins
19 Gène IE180 - Cette résistance est-elle la conséquence d un effet ARN interférent sur l expression du gène IE? Infection virale des souris (janvier 2010) et analyse de l expression du gène IE dans le cerveau avant la mort % de survie des souris J0 Abattage d une partie des animaux Dosage de IE mrna dans le cerveau J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 jours après l infection J18 J20 Lignée 15 témoins
20 Conclusions Intérêt des études in vitro pour choisir les séquences cibles les plus efficaces Attention aux effets non-spécifiques, parfois létaux, saturation des systèmes de maturation des siarn In vivo, les vecteurs d expression non lentiviraux que nous avons utilisés induisent - une inhibition significative de l expression des gènes cibles (cas du gène Prnp) - une résistance des souris à une infection virale (Virus Aujeszky)
21 Génétique Animale et Biologie Intégrative (GABI) Fabienne LE PROVOST* Micaela GALLOZZI Gaëlle TILLY José COSTA Marthe VILOTTE Caroline MORGENTHALER Bruno PASSET Jean-Luc VILOTTE * coordinateur Virologie et Immunologie Moléculaires (VIM) Jérome CHAPUIS Vincent BERINGUE Annick LE DUR Hubert LAUDE François LEFÈVRE Biologie du Développement et Reproduction (BDR) Nathalie DANIEL-CARLIER Ashraf SAWAFTA Dominique THEPOT Sonia PRINCE Geneviève JOLIVET Louis-Marie HOUDEBINE Unité Expérimentale Animalerie Rongeurs (UEAR)
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