L1 - TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE STRUCTURALE

Transcription

1 L1 - TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE STRUCTURALE La composition en acides aminés (type et nombre d acides aminés) des protéines est variable d une protéine à une autre. Il est possible, en réalisant une hydrolyse des liaisons peptidiques par méthode chimique (HCl 6M, 110 C, plusieurs heures), de libérer tous les acides aminés d une protéine. On peut alors déterminer, par différentes méthodes, la composition en acides aminés de cette protéine. Au cours de ce TP vous allez aborder deux techniques qui servent à obtenir des informations sur la composition en acides aminés d une protéine : I- la détermination du nombre d un acide aminé particulier, la tyrosine, grâce à un dosage spécifique, II- la détermination d une composition en acides aminés par chromatographie sur couche mince. Ces deux techniques ne permettent pas, à elles seules, de connaître la composition en acides aminés d une protéine mais donnent des informations partielles qui rajoutées à d autres permettrons de connaître cette composition. I- Détermination du nombre de tyrosine de la caséine β à partir du dosage dans un hydrolysat de la tyrosine libre A- Principe du dosage de la tyrosine par le réactif de Folin-Ciocalteu La caséine β est une protéine issue du lait. Sa masse moléculaire est d environ 25,0 kda. Un hydrolysat de caséine a été obtenu par hydrolyse acide. Cet hydrolysat contient environ 40 % d acides aminés libres, le reste est constitué de peptides non totalement hydrolysés. Afin d évaluer le nombre de tyrosine contenues dans la caséine β, on réalise un dosage de cet acide aminé à l aide du réactif de Folin-Ciocalteu à partir d une solution d hydrolysat de caséine. En milieu alcalin le réactif de Folin Ciocalteu (complexe phosphomolybdique-phosphotungstique) est réduit par le noyau phénolique des résidus de tyrosine libres. Cette réaction donne une coloration bleue permettant un dosage colorimétrique. Pour quantifier la quantité de tyrosine libre de l hydrolysat à étudier, il faut réaliser une gamme de référence (ou gamme étalon) avec une solution pure, de concentration connue, de tyrosine. 1

2 B) Réalisation du dosage 1) Solutions et réactifs - HCl 0,2 mol/l (50 ml) - NaOH 0,2 mol/l (50 ml) - Réactif de Folin (dilué au ½) - Hydrolysat de caséine : solution à 4,2 g de protéines/l (dite solution mère) - Solution de référence (tyrosine) à 50 mg/l solubilisé dans HCl 0,2 mol/l (masse molaire de la tyrosine = 181 g/mol) Question : Comment préparer une solution de HCL à 0,2 mol/l à partir d HCL concentré à 36% (densité HCL= 1,14 ; masse molaire 36,5 g/mole)? 2) Préparation de la gamme d étalonnage A partir de la solution de référence, réaliser une gamme de concentration allant de 0 à 50 mg/l dans un volume de 1 ml final. Vous pipeterez les solutions de tyrosine et d HCl 0,2 mol/l avec un Pipetman (P1000). Il est nécessaire de changer de pointe lorsque vous changer de solution. Procéder, pour doser la quantité de tyrosine suivant la procédure décrite ci dessous. T Tyr (mg) Tyr (µl) HCl qsp 1mL Le tube T est un tube témoin : Quel est l intérêt de ce tube? Quel doit être sa composition? Quelles solutions et quels volumes allez-vous pipeter? 3) Préparation des échantillons d hydrolysat Faire une solution diluée de moitié de la solution mère d hydrolysat de caséine, dans un volume final de 1ml, en utilisant la solution d HCL 0,2mol/L. Procéder, pour doser la quantité de tyrosine dans la solution mère d hydrolysat (tube 6) et dans la solution diluée de moitié (tube 7), suivant la procédure décrite ci dessous. 4) Réaction colorée de dosage de la tyrosine Les réactions colorées sur les dilutions de la gamme étalon (tubes T et 1 à 5) et sur les échantillons d hydrolysat de caséine (tubes 6 et 7) doivent être faites toutes en même temps. 2

3 Pour chaque échantillon (8 tubes =T+7) : - Prélever 500 µl de la solution, - Ajouter 2,5 ml de NaOH 0,2 mol/l, - Ajouter 0,25 ml de réactif de Folin, - Remettre le bouchon et agiter vigoureusement en retournant 4-5 fois. Attendre 5 à 10 min avant de lire les absorbances à 750 nm contre le témoin (T) noter les valeurs. Question : Pourquoi utilise-t-on une solution diluée de l hydrolysat de caséine pour réaliser le dosage de la tyrosine libre? C) Résultats : concentration massique de tyrosine et nombre de tyrosine A partir des valeurs d absorbance en fonction de la concentration en tyrosine, tracer la courbe de référence. En déduire la concentration massique de tyrosine dans l hydrolysat de caséine ainsi que le nombre de tyrosine par molécule de protéine. II- Séparation des acides aminés d un mélange par chromatographie de partage A- Principe de la chromatographie de partage Lorsqu'une substance est mise en présence de 2 solvants non miscibles elle se répartit entre ces 2 solvants selon son coefficient de solubilité pour chacun des solvants. Ce coefficient est caractéristique de la substance étudiée, indépendant de sa concentration et n'est pas affecté par la présence d'autres solutés. Ce principe sera utilisé pour la séparation d un mélange d acides aminés par chromatographie sur couche mince. Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire correspond au support polaire, constitué de cellulose fixée sur un film plastique. La phase mobile est constituée d un solvant apolaire qui migre le long de la phase stationnaire par capillarité. Cette chromatographie est réalisée dans une cuve de verre (dite «cuve sandwich»), close, dont l'atmosphère est saturée par la phase mobile. Le mélange à analyser est déposé à l'une des extrémités de la feuille (voir figure 1). Cette extrémité est mise en contact avec la phase mobile. Plus les substances du mélange sont solubles dans la phase mobile plus elles migreront sur le support et plus les substances sont solubles dans la phase stationnaire moins elles migreront. La solubilité des acides aminés dans la phase polaire (fixe) ou apolaire (mobile) va dépendre de la structure chimique de leur chaîne latérale, la présence d atome H, O ou N étant déterminante pour le caractère hydrophile ou hydrophobe. Afin de pouvoir comparer les migrations on définit le Rf : Distance parcourue par le composé Distance parcourue par le solvant 3

4 qui permet à tout moment d exprimer la migration relative de l acide aminé par rapport à une référence, ici le solvant. Ce Rf est caractéristique d'une substance dans des conditions expérimentales données. Les acides aminés hydrophiles resteront près du dépôt. Les acides aminés hydrophobes seront entraînés dans la phase mobile et migreront loin du dépôt. Dans ces conditions le Rf des acides aminés hydrophiles aura une valeur bien plus faible que le Rf des acides aminés hydrophobes. Pour identifier un acide aminé inconnu il est nécessaire d analyser, en parallèle sur la même plaque, des acides aminés connus qui serviront de comparaison. Le Rf des acides aminés connus et inconnus sera alors comparé. cuve sandwich plaque de cellulose solvant Figure 1 dépôt acides aminés B- Application Cette technique va être utilisée pour connaître la composition en acides aminés de tri peptides hydrolysés. 1) Support utilisé : Le support utilisé est un «film» dont la partie active (100 µm d'épaisseur sur le support en polyester) est constituée par une couche de cellulose fabriquée à l'aide de cellulose spéciale et d'un liant. Celui-ci, nécessaire pour assurer une souplesse, une adhérence et une cohésion convenable du film, a été choisi de manière à ne pas influer sur les propriétés adsorbantes de la cellulose. Le pouvoir de résolution très élevé de ces films permet d'obtenir de très bons résultats avec des migrations de 8 à 10 cm seulement. 4

5 2) Application des échantillons : Chaque dépôt de solutions (hydrolysat de tripeptide ou solutions d acide aminé connu) est effectué avec des capillaires de sorte que le volume déposé en une fois soit de l'ordre de 0,2 µl à 0,5 µl afin de donner des dépôts de petite dimension ayant 1 à 3 mm de diamètre. Tracer la ligne de dépôt à 2 cm du bord inférieur du film (très légèrement avec un crayon HB ou 4B). A partir du bord, délimiter sur cette ligne 10 repères tous les 1 cm. Déposer chaque acide aminé connu (8) et 2 fois le mélange d'acides aminés à analyser, sur la ligne de dépôt, au milieu de l'intervalle entre les repères. Ces dépôts sont séchés à l air libre avant de faire la chromatographie. ATTENTION : ne pas mettre les doigts sur la surface mate de la plaque de cellulose qui est la face active. 3) Réalisation de la chromatographie. On utilisera une cuve dite "sandwich". L'évaporation est très réduite dans ce type de cuve et il n'est pas nécessaire de prendre des précautions spéciales pour assurer la saturation. Le film sera placé entre les deux plateaux de la cuve. Après avoir fixé les pinces de serrage, on place l'ensemble dans un bac contenant 120 ml du mélange de solvants. Le mélange monte par capillarité, c'est une chromatographie ascendante. Quand la phase mobile atteint le sommet du film, le chromatogramme est retiré de la cuve. Le front du solvant est souligné délicatement au crayon à papier. Le film est ensuite séché. Mélange de solvants : Butanol normal 80 ml Acide acétique conc. 20 ml H 2 O distillée : 20 ml 4) Révélation du chromatogramme Elle est obtenue en pulvérisant sur le film (à faire sous la hotte), une solution de ninhydrine à 0,2% dans le mélange éthanol-acide acétique (4V : 1V) et en séchant ensuite le chromatogramme pendant 2 à 3 minutes dans une étuve à 80 C. Exemple de préparation de la solution de ninhydrine à 0.2%. Pour préparer 200 ml de cette solution : - on pèse 0,4g de ninhydrine (se présente sous forme de poudre) - on prépare le mélange éthanol, acide acétique en mesurant 160 ml d'éthanol et en rajoutant 40 ml d'acide acétique (mélange 4V : 1V) - on dissout les 0,4 g de ninhydrine avec le mélange éthanol-acide acétique de façon que le volume final soit de 200 ml. C- Résultats : Faire un tableau des valeurs de Rf obtenues pour les acides aminés de référence et ceux du mélange. En déduire la composition du mélange. 5