La recherche expérimentale d aval: Evaluation des antibiotiques dans les modèles animaux. Bruno FANTIN Hôpital Beaujon, Service de Médecine Interne.

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1 La recherche expérimentale d aval: Evaluation des antibiotiques dans les modèles animaux Bruno FANTIN Hôpital Beaujon, Service de Médecine Interne.

2 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux 2. Apport des modèles expérimentaux pour l évaluation des antibiotiques

3 Technical Issues in Animal Models: identification of the critical steps Animal «In vitro» inoculum «In vivo» inoculum Carry-over Infection PK/PD Regrowth Survival CFU R End Points Create infection Start of therapy End of therapy Sacrifice

4 Lack of Relationship between «in vitro» and «in vivo» Inocula fold decrease h 48 h Murine E. coli pyelonephritis fold increase h 48 h Rabbit S. aureus endocarditis

5 Time Interval between Infection and Treatment Two major impacts: Severity of the systemic infection Characteristics of the «in vivo» inoculum growth phase inoculum size risk of emergence of resistance «phenotypic tolerance»

6 Bacterial Growth between Inoculation and Treatment in Murine K. pneumoniae Infection Leggett et al., JID,1989

7 Influence of Duration of Infection on Antibiotic Activity in S. epidermidis Endocarditis in Rats Entenza et al., JID, 1994

8 When to Start Therapy? What is the question? Efficacy Killing rate PK/PD parameters Influence of disease state on efficacy Risk of emergence of resistance Early phase Exponential growth Standardized inoculum ~ 10 6 CFU (# MBC inoculum) Late treatment Stationary phase High inoculum ~ CFU

9 Duration of Therapy Rate of killing, efficacy - CFU 0-24 h discriminant parameter correlated with survival Emergence of resistance - more prolonged duration of treatment required onset of selection depends on mechanism of resistance (mutation or not) growth of R subpopulation under selective antibiotic pressure

10 Duration of Therapy and Development of Resistance in Endocarditis due to VanB E. faecalis Aslangul et al., JID, 1997

11 Rational for Antimicrobial Dosing in Animals Serum elimination half-lives of selected antibiotics in mice and humans Half-life in minutes Drug Mice Humans Amikacin Imipenem 8 60 Cefazolin Ciprofloxacin Minocycline Andes & Craig, IJAA, 2002

12 Simulation of Human Pharmacokinetics Uranyl nitrate-induced renal impairment in mice Human amoxicillin PK simulation in rabbits Andes & Craig, AAC, 1998 Piroth et al., AAC, 1999

13 Simulation of Human Pharmacokinetics Simulation of ft>mic in mice Lepeule et al, AAC, 2012

14 Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (1) If CFU the end point: not too late (avoid regrowth) not too soon (avoid carryover) minimize [antibiotic concentration/mic] ratio in tissue samples

15 Duration of Time from End of Therapy to Sacrifice (2) If sterilization rate or «cure rate» are the end points: delay sacrifice «relapse» study Results of therapy in rabbits with E. coli endocarditis Regimen Log10 CFU/g of vegetation ± SD on: Day 1 Day 6 Control 8.8 ± 0.5 (0/7) 8.1 ± 1.4 (0/8) Ceftriaxone 6.7 ± 1.1 (0/8) 7.6 ± 1.5 (0/7) Netilmicin 5.7 ± 2.0 (0/7) 8.3 ± 1.1 (0/9) Ceftriaxone + netilmicin 2.6 ± 0.9 (4/8) 3.6 ± 2.3 (3/8) Fantin et al., AAC, 1989

16 Animal Models: end points Efficacy Qualitative - Survival rate - Sterilization rate Quantitative - CFU - parameters calculated from the Emax model dose to kill x log bacteriostatic dose protective dose Emergence of resistance

17 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Limites techniques et utilisation des modèles expérimentaux 2. Apport des modèles expérimentaux pour l évaluation des antibiotiques

18 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

19 Détermination des paramètres PK/PD prédictifs de l activité antibactérienne in vivo Andes & Craig, IJAA, 2002 Doses et régimes thérapeutiques multiples Relation entre données PK/PD observées et activité in vivo

20 Approche PK/PD Approche indispensable parallèlement à la phase I Permet de définir: Le paramètre PK/PD à optimiser chez l homme Le mode d administration optimal chez l homme Modèles utilisés: Infection de cuisse de souris Infection pulmonaire de souris

21 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

22 Simulation de la pharmacocinétique humaine Andes & Craig, AAC 98

23 Vérification de la virulence des souches Andes & Craig, AAC 98

24 Etude de l activité in vivo pour chaque niveau de CMI Andes & Craig, AAC 98

25 Relation dose - effet bactéricide de la témocilline dans les reins de souris log CFU/g CFT073 CFT073 Tc P ft > CMI (%) Soubirou et al, sous presse

26 PK Témocilline chez l homme De Jongh R, JAC 2008

27 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

28 Experimental endocarditis in rabbits

29 Experimental vegetations in rabbits

30 Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie : diffusion homogène Crémieux et al, JID, 1989

31 Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion avec gradient décroissant Fantin et al., AAC, 1994

32 Etude de la diffusion des antibiotiques par autoradiographie: diffusion hétérogène Saleh-Mghir et al, AAC 1999

33 Types de diffusion des antibiotiques marqués dans la végétation Homogène Amoxicilline, clavulanate Péfloxacine, téma, sparflo Tobramycine Spiramycine, quinupristine Daptomycine Non homogène Gradient de diffusion Ceftriaxone, pénicilline Dalfoprisitine Tigecycline Périphérique Teicoplanine Hétérogène Oritavancine

34 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

35 Témocilline dans la pyélonéphrite murine à E. coli BLSE Souches E. coli CFT073 CFT073 Tc P89 log CFU/g dans les reins de souris ± et (no stérile/no total) Contrôles début de traitement 4,23 ± 1,17 (1/18) 4,86 ± 0,69 (0/20) Témocilline 200mg/kg q2h 2,10 ± 1,70 (9/21) 1,43 ± 1,52 (14/22) Céfotaxime 1,92 ± 1,38 (6/13) 3,95 ± 1,18 (0/13) Imipénème 1,98 ± 1,67 (6/14) 1,34 ± 1,50 (12/15) Pas de mutants in vivo Soubirou et al, sous presse

36 Activity of Daptomycin against VanA E. faecium D400 Caron et al, AAC 1992

37 Difffusion of Daptomycin in cardiac vegetations Caron et al, AAC 1992

38 Activity of Daptomycin in VanA E. faecium rabbit endocarditis Cions in human with a 6mg/kg dose: Peak # µg/ml Trough # 10 µg/ml Chakraborty, JAC 2009 Caron et al, AAC 1992

39 Discrepancy between in vitro and in vivo activity of Daptomycin against E. faecium Protein binding in human # 90% Caron et al, AAC 1992

40 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

41 Gènes qnr et activité des quinolones Concentration minimale inhibitrice (CMI) de la ciprofloxacine en fonction des mécanismes de résistances Souches de E. coli CMI (mg/l) x CMI Sauvage 0,004 Transconjugant (Tc) qnra1 0,25 64 Mutant gyra 0,25 64 CMI=0,5 mg/l: seuil de sensibilité à la ciprofloxacine (CA-SFM) Rodriguez-Martinez et al, AAC 2007

42 Première étape: préparation d un système isogénique chez Escherichia coli E. coli CFT073 (référence pour modèle in vivo) E. coli CFT073-RR (résistante à la rifampicine) Souches cliniques donatrices: E. coli CFT073 RR-gyrA E. coli Hm13 (plasmide pqnra1) E. coli CFT073-RR Tc (pqnrs1) E. coli CFT073-RR Tc (pqnra1) E. coli PS105 (plasmide pqnrs1) Allou et al, AAC 2009

43 Activité de la ciprofloxacine in vitro Souches de E. coli CMI CPM CPM/ CMI PMR CFT703-RR 0,0075 0,06 8 0,8 (± 0,4) x 10-8 CFT073-RR Tc (pqnra1) 0, ,6 (± 0,7) x 10-8 CFT073-RR Tc (pqnrs1) 0, ,1 (± 1,5) x 10-8 CT073-RR-gyrA 0, ,3 (± 0,4) x 10-8 PMR: proportion de mutants résistants / ciprofloxacine à 4 fois la CMI Allou et al, AAC 2009

44 Experimental pyelonephritis in mice CBA female mice 8-week-old Intra-urethral injection under general anesthesia of 50 µl from an inoculum of 5 x bactéries/ml (10 8 ).

45 Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR P=0,003

46 Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR Tc (pqnrs1) log/ufc g de vessie Contrôle début traitement (n=15) Contrôle fin traitement (n=15) P=0,6 Souris traitées (n=16)

47 Thérapeutique chez les souris infectées par CFT073-RR-gyrA P=0,9 5 log ufc/g de rein Contrôle début traitement (n=15) Contrôle fin traitement (n=15) Souris traitées (n=16)

48 Paramètres PK/PD de la ciprofloxacine chez la souris Souches de E. coli CMI ASC0 24 h /CMI Cmax /CMI CFT073-RR 0, CFT073-RR Tc(pQnrA1) 0, CFT073-RR Tc(pQnrS1) 0, CFT073-RR-gyrA 0, Cmax: 1,1 +/- 0,2 µg/ml; ASC0 24 h : 6.2 +/- 1.2 µg.h/ml Allou et al, AAC 2009

49 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques 1. Approche PK/PD 2. Concentrations critiques 3. Diffusion des antibiotiques 4. Activité de nouveaux antibiotiques 5. Impact d un mécanisme de résistance 6. Intérêt d associations d antibiotiques

50 Etude de l association levofloxacine-rifampicine dans l ostéite expérimentale Muller-Seyries et al, AAC 2009

51 Apports des modèles expérimentaux à l évaluation des antibiotiques: conclusions Pas de modèle «universel» Intérêt des modèles non discriminants pour l approche PK/PD Intérêt des modèles discriminants pour une approche explicative des facteurs limitant l activité in vivo