Apoptose/chimiorésistance des cellules d ostéosarcome
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- Arlette Germain
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1 Apoptose/chimiorésistance des cellules d ostéosarcome
2 Associées à des métastases Les ostéosarcomes Tumeurs primitives osseuses- Ostéoblastes malins Localisées principalement dans les os longs Surviennent majoritairement dans la deuxième décennie (moyenne à 16 ans), 2 ème pic d apparition après 65 ans Tumeurs hétérogènes constituées d un os pathologique, associées à des lésions ostéolytiques Tumeurs résistantes : 70% des patients survivent sans évènement à 5 ans
3 Les ostéosarcomes: étiologie Altérations des gènes contrôlant le cycle cellulaire p53 prb c-myc p16 Altérations de l expression des gènes impliqués dans la différenciation ostéoblastique Runx2 Ostérix Perte du contrôle du cycle cellulaire Déstabilisation du génome Signalisation induite par WNT Altérations de la différenciation
4 Les ostéosarcomes : traitements Protocole OS2006 : étude clinique de phase III Chirurgie conservatrice Chimiothérapie préopératoire et postopératoire (suivant l âge) Inhibiteur TopoII Etoposide (VP-16) Agents Alkylants Ifosfamide Anti métabolites Méthotrexate Transcription Réplication Agents intercalants doxorubicine, cisplatine Bisphosphonate : zolédronate
5 Les ostéosarcomes: résistance aux traitements agents cytotoxiques Import des agents cytotoxiques Export des agents cytotoxiques transporteurs ABC Inactivation des agents cytotoxiques GST Perturbation des points de contrôle du cycle cellulaire Chk1 Réparation de l ADN NER, TLS Altération de l apoptose Bcl-2, Bax, survivine diminution de la réponse apoptotique
6 Signalisation WNT et développement des ostéosarcomes WIF-1 -Expression de LRP5 dans des tumeurs humaines corrèle avec la présence de métastases et une survie réduite des patients (Hoang et coll., Int J Cancer, 2004) -L inhibition de LRP5 par un dominant négatif (DN) diminue la croissance tumorale et les métastases dans un modèle de tumeurs chez la souris b-catenin GSK3 APC AXIN b-catenin (Guo et coll., Clin Orthop Relat Res, 2008) -WIF-1 est inhibé par des modifications épigénétiques (Kansara et coll., J Clin Invest, 2010) -Altérations fréquentes du gène Apc qui corrèle avec un mauvais pronostic (Entz-Werlé et coll., Neoplasia, 2007) -Les souris Apc1638N/+Twist-null/+ développent des tumeurs de type ostéosarcome (Entz-Werlé et coll., Trans Onc, 2010)
7 Altérations de la b-caténine dans les ostéosarcomes? -Accumulation de la b-caténine dans le cytoplasme ou dans les noyaux (Haydon et coll., Int J Cancer, 2002) -Accumulation de la b-caténine à la membrane -Inactivation de la voie Wnt (Cai et coll., J Pathol, 2009) Signalisation Wnt et réponse à la chimiothérapie????????
8 Activation de la voie Wnt/b-caténine/TCF dans des lignées de cellules humaines dérivées d ostéosarcome WRE WRE Plasmide TOPFlash WRE WRE WRE LUCIFERASE 8 7 Cellules d ostéosarcome Cellules ostéoblastiques Activité transcriptionnelle des facteurs TCF
9 Le syndécan-2 Enzymes Facteurs de croissance Matrice extracellulaire Assemblage Clivage Récepteur Intégrines signalisation -Prolifération -Différenciation -Adhésion/migration -Dépôt de la matrice
10 Syndécan-2 et apoptose SYNDÉCAN-2 Le SYNDECAN-2 module la signalisation cellulaire pour induire ou favoriser l APOPTOSE E F Y A JNK JNK-P ERK PI3K NFkB PKCδ E F Y A Activité catalytique de PKCd Modrowski et coll., Bone, 2005 Orosco, A. et coll., J Cell Biochem, Villena, J., et coll., Apoptosis, APOPTOSE
11 Syndécan-2 = suppresseur de tumeur Cellules K7M2 sont dérivées d un ostéosarcome spontané chez la souris BalB/c K7M2 K7M2+SYND2 Apoptose Le syndécan-2 module la réponse aux agents de chimiothérapie +Syndécan-2 Doxorubicine sirna Syndécan-2 Doxorubicine
12 Expression Relative du Syndecan-2 Expression du Syndecan-2 Défaut de syndécan-2 dans les ostéosarcomes PCR Immunohistochimie * * Cellules MG63 U2OS SaOS2 OHS4 Ostéoblastiques Tissus Osseux sains Tissus Tumoraux * Indique P <0,05 Orosco et coll., Cancer Research, 2007
13 R LU DDCT Les facteurs TCF répriment l expression de syndécan-2 Sites de liaison TCF/LEF 5 UTR LUC ChIP Activité promoteur syndécan-2 3 2,5 2 ARNm syndécan-2 * 2 1 * 1,5 1 0,5 * Indique P <0,05 0 Ctl TCF 0 Ctl sitcf
14 RLU Wnt/β-caténine/TCF réprime le syndécan-2 WNT FZD Activité Promoteur Syndécan * * LRP5/6 1 β-caténine TCF 0 contrôle β- caténine Wnt3a * Indique P <0,05 Expression du Syndecan-2
15 Signalisation Wnt/β-caténine/TCF et chimiorésistance des ostéosarcomes
16 Viabilité Sélection de cellules résistantes Lignées cellulaires d ostéosarcome Traitement 24h Doxorubicine 50ng/mL 120 semaine 1 Traitement U2OS Résistantes U2OS semaine 2 40 semaine 3 Traitement ng/ml doxorubicine Traitement semaine 4
17 Viabilité (% de cellules contrôle) La surexpression de syndécan-2 rétablit la sensibilité à la doxorubicine U2OS U2OS + Syndécan-2 U2OS résistantes U2OS résistantes + Syndécan-2 Doxorubicine (ng/ml)
18 ΔΔCT La doxorubicine n induit pas le syndécan-2 dans les cellules résistantes Expression du syndécan-2 dans des tumeurs humaines avant Chimiothérapie après Chimiothérapie ARNm du Syndécan U2OS Cellules U2OS * U2OS Résistantes Cellules U2OS résistantes Doxorubicine (50ng/ml)
19 ΔΔ CT ΔΔCT FoxO3a module l induction de syndécan-2 par la Doxorubicine ARNm du syndécan-2 ARNm du syndécan * * * Vecteur vide FoxO3a Contrôle Doxorubicine Doxorubicine + sifoxo3a * Indique P <0,05
20 R LU FoxO3a module l induction de syndécan-2 par la doxorubicine de façon indirecte AACA Site de liaison pour FoxO3a Activité de p-3,62-luc Région 5 du syndécan-2 p-3.62-luc 5 UTR LUC AACA * ATCA * ATCA Site de liaison pour FoxO3a muté p-3.62-luc 5 UTR LUC Région 5 du syndécan-2 * Indique P <0,05
21 FoxO3a interagit avec β-caténine sous stress oxydatif Essers et Coll, Science, 2005
22 % Input ΔΔ CT Doxorubicine/FoxO3a interagit avec WNT/β-caténine/TCF 100 Liaison de TCF4 au promoteur du syndécan-2 Expression du syndécan Doxo FoxO* Wnt b-cat TCF * 20 0 Doxorubicine Doxorubicine TCF b-cat* * Indique P< 0,05
23 Résumé Cellules sensibles Cellules résistantes Doxorubicine Wnt Doxorubicine Wnt Syndécan-2 FoxO bcat TCF Syndécan-2 bcat TCF Transcription du syndécan-2 Transcription du syndécan-2
24 Effets des inhibiteurs Wnt sur la réponse à la doxorubicine WNT sfrp-1 DKK1 FZD LRP5/6 β-caténine TCF PKF Expression du Syndecan- 2/ Réponse à la doxorubicine?
25 R LU (cellules traitées/ cellules non-traitées) Effets des inhibiteurs de Wnt sur l activité de la doxorubicine FoxO3a β-caténine Activité transcriptionelle des facteurs FoxO Contrôle U2OS U2OS résistantes 2.5 * * 2.0 Doxorubicine 1.5 * Doxorubicine + sfrp1/ Dkk1 * Indique P <0,05 Doxorubicine + PKF β-caténine est nécessaire à l action de la Doxorubicine
26 L inhibition de l activité TCF réduit la viabilité cellulaire in vitro Viabilité cellulaire (% des contrôles) Cellules sensibles Cellules résistantes 80 b a b a b 20 0 Doxorubicine PKF H&E/Safran
27 Modèle d ostéosarcomes in vivo PKF ,5mg/kg IP J-0 J-21 J-28 J-35 PBS Injection des cellules Doxorubicine 2 mg/kg IV Doxorubicine 2 mg/kg IV Sacrifice K7M2
28 Volume Tumoral (mm3) L inhibition de l activité transcriptionnelle TCF augmente l effet de la doxorubicine in vivo p= p= p= 0.07 * Sans cellules * K7M2 Doxorubicine K7M2 K7M2 Doxorubicine + PKF
29 Conclusions -Activation de la signalisation Wnt/b-caténine/TCF Freine la réponse aux agents de chimiothérapie -La b-caténine est impliquée dans l inhibition et l induction de la réponse cellulaire Inhibition ciblée de l activité des facteurs TCF = Nouvelle stratégie thérapeutique dans l ostéosarcome?
30 β-caténine : molécule clé du système Wnt Ostéoprogéniteur Pré-ostéoblaste Ostéoblaste Prolifération Différenciation Survie Renouvellement Engagement CSM b-caténine Minéralisation de la matrice Multifonctions de la signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules souches embryonnaires dépend de: Ostéocyte 1- expression des effecteurs Wnt 2- recrutement de co-facteurs par la β-caténine Apoptose D après Khosla, 2008
31 Activités transcriptionnelles et épigénétiques de la b-caténine
32 Développement de petites molécules ciblant spécifiquement une activité de la b-caténine PKF ICG-001 Apoptose des cellules cancéreuses CBP b-caténine TCF IQ-1 Renouvellement des cellules souches p300 Phénotype Cellules Souche Initiation de la Différenciation
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