1/Nous verrons dans un premier temps les différents outils qui ont permis de déterminer les molécules de signalisation et les facteurs de

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1 1/Nous verrons dans un premier temps les différents outils qui ont permis de déterminer les molécules de signalisation et les facteurs de transcription. Ces molécules et facteurs interviennent dans ce dialogue entre l ecto-mésenchyme et l épithélium oral et sont à l origine des inductions instructives et permissives. Mais voyons tout d abord ces deux types d inductions. 1

2 2/Il y a en effet 2 différents types d inductions : les inductions instructives et les inductions permissives...rectangle rouge sur la diapositive. Le facteur inducteur permissif ne modifie pas l engagement tissulaire mais permet au tissu de s engager dans la voie où il aurait dû s engager. Au contraire, dans l induction instructive, en présence d un signal inducteur, il y a modification de l engagement du tissu compétent. Ce signal peut revêtir différentes formes. Il peut provenir soit :. Rectangle vert sur la diapositive... D une molécule diffusible (on parlera de champ morphogénique), on parle alors de gradient de concentration de morphogène : en fonction du gradient de concentration de ce morphogène il y aura un engagement différent du tissu compétent... Rectangle bleu sur la diapositive. D un contact intercellulaire dans la zone de contact entre tissu inducteur et tissu compétent, le tissu compétent s'engage dans une voie différente de celle qu'il aurait pris normalement.. Enfin, ce signal inducteur peut également provenir de molécules exprimées et piégées au sein d une matrice ou d une structure telle une membrane basale. Pour juger si l induction se fait par contact direct cellulaire ou grâce à une molécule diffusible, on utilise un filtre entre le tissu inducteur et le tissu induit (compétent). 2

3 3/La connaissance des molécules de signalisation et des facteurs de transcription a été permise par les outils de la biologie moléculaire. Trois techniques ont été principalement utilisées. Réactions immunologiques anticorps /antigènes qui permettent de localiser l expression des protéines sur différents plan de coupes.. Hybridation in-situ (sondes avec lesquelles on peut localiser les ARNs des protéines. L Utilisation de technique de mutagenèse et de transgenèse permettent d obtenir des animaux déficients en des gènes sélectionnés ou encore activés d une façon temporaire ou locale. Ceci permet entre autre d évaluer l importance des différents facteurs précédemment mis en évidence et de hiérarchiser ces éléments.. Les billes imbibées de molécules de signalisation permettent de visualiser si localement une molécule entraîne l expression ou l inhibition d un facteur de transcription et/ou d autres molécules de signalisation. On peut ainsi déterminer des cascades d activation et d inhibition. (encadré rouge) Dans les expériences de dissociation/réassociation que je vous ai présenté, on ne peut pas connaître la nature du facteur inducteur. (encadré bleu) Maintenant, si on remplace l épithélium par une bille imbibée d une molécule précédemment identifiée sur coupe par hybridation in situ, alors on pourra déterminer si cette molécule induit une réaction au niveau du tissu compétent. 3

4 4/ Illustration de la méthode des billes imbibées pour montrer : (1) l induction de BMP4 sur l écto-mésenchyme du premier Arc pharyngé (2) d établir la chronologie d expression entre Msx 1, BMP 4 et Lef 1 au sein de cet ecto-mésenchyme. 1 ère étape (non montré sur cette diapo) : Identification de BMP4 au niveau épithélial du premier arc pharyngé d un animal sauvage à E 11.5 par Hybridation in situ BMP4 est exprimé au niveau épithélial 2 ème étape (case A): Détermination de l expression de BMP4 au niveau de l éctomésenchyme du premier arc pharyngé d un animal sauvage à E 11.5.pour cette identification, on met une bille imbibée de BMP4 en contact de l écto-mésenchyme du premier Arc pharyngé si BMP4 s exprime au niveau de cet ecto-mésenchyme alors par hybridation in situ et après coloration, le tissu devient bleu.c est ce qui est observé sur les différentes expérimentations.. En G, vous avez le contrôle, avec une bille imbibée de sérum albumine (SA) le tissu ne se colore pas. 3 ème étape (Case B) En refaisant la même expérience mais en utilisant un ecto-mésenchyme provenant d un animal transgénique Msx1-/- déficient en Msx1-/- (n exprimant donc pas Msx1), on voit que BMP4 n est pas exprimé seule la bille est colorée en bleu Donc Msx1 est intermédiaire entre BMP4 de l épithélium oral et BMP4 ecto-mésenchymateux. 4 ème étape (case E) Détermination de l expression de Lef-1 au niveau de l écto-mésenchyme du premier arc pharyngé d un animal sauvage à E 11.5.de la même façon, on met une bille imbibée de BMP4 en contact de l écto-mésenchyme du premier Arc si Lef-1 s exprime au niveau de cet ecto-mésenchyme alors par hybridation in situ et après coloration, le tissu devient bleu.c est ce qui est observé sur les différentes expérimentations.. En H, vous avez le contrôle, avec une bille imbibée de sérum albumine (SA) le tissu ne se colore pas. 5 ème étape (Case F) Par contre et à la différence de ce qui a été observé case B, en utilisant un ecto-mésenchyme provenant d un animal transgénique Msx1-/- déficient en Msx1-/- (n exprimant donc pas Msx1), on voit qu une bille de BMP4 induit l expression de lef-1 au niveau de cet ecto-mésenchyme Donc BMP4 active directement Lef-1 sans l intermédiaire de Msx1. La cascade d induction entre Msx 1, BMP 4 et Lef1 est celle que vous avez sur le schéma de droite : BMP4, au niveau de l épithélium oral induit BMP4 au niveau de l ectomésenchyme par l intermédiaire de Msx1. Par contre, BMP4 au niveau de l ectomésenchyme induit directement Lef 1. 4

5 5/ Grâce à cette méthodologie et à l utilisation d animaux transgéniques, des cascades d activation ont pu être découvertes et les principales modifications histologiques décrites précédemment comprises. Le plan pour décrire ces modifications est présenté en trois grandes parties. La première qui est difficilement séparable de l odontogenèse proprement dite est la régionalisation du 1 er Arc pharyngé. La seconde qui marque véritablement le début de l odontogenèse est appelée stade d initiation et recouvre d une part la détermination du site et d autre part la détermination de l identité dentaire. Enfin, dans une troisième partie, seront décrites les structures et les facteurs qui conduisent à l expression d une morphologie. Les phénomènes de différenciation feront l objet d autres cours 5

6 6/Cette diapositive bien que datant de 2003 vous schématise de façon simplifiée et illustrative non seulement les principales étapes de l odontogenèse mais également les facteurs intervenants dans ce dialogue épithélio-mésenchymateux. Depuis 2003, de nouveaux facteurs ont été découverts mais la compréhension de l odontogenèse est restée celle de cette diapositive. L ensemble de ces connaissances ont été acquises sur la molaire de souris qui présente bien évidemment quelques différences avec celle de l être humain. Cependant, les molécules de signalisation et les facteurs de transcription ainsi que les cascades d activation sont très comparables. Cette diapositive résume donc les connaissances qui devront être les vôtres à la fin de ce cours.nous verrons donc dans un premier temps le stade d initiation. 6

7 7/A partir du premier Arc pharyngé, nous avons vu qu il se forme une zone appelée épithélium odontogène qui se développe par modification d orientation de la plaque équatoriale des cellules épithéliales par rapport à la membrane basale. De plus, les expériences de LUMSDEN avaient démontré sur l embryon de souris qu'entre E9-E11 des évènements biologiques provoquaient une régionalisation du 1 er Arc pharyngé et que celui-ci semblait dans un premier temps dépendant d'une induction instructive épithéliale (E9) puis ecto-mésenchymateuse (E11). Question : Quelles sont les molécules à l origine de cette régionalisation?. 7

8 8/Par différentes techniques (Hybridation in situ), il peut être démontré : - Case A et F (fort grossissement de la case A) : A partir de E8,5, l expression de FGF 8 dans une partie restrictive de épithélium oral du 1 er arc pharyngé. Cette partie restrictive représente l Ep. Odontogéne - Case B et G (fort grossissement de la case B) Vers E10, face à cet épithélium oral exprimant FGF8, on observe l expression du facteur de transcription Lhx-7 au niveau de l ecto-mésenchyme. - Case C et H (fort grossissement de la case C) Par contre, au niveau aboral, on observe l expression de Goosecoid au niveau ecto-mésenchymateux Question :1/ Est-ce l expression de FGF8 épithélial induit Lhx-7 au niveau de l ectomésenchyme? 2/ Est-ce l expression de Goosecoid au niveau caudal (aboral) inhibe l expression de Lhx-7 dans cette zone? 3/ Est-ce les expressions de FGF8 épithélial, de Lhx-7 au niveau ectomésenchymateux rostral (oral) et de Goosecoid au niveau caudal (aboral) sont à l origine de la régionalisation du 1 er arc? Nous allons répondre à ces trois questions dans les trois diapositives suivantes. 8

9 9/Notre première question est : est-ce que l expression de FGF8 épithélial induit Lhx-7 au niveau de l ecto- mésenchyme? L expérience de Tucker en 1998 répond à cette question en utilisant la technique de la bille imbibée. Une bille imbibée de FGF8 est mise en contact soit de la l partie rostrale (orale) du 1 er arc pharyngé soit de la partie caudale (aborale). Colonne de gauche, vous avez les expérimentions faites avec la partie rostrale, colonne de droite, vous avez les expérimentions faites avec la partie caudale, A E-10, (figures B/C) le 1 er arc en présence de son épithélium exprime Lhx7 aussi bien dans la partie orale (colonne de gauche) que dans la partie aborale (colonne de droite) A E-10, Tucker sépare l épithélium du 1 er Arc de l ectomésenchyme sous-jacent et une bille imbibée de FGF 8 est mise en contact de cet ecto-mésenchyme au niveau oral et aboral afin de déterminer si elle peut induire au niveau de l ecto-mésenchyme l expression de Lhx- 7. Si c est le cas, on peut en déduire que le 1 er Arc est non-déterminé. Si au contraire, cette bille ne peut pas induire l expression de Lhx-7, cela veut dire que des facteurs de restriction y ont établi un gradient ou une zone limitative. A E-10, (Figures D/E) la bille imbibée de FGF8 permet l expression de Lhx-7 aussi bien au niveau oral qu aboral. Donc, à E10, l ecto-mésenchyme du premier arc n est pas régionalisé. A E10,5 (Figures F/G) et contrairement à E-10 (figures B/C), le 1 er arc en présence de son épithélium n exprime Lhx7 que dans la partie orale et plus dans la partie aborale A E10,5, (Figures H/I) soit une demi-journée après, la même expérience est refaite avec la bille imbibée de FGF8, et l expression de Lhx-7 n est observée que dans la partie orale. Une bille placée au niveau de l ectomésenchyme aborale ne permet plus l expression de Lhx-7. (Figures J/K) Le même résultat est obtenu à E 11. Donc, la régionalisation est établie dès E 10,5. En résumé, nous pouvons donc en conclure que les éléments suivants : Au niveau de la partie orale du 1 er Arc pharyngé, l expression de FGF8 au niveau des cellules épithéliales de l épithélium odontogène provoque l expression de Lhx-7 dans l ectomésenchyme sous-jacent. 9

10 10/Notre deuxième question est : est-ce l expression de Goosecoid au niveau caudal (aboral) inhibe l expression de Lhx-7 dans cette zone? Pour voir s il y a un lien entre l expression de Gsc dans la partie caudale et l absence de Lhx-7 dans cette partie, on regarde l expression de Lhx7 chez un animal sauvage et chez un animal transgénique Gsc -/- n exprimant donc pas Gsc: il n y a pas de différence entre les 2 (comparer A et B) donc Gsc n est pas responsable de cette inhibition dans la partie caudale. On peut se demander alors si FGF8 n agirait pas comme un morphogène. Pour répondre à cette question, une bille de FGF8 à différentes concentrations est mise en contact avec le 1 er arc pharyngé et on observe l intensité de expression de Lhx 7 On note que l expression de Lhx7 mesurée par la coloration et l ampleur de l halo en hybridation in situ est d autant plus important que la concentration de FGF8 est importante.on en conclut donc que FGF8 agit comme un morphogène. 10

11 11/Notre dernière question est : est-ce que les expressions de FGF8 épithélial, de Lhx-7 au niveau ecto-mésenchymateux rostral (oral) et de Goosecoid au niveau caudal (aboral) sont à l origine de la régionalisation du 1 er arc et donc ultérieurement de la formation de dents dans la partie rostral et de leur absence dans la partie caudale? L expérience de Tucker en 1998 confirme ce résultat : des explants du 1 er arc pharyngé sont prélevés à E10 et E10,5, mis pendant 48h en culture puis transplantés dans la capsule rénale d une souris receveuse pendant 12 jours. L hypothèse testée est que seule la partie orale (rostrale) permet la formation de dents. Case A/B/C/D/E : Tucker prend la partie rostrale du premier arc pharyngée avec son épithélium et son ecto-mésenchyme : Par hybridation in situ, on met en évidence l expression de Fgf8 et de Lhx7 mais pas de Gsc. Après transplantation de ce tissu dans la capsule rénale pendant 12 jours, elle obtient des dents. Case F/G/H/I/J : Tucker refait la même expérience mais avec la partie caudale. Par hydridation, elle observe l expression degsc mais pas de Fgf8. Après transplantation de ce tissu pendant 12 jours dans la capsule rénale, elle n obtient pas de dents. Case K/L/M/N/O: A E10, avec des expérimentations de dissociation-réassociation, quand l épithélium rostrale (qui exprime Fgf8) est mis en contact avec l ectomésenchyme caudale (qui n exprimait pas Lhx7) on voit que Fgf8 permet l expression de Lhx7 dans la partie caudale, Gsc étant exprimé au delà de l expression de Lhx7 en bordure de la partie caudale. Après transplantation dans la capsule rénale pendant 1é jours, on obtient des dents. On peut donc induire la formation de dents dans la partie caudale en présence d une induction par Fgf8. (Faites le lien avec l expérience de LUMSDEN). Case P/Q/R/S/T : A E11, la même expérience que celle faite à E10 ne permet pas la formation de dents car le 1 er Arc est régionalisé et donc déterminé. 11

12 12/Résultats et Interprétations: Dès E8.5, l épithélium oral exprime FGF8 dans une partie restrictive odontogène. Cela entraîne à E9.5 l expression de Lhx 7 et de Lhx 6 (les mêmes résultats que ceux montrés précédemment ont été obtenus avec Lhx6) dans l ecto-mésenchyme qui lui fait face et à distance l expression de Gsc (Gooscoïd) dans la partie caudale. La différence d expression s explique par un phénomène de gradient de concentration. FGF8 agit comme un morphogène : à forte concentration FGF8 active Lhx 6 et 7 dans l ecto-mésenchyme qui lui fait face, et à faible concentration FGF8 active à distance l expression de Gsc (Gooscoïd) dans la partie caudale. La phase d initiation du système dentaire peut donc se résumer ainsi :. A partir de E 8.5 et ultérieurement, l expression de FGF 8 s installe dans une zone limitée odontogène de l épithélium oral. FGF8 va alors jouer un rôle d'induction.. A E10 L expression de FGF 8 induit l expression de Lhx 6 et 7 dans l ectomésenchyme rostral et 12 heures après, de Gsc dans l'ecto-mésenchyme caudale soit à E10,5 jours. L expression de Lhx-6 et7 va bloquer l expression de Goosecoïd (gsc) dans la partie rostrale du 1 er arc. L 'expression d endothéline dans l épithélium caudale va maintenir cette expression de Gsc dans la partie caudale. Conclusion : il y a une régionalisation du premier arc pharyngé se traduisant par l expression de Fgf8 et Lhx 6 et 7 dans la partie orale (rostrale), et d endothéline et de Gsc dans la partie aborale (caudale). 12

13 13/Par hybridation in situ, d autres facteurs de transcription ainsi que d autres molécules de signalisation ont pu être mises en évidence. A côté de FGF8, une seconde molécule de signalisation épithéliale BMP4 est exprimée dans la région distale et donc médiane du 1 er Arc. De même, au niveau ecto-mésenchymateux un autre facteur de transcription Pax-9 est exprimé. Au niveau épithélial, la signalisation BMP 4, FGF8 par un système d activation et d inhibition des facteurs de transcription va permettre une limitation du champ odontogène. 13

14 15/ Case A/B/C.D/E/F en haut à droite. Par la technique d hybridation in situ chez la souris, on Schéma en bas à droite : Shh s exprime dans les secteurs dentés au niveau des placodes denta Hybridation in situ en bas à droite. La localisation de l épaississement épithélial s accompag Chez l homme, l insuffisance d expression de Pitx2 est associée au syndrome de Rieger qui est Le phénomène d initiation et de détermination du site dentaire est intimement lié à l expressio 14

15 16/Cette dualité entre BMP4 et FGF8 va induire 2 zones distinctes avec des signalisations différentes : une zone distale c'est à dire antérieure dans le premier Arc pharyngé ou il y aura expression de BMP4 épithélial induisant Msx1 qui sera Fgf8 indépendante et une zone proximale qui sera Fgf8 dépendante qui induira Barx1 et Dlx2 entre autres au niveau ecto-mésenchymateux. 15

16 17/Cette diapositive vous montre quelques régulation au niveau épithéliale et ectomésenchymateux.. Figure de gauche Au niveau épithélial il existe des boucles de feeback positif de Fgf8 par Pitx2 et de BMP4 par Islet 1 qui maintiennent l expression de Fgf8 et de Bmp4. La localisation respective de BMP4 au niveau antérieur (ou distal) et de Fgf8 au niveau postérieur (ou proximal) est entretenue par Pitx2 qui a un effet inhibiteur sur BMP4 et activateur sur Fgf8. Pour sa part, Shh épithélial activera l expression de Ptc et de Gly1/2/3 dans l'ecto-mésenchyme.. Figure de droite De même au niveau ecto-mésenchymateux FGF8 active Barx1/ Lhx6 et7 et Dlx2 alors que Barx1 est inhibé par BMP4 épithélial. 16

17 18/Les études menées au niveau cutané sur l animal Tabby présentant une déficience de l ectodysplasine ont permis de mieux comprendre le développement de la placode dentaire qui dans sa phase initiale est très comparable à celle de la placode pileuse à l origine du poil au niveau cutanée. En présence de Wnt, la transcription du gène Lef est activée. L activation du promoteur Lef se traduit par l expression du facteur Lef et permet l activation du promoteur du gène TA à l origine de l ectodysplasine. Celle-ci est alors synthétisée et se fixe sur son récepteur EDAR (récepteur de l ectodysplasine) au niveau ecto-mésenchymateux qui active après une cascade d activation le gène NFқB permettant la formation de la placode et des dérivés ectodermiques (tels que les poils, glandes et dents). L activine au niveau ecto-mésenchymateux permettra d activer le système (EDA/EDAR). 17

18 Des expériences de surexpression de l ectodysplasine ont permis de montrer une élongation de la placode dentaire et le développement chez la souris en avant de M1 d une dent surnuméraire confirmant le rôle de l ectodysplasine dans la détermination et la formation de la placode dentaire. 18

19 20/ Rectangle rouge L arrivée des CCN dans le 1 er Arc va permettre l expression de molécules de signalisation épithéliale qui vont instruire et réduire la plasticité des cellules des CN entrainant un phénomène de régionalisation de ce tissu. Rectangle vert Dans un deuxième temps, cette interaction épithéliomésenchymateuse va mener à une segmentation du 1 er Arc pharyngé avec un phénomène d initiation se traduisant morphologiquement par la formation d une lame dentaire puis de placodes dentaires. Rectangle Bleu Enfin, au sein de chaque placode, une combinatoire d homéogènes spécifique va s établir qui sera responsable de l identité dentaire que nous allons maintenant développer 19

20 21/Nous avons vu lors de cette première phase comment une signalisation épithéliale permettait de déterminer le site d initiation et donc la localisation des germes dentaires. Nous allons voir maintenant que lors de cette phase d initiation comment s installe également une phase d'identité du germe en formation (incisive et molaire pour la souris), en fonction de sa localisation au sein du 1 er Arc. Nous verrons ensuite comment cette identité se traduit dans un second temps par une morphologie au stade de cloche. 20

21 26/Nous allons voir cependant que si cette identité tissulaire est bien sous la dépendance de l écto-mésenchyme, l information instructive de cet ectomésenchyme provient de l épithélium comme nous l avons déjà vu dans la détermination du site dentaire avec la formation de la lame dentaire et des placodes dentaires 21

22 27/ Les différentes expérimentations de dissociation-réassociation présentées précédemment ont permis à deux chercheurs, Butler et Osborn de proposer deux différentes théories pour expliquer les phénomènes d identité dentaire qui vous sont présentées sur la gauche de la diapositive..la théorie du champs morphogénétique et la théorie clonale (encadré rouge). Cependant, actuellement une seule théorie s impose : Celle de l Homéocode Odontogénique développé en 1995 par P. SHARPE qui représente une synthèse des théories présentées par Butler et à Osborn (encadré vert). L homéocode Odontogénique est directement héritée du code Hox qui détermine les segments appendiculaires et axial rappelé dans le diagramme en haut à gauche (encadré bleu). Tout comme les segments appendiculaires et axial, l identité d une dent est caractérisé par son homéocode qui représente la combinatoire d homéogènes qui définit la position et l identité de la dent. Dans le cas de l identité dentaire ces homéogènes sont des homéogènes divergents et donc de type non hox. Chacune des dents est donc définie par un bloc de gènes. Les gènes mis dans les encadrés pour définir les secteurs molaire, incisif et canin.sont faux cette représentation vient d une publication de Paul SHARPE de 1995 qui à l époque était provocatrice puisqu il décrivait un secteur canin chez la souris..mais le concept était juste. 22

23 28/Selon ce concept, l épithélium odontogène exprime des gradients de molécules de signalisation (FGF, BMP, SHH, Wnt) qui instruisent les cellules des crêtes neurales sous-jacentes qui ont migré dans le 1 er Arc. Ces cellules vont alors selon cette instruction moléculaire site spécifique exprimer selon leur position des gènes divergents. Les combinatoires d homéogènes divergents exprimés localement par ces cellules des crêtes neurales vont déterminer l identité dentaire qui sera formée localement. Chacune des dents est donc définie par un bloc de gènes. 23

24 29/Aujourd hui, cette théorie d homéocode dentaire est confirmée par les mutations aussi bien observées chez l homme que par les manipulations génétiques à titre expérimentale faites sur les souris. Nous pouvons ainsi hiérarchiser l importance de chaque gène et déterminer son rôle dans la formation de la lame dentaire, des placodes ou encore dans le type de dent formée. Sur cette diapositive, ils vous sont listés les pathologies de développement associés à ces différents facteurs de transcription et molécules de signalisation. 24

25 38/Cette diapositive vous résume l évolution de la recherche qui s est faite ces dernières années depuis les théories de Butler et Osborn (1980) jusqu à la mise en place de combinatoires d homogènes qui définissent des secteurs de type dentaire incisif, molaire En conclusion, on peut dire que l'identité dentaire est liée à la migration de cellules des crêtes neurales au niveau de l ecto-mésenchyme oral, où sous l action de molécules de signalisation de l épithélium oral, ces cellules vont exprimer d une façon temporo-spatiale un engagement spécifique dentaire. La signalisation épithéliale s exprime selon des champs morphogéniques constitués par des gradients de molécules de signalisation diffusibles qui activent des facteurs de transcription qui détermineront localement cet homéocode dentaire responsable de l identité dentaire. En résumé, durant cette phase d initiation, l épithélium oral détermine l ectomésenchyme sous-jacent à exprimer des homéogènes divergents non Hox qui sont à l origine. de la régionalisation du 1 er arc pharyngé,. de la détermination du site du développement de la lame dentaire et des placodes dentaires. et enfin de leurs identités. Cependant cette induction instructive est limitée dans le temps puisque vers E10,5 E11 l ecto-mésenchyme acquiert son indépendance. (ceci explique les expériences précédentes de Kollar démontrant que l induction instructive venait de l ecto-mésenchyme (expériences faites à 12 jours et plus). 25

26 Nous allons maintenant aborder la dernière partie de ce cours concernant la morphologie dentaire. Nous verrons que le développement histologique du germe dentaire que nous avions présenté dans la première partie de ce cours est intimement lié à la formation de centres de signalisation qui au niveau dentaire sont appelés centre de signalisation précoce, Nœud de l émail primaire et Nœuds de l émail secondaires. Pour leur part, les nœuds de l émail secondaires sont directement responsables de la morphologie dentaire. 26

27 40/Question : Quels sont les mécanismes par lesquels une activité cellulaire se traduit par la formation d une structure morphologique? Réponse : Plusieurs mécanismes peuvent être combinés pour établir une morphologie. Vous avez sur cette diapositive plusieurs mécanismes qui vous sont présentés dont notamment la croissance différentielle. Remarque : Nous avions vu précédemment que l'identité dentaire était déterminée très précocement dès le stade d'initiation par l établissement d une combinatoire d homéogènes, et pourtant sa traduction morphologique n apparaitra que beaucoup plus tardivement au stade de cloche. Il existe donc un décalage dans le temps entre l'expression moléculaire de cette combinatoire d homéogènes responsable de l identité dentaire et sa traduction morphologique. 27

28 41/Cette croissance différentielle est liée à la présence de centres de signalisation situés au niveau épithélial. Par définition, un centre de signalisation est une structure cellulaire transitoire responsable de la synthèse de facteurs de transcription et de molécules de signalisation déterminant localement l activité cellulaire d un territoire. Au niveau de la genèse dentaire, on note la formation de 3 centres de signalisation :. Un centre de signalisation précoce (E11/E11,5). Un second centre de signalisation appelé "Nœud de l émail primaire" (E13/E14). Enfin, un troisième centre de signalisation correspondant aux "Nœuds de l émail secondaires" (E15/E16) 28

29 42/ (encadré rouge) Le centre de signalisation précoce est mis en place au niveau de la lame dentaire et permet le phénomène de bourgeonnement épithélial responsable de la formation de la placode dentaire. Il est intiment lié aux quatre classes de molécules de signalisation que nous avons déjà vu et à des facteurs de transcription. (encadré vert) Le second centre de signalisation appelé "Nœud de l émail primaire" (NE 1) est mis en place au stade terminal du bourgeon dans sa partie apicale et reste actif 24 à 36 heures jusqu au stade de début de cupule. Il n y a qu un seul nœud de l émail primaire par germe dentaire quel que soit le type de dent et donc le nombre de cuspides. Ce nœud va disparaître physiquement au stade de cupule. Il est à noter que la formation de ce nœud de l émail primaire est sous la dépendance de BMP4 ecto-mésenchymateux qui a été activé par Msx1. L expression de BMP4 ecto-mésenchymateux est le facteur responsable de l inversion de l induction instructive (que nous avions vu précédemment) qui bascule de la partie épithéliale à la partie ecto-mésenchymateuse. (encadré bleu) Enfin, le troisième centre de signalisation correspondant aux «Nœuds de l émail secondaires» (NE 2). Ces nœuds secondaires sont mis en place au stade de cloche et leur nombre dépend du nombre de cuspide. Chaque nœud secondaire sera à l origine d une cuspide. Ce sont ces nœuds de l émail secondaires qui vont déterminer la morphologie dentaire. C est à partir de ces nœuds de l émail secondaires que vont s effectuer les phénomènes de différenciation cellulaire qui vont figer la structure dentaire et donc lui donner sa morphologie. C'est leur chronologie de formation et d'activités qui déterminera la hauteur et la localisation des cuspides. Les noeuds de l émail secondaires peuvent donc être apparentés à des centres de différenciation cellulaire. 29

30 43/Alors, comment fonctionne un nœud? L activation de Bmp 4 ecto-mésenchymateux va permettre la formation du NE 1. Au sein de ce nœud, des molécules de signalisation vont agir par diffusion sur les tissus environnants soit en stimulant la prolifération des cellules de l ectomésenchyme et de l épithélium soit en stimulant des phénomènes d apoptose spécifiquement au niveau du nœud de l émail primaire provoquant ainsi la disparition de ce nœud. On retrouve parmi ces molécules de signalisation et ces facteurs de transcription d une part Fgf 4,9 et 3 qui stimulent la prolifération cellulaire et d autre part Bmp 4, Bmp2, P21, Msx 2 et Lef 1 qui stimulent l apoptose 30

31 46/Question : Comment une croissance différentielle au niveau d un Ep. peut permettre la formation d une morphologie? Réponse : Revenons au stade de cloche car c est à ce stade que l'acquisition d'une morphologie se fait. Au stade de cloche, l organe de l émail fait face à la papille ecto-mésenchymateuse. L organe de l émail est composé de différentes strates cellulaires de l extérieur vers l intérieur : l Epithélium Dentaire Externe le réticulum étoilé le stratum intermedium l Epithélium Dentaire Interne EDI) Sur le schéma, l EDI est représenté en noir et toutes ses cellules sont en prolifération. Si à un moment et à un endroit donné de cet EDI, appelé noeud de l'émail secondaire, des cellules ne prolifèrent plus, et sortent donc du cycle mitotique, (représenté en blanc sur le schéma), et que toutes les autres cellules continuent à proliférer sauf à cet endroit, alors, du fait de cette croissance différentielle, il se forme un pli. Comme les autres cellules continuent toujours à proliférer, la plicature devient de plus en plus prononcée et cette zone va former ce qu on appelle la future pointe cuspidienne. Si un processus analogue, apparaît au niveau d une autre zone de cet EDI provoquant un blocage localisé des mitoses alors que partout ailleurs des phénomènes de prolifération sont maintenus, il se formera alors un second pli qui sera à l origine d une seconde cuspide. Comme les deux zones d arrêt de prolifération cellulaire ne sont pas synchrones dans leur formation, la première pointe cuspidienne sera plus haute que la deuxième. Nous voyons donc comment, un mécanisme de prolifération différentielle au niveau d'une zone épithéliale peut mener à la formation d'une structure morphologique. 31

32 Enfin le dernier point que j aborderai est la théorie du module décrite pour la première fois par Jernvall et Thesleff en 2000 et toujours d actualité à ce jour 32

33 51/Comme vous l avez constaté sur cette diapositive récapitulative que je vous ai présentée tout au long de ce cours, il existe lors de la genèse de l organe dentaire un dialogue épithélio-ecto-mésenchymateux qui se traduit par l interaction et l expression récurrentes de molécules de signalisation et de facteurs de transcription qui font évoluer la zone cellulaire concernée vers une structure dentaire. On peut identifier comme l ont fait Thesleff et Jernvall un module commun de signalisation formé de l interaction épithélio-ectomésenchymateuse (encadré rouge sur la diapositive en bas à droite) 33

34 52/De cette observation, Thesleff et Jernvall en ont tiré un concept : le concept du module. La répétition de ce module permettrait la mise en place à la fois du site, de l identité et de la morphologie dentaire. Un module commun de signalisation met en place dans un premier temps une région à potentiel odontogénique qui mène à la formation de la lame dentaire qui correspond à la phase d initiation que nous avons vu. Lors de cette phase d initiation, au sein de cette lame dentaire, des sites différents se développent selon leur localisation. Dans le même temps, toujours pendant cette phase d initiation, sous l influence de modules différents représentés par les centres de signalisation précoce se forment des placodes dentaires caractérisées par une identité dentaire. Puis, sous l induction de centre de signalisation primaire représenté par le Nœud de l émail primaire, chaque bourgeon va évoluer vers le stade de cloche. L expression localisée de ce module permet la prolifération de la partie épithéliale et ectomésenchymateuse et donc le développement organisé et structuré de cette entité cellulaire. Enfin, dans une dernière étape, une morphologie dentaire sera acquise par l expression d un nouveau module représenté par les Nœuds de l émail secondaires dont le nombre et la chronologie d apparition seront à l origine du nombre et de la taille des cuspides. Ce module peut être défini comme formé : 1/ des facteurs de transcription et des molécules de signalisation permettant le développement d un germe dentaire.l expression de l ensemble de ces éléments n est pas constante tout au long de la genèse dentaire cela a été démontré pour plusieurs facteurs. 2/ de la combinatoire d homéogènes et de molécules de signalisation caractérisant l identité de chaque type dentaire (incisives, canine, prémolaires et molaires) pour l être humain et donc chaque module aura une combinatoire différente. 3/ des facteurs de transcription et des molécules de signalisation intervenant spécifiquement à une étape donnée (bourgeon, cupule, cloche, Nœud de l émail primaire, Noeuds de l émail secondaires etc..) Donc, à l intérieur de ce module répétitif il y a des différences selon le temps, le site et évidemment la nature de la dent définie. 34

35 53/Enfin, vous avez pu remarquer que tout ce que je vous ai décrit concerne la souris et plus précisément la première molaire de la souris. Pour l être humain, il existe des différences que l on peut déjà observer par des pathologies spécifiques génétiques entre l être humain et la souris.cependant, le schéma général reste valable à la différence notable (1) du temps de formation, (2) de la complexité du système dentaire élaboré (deux types dentaires chez la souris, quatre chez l homme), (3) de l absence de dent à croissance continue chez l être humain (incisive chez la souris), (4) enfin, de la présence de dents temporaires et permanentes chez l être humain et donc d une lame dentaire secondaire comme cela vous l a été décrit dans le cours. 35