Connaissance et Technique du Gène Les Souris transgéniques, knock-out et knock-in

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1 Connaissance et Technique du Gène 2005 Les Souris transgéniques, knock-out et knock-in Trois types d expériences différentes: Les souris transgéniques où l on introduit un gène dans le génome Les souris knock-out où l on efface un gène Les souris knock-in où l on introduit un gène rapporteur Plusieurs différentes stratégies pour répondre aux différentes questions. La génétique et le développement des souris Figure 1: Les statistiques le génome ressemble beaucoup à celui des humains le développement d une souris (fécondation-naissance) se passe en 20 jours possibilité de faire des accouplements à partir de 6 semaines après la naissance la production de plusieurs embryons Petite taille peu chère en ce qui concerne la nourriture Les espèces et les sous-espèces des souris Toutes les souris dans un laboratoire sont soit Mus musculus domesticus soit Mus musculus musculus. Ce sont les sous-espèces. En europe 3 autres sous-espèces: Mus spretus, Mus spicilegus et Mus spretoides On peut faire des croisements entre domesticus et musculus: les autres sousespèces sont génétiquement très loin et les croisements sont difficiles (mais importants) On doit utiliser les lignées de souris inbred afin d éliminer les effets dus au fond génétique: Les lignées inbred se font par au moins vingt croisements entre frère et sœur. Au bout de vingt générations la probabilité que toutes les souris sont identiques avoisine 99% Ces souris sont plus fragiles: les croisements frère-sœur entraînent l homozygotie des mutations récessives. Du coup les portées sont plus petites Les souriceaux sont plus sensibles aux infections Pour limiter ce problème on utilise les zygotes qui sont les hybrides de deux lignées inbred.

2 (C57Bl/6J x CBA/J)F1 femelle x (C57Bl/6JxCBA/J)F1 mâle Embryons F2 sont utilisés. Le développement de la souris Figure 2 et 3 Après 3 jours de développement deux types de cellules sont présents : eux qui vont se développer en tissus de la souris (embryonnaire) ceux qui sont essentiels pour la survie de l embryon (extra embryonnaire) La majorité des cellules en début de développement sont extra embryonnaire L accouplement se passe dans la nuit : les femelles ne s intéressent aux mâles que pendant un temps court. La première division cellulaire après environ 36 heures: pour que toutes les cellules d une souris transgénique contiennent le transgène il faut injecter au plus tard 24 heures après la fécondation. Les étapes expérimentaux pour faire une souris transgénique : Fig 4,5 1. Super Ovulation des femelles: injection de FSH (follicule stimulating hormone) plus (2 jours plus tard) LH (luteinising hormone). 2. Deux femelles injectées sont mises avec un mâle ; normalement on a besoin d au minimum 10 femelles afin d avoir suffisamment d embryons 3. Le lendemain les femelles sont tuées et les ovocytes sont enlevés. 4. Les embryons sont traités avec hyaluronidase ce qui enlève les cellules cumulus qui sont encore autour de l embryon. 5. Les embryons sont mis dans un milieu (M2) 6. Injections 7. Incubation pendant la nuit : les embryons endommagés meurent et les autres devraient se diviser. 8. Les embryons sont réimplantés dans l oviducte d une femelle pseudo gestante: on se sert des mâles vasectomisés. On réimplante 15 embryons chaque côté. 9. Au bout de 20 jours les embryons sont nés. Fig 6 Normalement on n a que des portées de 3 ou 4 souriceaux. Les manipulations rendent les embryons moins viables. Parfois les nouveau-nés transgéniques sont tués par leur mère.

3 Le destin des molécules injectées L ADN doit être linéaire et propre injection de 1-2 picolitres d ADN/1-2 femptogrammes insertion aléatoire dans le génome: souvent plusieurs copies au même site dû à la recombinaison homologue les sites où la chromatine est ouverte sont les sites préférés d intégration intégration sur le chromosome X La détection des souriceaux transgéniques Pour qu un embryon soit transgénique le transgène doit s intégrer dans le génome : 21 jours après la naissance on enlève 1cm de la queue pour tester pour la présence du transgène : Southern blot PCR gène reporteur: B-gal ou GFP Comment faire une différence entre le transgène et le gène endogène? des séquences uniques au transgène : normalement dans la région 3 nontraduit. l introduction d un gène humain dans le souris: possibilité d un site de restriction polymorphique. En plus Il faut vérifier que le transgène est transcrit: RT-PCR la site d intégration du transgène-parfois importante: FISH, lignées des cellules hamster/souris combien de copies sont intégrés: Southern blot l expression de la protéine-tag? Croisement de deux souris hétérozygotes pour le transgène pour produire un homozygote. Possibilité de croiser deux souris qui portent de différents trangènes pour avoir les double transgéniques. Exemples spécifiques 1. L analyse des régions qui contrôlent l expression des gènes: promoteurs les séquences 3 et la régulation de la traduction les sites d épissage

4 2. Sur-expression des protéines: hormone de croissance télomérase myc oncogène 3. La stratégie dominant-negatif: souvent utilisé pour étudier les récepteurs: l expression d une récepteur sans la partie qui signale à l intérieur de la cellule facteurs de transcription qui manquent la domaine d activation 4.L expression ectopique: le gène calcitonine sous contrôle d un promoteur ubiquitaire pour étudier l épissage. 5. Le développement: le gène Sry et le développement mâle l identité des cellules qui sont les précurseurs des tissus. La toxine de diphtérie. 6. Les transgènes inductibles: heat-shock, metallothionein Le développement du Pancréas Comment savoir à quel moment la différenciation du pancréas commence chez l embryon? Utilise le promoteur du gène élastase qui n exprime que dans le pancréas Construire un gène chimère entre le promoteur du gène de l élastase et la partie codante du gène de la toxine de diphtérie La toxine de la diphtérie empêche la fonction du facteur eef-2, essentiel pour la traduction : une molécule peut tuer une cellule In vitro ils ont montré que le transgène ne s exprime que dans les cellules du pancréas. Souris transgéniques : toutes les souris qui expriment le transgène manque de pancréas : elles meurent 3 jours après leurs naissance Si on enlève les embryons avant la naissance on peut voir à quel moment les cellules qui expriment le toxine meurent, le moment où le différenciation du pancréas commence. Des Tumeurs inductibles dans le Foie

5 Avant le développement d un cancer il y a des changements dans une cellule. Si on pourrait identifier ces changements avant le développement d un cancer on pourrait intervenir plus tôt avec les drogues. On fait un transgène : promoteur spécifique pour le foie (C-reactive protein) avec la partie codante du gène SV40 T (oncogénique). On peut induire l expression du promoteur avec une traitement avec des lipopolysaccharides. On fait la souris transgénique et ensuite induire l expression du transgène. On mesure l activité de plusieurs enzymes pour voir des changements qui se font avant qu un tumeur soit visible. Les transgènes dominants-négatifs Beaucoup de récepteurs se composent de deux parties : une partie extra-cellular où se fixe le ligand une partie intra-cellulaire qui fait la signalisation Pour voir qu est-ce qui se passe dans une cellule si on inhibe la signalisation par un récepteur on peut sur-exprimer une forme tronquée du récepteur qui manque la partie intra-cellulaire. Le fibroblast growth facteur est implique dans le développement de l embryon de la souris a un stade précoce. On se sert d un promoteur qui s exprime dans toutes les cellules-pgk phosphoglycerate kinase. On fait le transgène entre le promoteur et la partie extracellulaire du récepteur. Les souris qui expriment le transgène meurent donc le récepteur est important pour le développement. Dans quelle mesure le système souris transgéniques est-il un système in vivo? Dix souris qui portent le même transgène peuvent avoir dix patrons d expression différent: site d intégration différent nombre de copies intégrées dans le génome fond génétique: est-ce que l expression du gène endogène est pareille dans les deux souches utilisées pour faire des transgéniques. Les souris knock-out Figure 7,8 Knock-out: on introduit un gène rapporteur par recombinaison homologue dans un exon pour supprimer l expression d un gène.

6 La recombinaison se fait dans les cellules ES ( embryonic stem). Les cellules ES Cellules pluripotentielles : elles peuvent se différencier en toutes les différentes cellules de la souris adulte. Les cellules ES introduites par injection dans un blastocyste sont capables de se différencier en toutes les différentes types de cellule y compris les cellules germinales : embryons de 3,5 jours de développement sont mis en culture avec des cellules feeder. (une couche de fibroblastes traitées avec la mitomycin : ces cellules produisent des facteurs de croissance etc.) LIF est présent pour empêcher la différentiation des cellules ES. après deux jours c est possible de faire une différence entre les cellules ES et les cellules trophoblastes. les cellules ES sont dissociées avec le trypsine et soit, elles sont congelées soit, elles sont étalées sur les cellules feeder. L ADN introduit par électroporation: cellules ES dans une cuve avec un tampon et l ADN. Le déclenchement d un courant mène à l entrée des molécules dans les cellules. Sélection avec G418; PCR ou Southern blotting pour démontrer la présence du gène neo et la spécificité de la recombinaison. L ADN peut entrer dans le génome par recombinaison homologue ou nonhomologue. Deux possibilités pour identifier des recombinaisons homologues : 1) on fait une deuxième sélection pour faire une distinction entre recombinaison homologue et non-homologue ou 2) on se sert de la PCR afin de sélectionner. Le gène thymidine kinase: les cellules qui expriment ce gène sont sensibles à la drogue gancyclovir. Par recombinaison homologue:cellules résistantes à la G418 et à la gancyclovir Par recombinaison non-homologue les cellules sont tuées par le gancyclovir. Mais la présence du gène TK empêche la recombinaison Pour avoir un taux de recombinaison acceptable: L ADN isolé de la même souche que les cellules ES le taux de recombinaison augmente avec les molécules plus longues (problèmes de sites de restriction uniques et la fragilité des molécules).

7 Pour avoir un vrai knockout: il faut cibler les exons à l extrémité 5 il faut faire la recombinaison afin que le cadre ouvert de lecture soit interrompu: Les cellules où le gène a été ciblé (targeted) peuvent être congelées. L introduction des cellules dans le blastocyst cellules ES identiques sont injectées dans le blastocyst. Les blastocysts sont réimplantés dans une femelle pseudo gestant. Pour transmettre la mutation il faut que les cellules ES contribuent au développement des cellules germinales ce qui n est pas toujours le cas. Analyse des souriceaux par Southern blot: ces souris sont des chimères. Croisement avec un souris sauvage pour voir si la mutation est transmise. Production des souris homozygotes. Exemples spécifiques des souris knock-out Cell 71, MyoD knockout MyoD- basique hélice-loop-hélice protéine: facteur de transcription essentiel pendant le développement du muscle in vivo. La transfection du gène MyoD dans des fibroblastes peut entraîner leurs développements en précurseurs musculaires. MyoD KO: homozygotes sont viables et fertiles. Plusieurs gènes qui sont exprimés spécifiquement dans le lignage musculaire sont encore exprimés. Myf 5-facteur de transcription de la même famille que MyoD sur-exprimé dans les souris MyoD KO. Redondance-grand problème dans l analyse des souris KO. -KO du gène Sry -KO des gènes Hox Les souris knock-in Par recombinaison on introduit un gène, un ADNc ou des séquences spécifiques dans le génome à une site spécifique. Dans les souris KO on interrompt la fonction avec le gène Neo Dans les souris KI on modifie la fonction du gène. Avec la technologie knock-in on peut introduire un transgène dans un site spécifique ce qui élimine les problèmes de site d intégration l identification des séquences importantes dans un promoteur le remplacement d une séquence qui code pour une protéine par une

8 séquence rapporteur-b-gal (gène Met) L importance du gène GFP pour suivre le développement des tissues. Les KO tissus spécifiques Souvent un gène joue un rôle important dans plusieurs tissus: Souvent les souris KO meurent lors du développement et l on ne peut pas étudier le phénotype chez l adulte. Avec la technologie KO impossible d éliminer le gène dans un seul tissu. Le système cre-lox permet aux chercheurs d effacer un gène dans un seul tissu. L enzyme cre est produite par le bactériophage P1 pendant l infection des bactéries. L enzyme reconnaît de courtes séquences nucléidiques, appelées les sites lox et clive l ADN. L introduction par recombinaison homologue des sites lox. Les sites flanquent un exon. Présence des gènes néomycine et TK pour sélectionner. Dans une deuxième souris on introduit par transgénèse le gène cre sous le contrôle d un promoteur tissu spécifique. Les deux lignées sont croisées et les doubles transgéniques sont sélectionnés. Les cellules B produisent les anticorps. Leur développement dépendent de la production d un complexe à la surface de la cellule appelé BCR (B cell receptor) à un stade tôt lors du développement. Des cellules qui n expriment pas BCR meurent par l apoptose. Est-ce que les cellules B qui fonctionnent dans l adulte ont toujours besoin de l expression de BCR pour survivre? On peut empêcher la production du récepteur en faisant une souris KO du gène V des immunoglobulines. Mais l absence du récepteur empêche le développement des cellules B. Une souris avec le gène V flanqué des sites lox est croisée avec une souris qui porte le gène cre sous le contrôle du promoteur Mx spécifique pour les cellules B et inductible par l interféron. On traitant les souris doubles transgénique avec l interféron on peut effacer le gène V et donc empêche la production du récepteur BCR. L absence du récepteur mène à la mort des cellules B qui ne sont pas capables de produire des anticorps. Donc même chez l adulte les cellules B sont surveillées.