ALDO-ELISA Aldosterone
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- Francis Gobeil
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1 Cisbio Bioassays Parc Marcel Boiteux - BP Codolet / France Téléphone : +33 (0) Télécopie : +33 (0) Courrier électronique : iva@cisbio.com ALDO-ELISA Aldosterone Notice d utilisation - FR Référence du document : 01 - Juin NOM ET INDICATION La trousse ALDO-ELISA est un immunodosage enzymatique destiné à la mesure diagnostique quantitative in vitro de l aldostérone dans le sérum et le plasma. 2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION L aldostérone, une hormone stéroïdienne, est un puissant minéralocorticoïde produit par la zone glomérulée de la partie corticale de la glande surrénale. Sa synthèse et sa libération sont contrôlées par le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA), 1 mais également par la concentration plasmatique de potassium, 2 l ACTH, un peptide hypophysaire, ainsi que par la pression artérielle par l intermédiaire de barorécepteurs situés dans la paroi vasculaire de pratiquement toutes les artères de calibre important de l organisme. 3 L aldostérone se lie aux récepteurs des minéralocorticoïdes (RM) et déclenche la transcription de gènes hormonosensibles. Par conséquent, l aldostérone augmente la pression artérielle par la réabsorption du sodium et de l eau présents dans la circulation par les tubes contournés distaux du rein, la sécrétion de potassium dans l urine et l élévation du volume de sang circulant. Une hyperproduction et une sécrétion chroniques d aldostérone provoquent une hypertension. L activité de l aldostérone est réduite dans la maladie d Addison et augmentée dans le syndrome de Conn. La mesure des concentrations d aldostérone dans le sérum, simultanément à celle des concentrations plasmatiques de rénine (rapport 4, 8, 9 aldostérone/rénine ; RAR), peut être utilisée pour différencier une forme primaire ou secondaire d hyperaldostéronisme. Affection Aldostérone sérique Rénine plasmatique Hyperaldostéronisme primaire Élevée Faible Hyperaldostéronisme secondaire Élevée Élevée La mesure de l aldostérone, simultanément à une suppression sélective et des tests de stimulation, peut être utilisée pour différencier de façon plus précise l hyperaldostéronisme primaire en deux types de base. 5 L hyperaldostéronisme primaire provoqué par un adénome d une ou des deux glandes surrénales. L hyperaldostéronisme primaire provoqué par une hyperplasie des glandes surrénales. Cette différenciation est essentielle dans le traitement et la prise en charge de la maladie. Les adénomes surrénaliens répondent de façon satisfaisante à la chirurgie tandis qu une hyperplasie surrénalienne est généralement prise en charge plus efficacement par des mesures médicales. 6 En outre, la modulation pharmacologique des récepteurs nucléaires hormonaux est une stratégie fréquente dans le traitement des maladies cardio-vasculaires. 7 Par conséquent, la détermination des effets de ce type de traitement sur le SRAA prend une importance croissante dans l évaluation de la sécurité d emploi et de l efficacité des nouvelles modalités thérapeutiques. En résumé, le dosage précis et exact de l aldostérone sérique par un immunodosage enzymatique peut constituer un apport important à l arsenal diagnostique biologique destiné au diagnostic différentiel de la maladie hypertensive. 3. PRINCIPE La trousse ALDO-ELISA est un dosage immunoenzymatique (ELISA) basé sur le principe de liaison compétitive. Les puits de microtitrage sont recouverts d un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre un site antigénique de la molécule d aldostérone. L aldostérone endogène présente dans un échantillon de patient entre en compétition avec un conjugué aldostérone-peroxydase de raifort pour la liaison à l anticorps présent sur le revêtement. Après incubation, le conjugué non lié est éliminé par lavage. Après addition de la solution substrat, l intensité de la couleur développée est inversement proportionnelle à la concentration d aldostérone de l échantillon de patient. 1
2 4. RÉACTIFS Chaque trousse contient les réactifs suffisants pour 96 tests. La date de péremption est indiquée sur l étiquette extérieure. RÉACTIFS SYMBOLES QUANTITÉ CONSERVATION MICROPLAQUE : Prête à l emploi barrettes (détachables), 96 puits ; Puits recouverts d un anticorps (polyclonal de lapin) antialdostérone. CALIBRATEURS 0 à 5 : Lyophilisés. Aldostérone synthétique et purifiée et sérum humain. MICROPLATE 1 microplaque (96 puits) Après ouverture, toutes les barrettes inutilisées doivent être conservées pendant 2 mois dans le sac plastique fourni, correctement scellé pg /ml * Reconstituer avec 1 ml d eau désionisée. Laisser reposer pendant au moins 10 minutes. Mélanger plusieurs fois avant utilisation. CAL. 6 flacons qsp 1 ml Après reconstitution, les calibrateurs sont stables pendant huit semaines entre 2 et 8 C. Pour une conservation plus longue, congeler (seulement une fois) à -20 C. CONTRÔLES 1 & 2 (faible & élevé) : Lyophilisés. Aldostérone synthétique et purifiée et sérum humain. Reconstituer avec 1 ml d eau désionisée. Laisser reposer pendant au moins 10 minutes. Mélanger plusieurs fois avant utilisation. CONJUGUÉ : Prêt à l emploi. CONTROL 2 flacons qsp 1 ml Après reconstitution, les contrôles sont stables pendant huit semaines entre 2 et 8 C. Pour une conservation plus longue, congeler (seulement une fois) à -20 C. Aldostérone conjuguée à la peroxydase de raifort. Contient un conservateur non mercurique. CONJ. 1 flacon 20 ml SUBSTRAT : Prêt à l emploi. Tétraméthybenzidine : TMB SUBS.TMB 1 flacon 25 ml SOLUTION D ARRÊT : Prête à l emploi. Contient du H 2SO 4, 0,5 M Éviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et des brûlures cutanées. STOP.SOLN 1 flacon 14 ml SOLUTION DE LAVAGE : Ajouter de l eau désionisée à la Solution de lavage concentrée 40 fois. Diluer 30 ml de Solution de lavage concentrée avec ml d eau désionisée pour obtenir un volume final de ml WASH 1 flacon 30 ml La Solution de lavage diluée est stable pendant deux semaines à température ambiante. FILM ADHÉSIF POUR MICROPLAQUE 2 SACHET PLASTIQUE 1 Les réactifs ouverts doivent être conservés entre 2 et 8 C. Les trousses ouvertes gardent leur activité pendant deux mois si elles sont conservées selon les indications ci-dessus. * Conversion : 1 pg/ml correspond à 2,77 pm/l. Remarque : Un calibrateur 0 supplémentaire pour la dilution des échantillons est disponible sur demande. 5. PRÉCAUTIONS D EMPLOI 5.1. Mesures de sécurité Les matières premières d origine humaine contenues dans les réactifs de cette trousse ont été testées avec des trousses agréées, et se sont avérées négatives pour les anticorps anti-vih 1, anti-vih 2 et anti-vhc et pour l antigène HBs. Cependant, il demeure impossible de garantir de façon stricte que ces produits ne sont pas en mesure de transmettre une hépatique, le virus VIH ou toute autre infection virale. Par conséquent, toutes les matières premières d origine humaine, y compris les échantillons à examiner, doivent être traitées comme potentiellement infectieuses. Ne pas pipetter avec la bouche. Ne pas fumer, ne pas manger ou ne pas boire dans les zones où les échantillons et les réactifs de la trousse sont manipulés. Porter des gants jetables pendant la manipulation des réactifs de la trousse ou des échantillons et se laver les mains avec soin ensuite. Éviter toute éclaboussure. Décontaminer et éliminer les échantillons et tous les matériels potentiellement contaminés comme s ils contenaient des agents infectieux. La meilleure méthode de décontamination est un passage à l autoclave pendant au minimum une heure à 121,5 C. Éviter le contact avec la Solution d arrêt qui contient de l H 2SO 4 0,5 M. Elle peut provoquer des irritations et des brûlures cutanées. Certains réactifs contiennent du Proclin 300, du BND et/ou du MIT comme conservateurs. En cas de contact avec les yeux ou la peau, rincer immédiatement à l eau. Le substrat TMB exerce un effet irritant sur la peau et les muqueuses. En cas de contact éventuel, laver les yeux abondamment avec de l eau et laver la peau à l eau et au savon, puis rincer à l eau abondamment. Laver les objets contaminés avant de les réutiliser. En cas d inhalation, amener la personne à l air libre. 2
3 5.2. Précautions d utilisation Ne pas utiliser les composants de la trousse après leur date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Éviter toute contamination microbienne des réactifs et de l eau. Respecter les durées d incubation. 6. PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Le sérum ou le plasma (traité par EDTA, héparine ou citrate) peut être utilisé dans ce dosage. Ne pas utiliser d échantillons hémolysés, ictériques ou lipémiques. Remarque : Des échantillons contenant de l azoture de sodium ne doivent pas être utilisés dans le dosage. 6.1 Prélèvement des échantillons Sérum : Prélever le sang par ponction veineuse (par exemple, Sarstedt Monovette pour le sérum), laisser coaguler et séparer le sérum par centrifugation à température ambiante. Ne pas centrifuger avant coagulation complète. Les patients traités par anticoagulants peuvent nécessiter un temps de coagulation plus important. Plasma : Le sang total doit être prélevé dans des tubes à centrifugation contenant un anticoagulant (par exemple, Sarstedt Monovette avec la préparation de plasma appropriée) et centrifugé immédiatement après le prélèvement. 6.2 Conservation et préparation des échantillons Les échantillons doivent être bouchés et peuvent être conservés jusqu à quatre jours entre 2 et 8 C avant le dosage. Les prélèvements conservés pendant une durée plus longue (jusqu à deux mois) doivent être congelés une seule fois à -20 C avant le dosage. Les échantillons décongelés doivent être retournés plusieurs fois avant d effectuer le test. 6.3 Dilution des échantillons Si, lors d un dosage initial, un échantillon montre une concentration supérieure à celle du calibrateur le plus élevé, les échantillons peuvent être dilués avec le Calibrateur 0 et à nouveau testés en suivant la Procédure du dosage. Remarque : Un calibrateur 0 supplémentaire pour la dilution des échantillons est disponible sur demande. 7. PROCÉDURE DU DOSAGE 7.1. Équipement nécessaire mais non fourni Lecteur de microplaques, capable de mesurer l absorbance à 450 nm (± 10 nm). Micropipettes de précision variable étalonnées. Papier absorbant. Eau distillée ou désionisée. Minuteur. Papier millimétré ou papier semi-logarithmique ou logiciel pour la réduction des données. 7.2 Protocole Tous les réactifs et les échantillons doivent être amenés à température ambiante avant utilisation. Tous les réactifs doivent être mélangés sans former de mousse. Lorsque le test a commencé, toutes les étapes doivent être effectuées sans interruption. Utiliser de nouveaux embouts plastiques jetables de pipettes pour chaque calibrateur, contrôle ou échantillon afin d éviter une contamination croisée. L absorbance est fonction de la durée d incubation et de la température. Avant de commencer le dosage, il est recommandé que tous les réactifs soient prêts, que les bouchons soient retirés, et que tous les puits nécessaires soient placés correctement dans le support, etc. Cela permettra d assurer qu un délai équivalent s écoule pour chaque étape de pipetage sans interruption. En règle générale, la réaction enzymatique est linéairement proportionnelle au temps et à la température. Chaque session doit inclure une courbe d étalonnage. 3
4 PROTOCOLE 1 - Placer un nombre suffisant de barrettes de puits de microtitrage dans le support du cadre. 50 µl CAL ou CONTROL ou Échantillons 2 - Distribuer 50 µl du Calibrateur, du Contrôle et des échantillons avec de nouveaux embouts jetables dans les puits appropriés. 3 - Distribuer 150 µl de conjugué enzymatique dans chaque puits. Mélanger soigneusement pendant 10 secondes. Il est important d effectuer un mélange complet lors de cette étape. 150 µl CONJ 4 - Mettre en incubation pendant 60 minutes (+/- 10 mn) à température ambiante. 5 - Vider brusquement le contenu des puits en les secouant. Rincer les puits. 5 fois avec 400 µl de Solution de lavage diluée par puits (si un laveur de plaques est utilisé) - ou 5 fois avec 300 µl par puits pour un lavage manuel. Frapper les puits fortement sur du papier absorbant pour éliminer toutes les gouttelettes résiduelles. Remarque importante : La sensibilité et la précision de ce dosage sont fortement influencées par la réalisation correcte de la procédure de lavage. 6 - Ajouter 200 µl de Solution substrat à chaque puits. 60 mn à température ambiante Laver 5 fois avec 400 µl de solution de lavage 200 µl SUBS TMB 7 - Mettre en incubation pendant 30 minutes (+/- 5 mn) à température ambiante. 8 - Interrompre la réaction enzymatique en ajoutant 100 µl de Solution d arrêt dans chaque puits. 30 mn à température ambiante 100 µl STOP SOLN 9 - Déterminer l absorbance (DO) de chaque puits à 450 ± 10 nm avec un lecteur de plaques de microtitrage. Il est recommandé que les puits soient lus dans les 10 minutes après l ajout de la Solution d arrêt. Lecture de l absorbance à 450 nm 450 nm 4
5 DIAGRAMME DU DOSAGE DURÉE TOTALE D INCUBATION = 1 h 30 Puits Test CONJ SUBS.TMB STOP.SOLN 50 µl 150 µl Mettre en incubation 200 µl 100 µl Calibrateurs 60 mn (± 10 mn) Mettre en incubation 30 mn 50 µl 150 µl Laver 5 avec 200 µl (± 5 mn) 100 µl Contrôles 400 µl de Solution de lavage diluée à température ambiante Échantillons 50 µl 150 µl et aspirer 200 µl 100 µl Lire la DO à 450 nm dans les 10 mn 8. CONTRÔLE QUALITÉ Les Bonnes pratiques de laboratoire (BPL) exigent que des échantillons de contrôle qualité soient utilisés dans chaque série de dosages afin de vérifier la qualité des résultats obtenus. Tous les échantillons doivent être traités de manière identique, et il est recommandé d analyser les résultats avec les méthodes statistiques appropriées. 9. CALCUL DES RÉSULTATS 1- Calculer les valeurs moyennes de l absorbance pour chaque ensemble de calibrateurs, de contrôles et d échantillons de patients. 2- En utilisant un papier millimétré ou un papier semi-logarithmique, construire une courbe standard en inscrivant l absorbance moyenne obtenue pour chaque calibrateur en fonction de sa concentration, la valeur de l absorbance étant placée sur l axe vertical (ordonnées, Y) et la concentration sur l axe horizontal (abscisses, X). 3- En utilisant la valeur moyenne de l absorbance pour chaque échantillon, déterminer la concentration correspondante à partir de la courbe d étalonnage. 4- Méthode automatique : Les résultats indiqués dans le mode d emploi ont été calculés automatiquement en utilisant un ajustement de courbe 4 PL (logistique à quatre paramètres). L ajustement logistique à quatre paramètres est la méthode recommandée. D autres fonctions de réduction des données peuvent donner des résultats légèrement différents. 5- La concentration des échantillons de sérum ou de plasma peut être lue directement à partir de cette courbe d étalonnage. 6- Les échantillons dont les concentrations sont supérieures à celles du calibrateur le plus élevé doivent être à nouveau dilués ou indiqués comme présentant une concentration > pg/ml. Pour le calcul des concentrations, ce facteur de dilution doit également être pris en compte. Exemple de courbe d étalonnage typique Les données suivantes sont fournies exclusivement à titre indicatif et ne peuvent pas être utilisées à la place des données obtenues lors du dosage. Calibrateur Unités optiques (450 nm) Concentration pg/ml 2,5 Courbe d'étalonnage de l'aldostérone CAL 0 (0 pg/ml) 2,11 CAL 1 (20 pg/ml) 1,90 CAL 2 (80 pg/ml) 1,55 CAL 3 (200 pg/ml) 1, DO 450 nm 2,0 1,5 1,0 CAL 4 (500 pg/ml) 0, ,5 CAL 5 (1 000 pg/ml) 0,54 Contrôle 1 Contrôle , , Aldostérone pg/ml 5
6 10. VALEURS ATTENDUES Il est fortement recommandé que chaque laboratoire détermine ses propres valeurs normales et anormales. Dans une étude menée sur des échantillons de sérums prélevés chez des adultes normaux apparemment sains, l utilisation de la trousse ALDO-ELISA a permis d obtenir les résultats suivants : Adultes sains Sexe n Moyenne (pg/ml) Médiane (pg/ml) 5 e percentile (pg/ml) 95 e percentile (pg/ml) Décubitus Debout Femmes 16 49,6 40,9 15,6 124 Hommes 44 67,6 49,5 22,2 197 Femmes 16 55,1 49,3 19,8 145 Hommes 44 73,8 53,9 24,3 179 Ces résultats correspondent de manière satisfaisante avec les intervalles de référence publiés. 8, 9 Les décisions thérapeutiques ne doivent pas être basées uniquement sur les résultats obtenus. Les résultats doivent être corrélés avec les observations cliniques et d autres tests diagnostiques. 11. PERFORMANCES 11.1 Intervalle dynamique du dosage L intervalle du dosage est compris entre 5,7 pg/ml et pg/ml Spécificité des anticorps (réactivité croisée) Les réactions croisées de l anticorps polyclonal utilisé dans le dosage avec les substances ci-dessous sont les suivantes : 3 β, 5 α tétrahydroaldostérone : 17,2 % 3 β, 5 β tétrahydroaldostérone : 0,12 % Prednisolone : 0,017 % Cortisol : < 0,003 % 11-désoxycortisol : < 0,003 % Progestérone : < 0,003 % Testostérone : < 0,002 % Androstènedione : < 0,002 % 17-hydroxyprogestérone : < 0,003 % Prednisone : < 0,002 % 11.3 Sensibilité La sensibilité analytique de la trousse ALDO-ELISA a été calculée en soustrayant deux écarts types de la moyenne de 20 analyses du Calibrateur 0 (CAL0), et a été d une valeur inférieure à 5,7 pg/ml Précision Intradosage La variation intradosage (intrasérielle) a été déterminée par 20 mesures de 3 échantillons (sérum, plasma EDTA, plasma hépariné) couvrant l intervalle de mesure complet de la courbe d étalonnage. Variation intrasérielle Échantillon n Moyenne (pg/ml) CV (%) Sérum ,7 Plasma EDTA ,4 Plasma hépariné ,6 6
7 Interdosage La variation interdosage (intersérielle) a été déterminée en utilisant trois échantillons (sérum, plasma EDTA et plasma hépariné) mesurées lors de 20 sessions indépendantes avec deux déterminations par session. Variation intersérielle Échantillon n Moyenne (pg/ml) CV (%) Sérum ,9 Plasma EDTA ,6 Plasma hépariné , Récupération Trois échantillons de sérums ont été surchargés par des solutions d aldostérone de concentrations connues selon une proportion de 1:1. Le pourcentage de récupération de l aldostérone obtenu dans les échantillons a été compris entre 92 % et 115 %. Échantillon Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Concentration (pg/ml) Récupération moyenne (%) Intervalle de récupération (%) de à Linéarité Trois échantillons de sérums d origines différentes (sérum, plasma EDTA, plasma hépariné) présentant des concentrations élevées ont été dilués en série avec le calibrateur 0. Le pourcentage de récupération a été compris entre 86 % et 104 % en fonction des échantillons. Échantillon Sérum Plasma EDTA Plasma hépariné Concentration (pg/ml) Récupération moyenne (%) Intervalle de récupération (%) de à LIMITATIONS D UTILISATION Des résultats fiables et reproductibles pourront être obtenus si la procédure de dosage est effectuée dans le cadre d une parfaite compréhension des instructions de la notice et du respect des Bonnes pratiques de laboratoire. Toute manipulation incorrecte des échantillons ou toute modification de ce test peut influencer les résultats Substances susceptibles d interférer avec le test L hémoglobine (jusqu à 4 mg/ml), la bilirubine (jusqu à 0,125 mg/ml) et les triglycérides (jusqu à 30 mg/ml) n ont pas eu d influence sur les résultats du dosage Interférences médicamenteuses Jusqu à aujourd hui, nous n avons connaissance d aucune substance (médicament) susceptible d avoir une influence sur la mesure de l aldostérone dans un échantillon. 7
8 13. BIBLIOGRAPHIE 1. Brown RD, Strott CA, and Liddle GW. Site of stimulation of Aldosterone biosynthesis by angiotensin and potassium. J Clin Invest. 1972; 51 (6): Bauer JH, Gauntner WC. Effect of potassium chloride on plasma renin activity and plasma aldosterone during sodium restriction in normal man. Kidney Int. 1979; 15 (3): Williams GH, Dluhy RG. Aldosterone biosynthesis. Interrelationship of regulatory factors. Am J Med. 1972; 53 (5): Tiu SC et al. The use of aldosterone-renin ratio as a diagnostic test for primary hyperaldosteronism and its test characteristics under different conditions of blood sampling. J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90 (1): Mulatero P et al. Confirmatory tests in the diagnosis of primary aldosteronism. Horm Metab Res. 2010; 42 (6): Quillo AR. Primary aldosteronism: results of adrenalectomy for nonsingle adenoma. J Am Coll Surg. 2011; 213 (1): Grossmann C and Gekle M. New aspects of rapid aldosterone signaling. Mol Cell Endocrinology. 2009: 308 (1-2): Thomas L (editor). Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). Labor und Diagnose 2005; Perschel FH et al. Rapid Screening test for primary hyperaldosteronism: ratio of plasma aldosterone to renin concentration determined by fully automated chemiluminescence immunoassays. Clin. Chemistry 2004; 50 (9): Funder JW and al. Case detection, Diagnosis, and Treatment of Patients with Primary Aldosteronism: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 2008; 93 (9): Corbin and al. Active renin mass concentration to determine aldosterone-to-renin ratio in screening for primary aldosteronism. Int J of Nephr and renovac disease. (2011), 4:
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