Principes et application des techniques t d Hybridation. Fluorescente (FISH) en Anatomie-Pathologie

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1 DES Patho moléculaire 2011 Principes et application des techniques t d Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) en Anatomie-Pathologie Christiane Copie-Bergman, Département de Pathologie, CHU Henri Mondor, UPEC, INSERM U955, Créteil, France

2 PLAN I. Introduction- Historique-Définitions II. La technique de FISH III. Applications

3 I- Introduction Rappel historique 19th siècle premières images des chromosomes humains (Hansemann et al) er caryotype: 46 chromosomes (Levan et al) 1960 Chromosome de Philadelphie et Leucémie myéloïde chronique (Nowell et Hungerford) Chromosomes banding: fluorochromes remplacé par la suite par le Giemsa (bandes G et R) ere hybridation in situ ADN-ARN* = cytogénétique moléculaire (Joe Gall et Mary Lou Pardue) développement des techniques de détection: d abord radioactive, fluorescence indirecte (1977), puis couplage direct ARN/ADN à un fluorochrome (1986) 1990 FISH, RT-PCR, CGH, CGH array 2000 Puces à ADN «microarrays, transcriptome, bioinformatique.

4 Définitions Sarma & Reinberg Nat Rev Mol Cell Biol 2005

5 Définitions Cytogénétique tique conventionnelle Caryotype permettant une vision globale de l ensemble des chromosomes résolution de 10 7 pb (culture divisions cellulaires blocage en métaphase étalement sur lames dénaturation coloration bandes spécifiques de chaque chromosome) Cytogénétique tique moléculaire techniques d hybridation in situ en fluorescence (FISH) résolution de 50kb-2Mb métaphase Noyaux interphasiques

6 II-La technique de FISH en Anatomie Pathologie Principe Échantillons Sondes Méthode Visualisation

7 Principes de la cytogénétique tique moléculaire en Anatomie-Pathologie o Cytogénétique interphasique: une analyse cytogénétique par hybridation in situ sur noyaux non mitotiques avec des sondes ADN spécifiques de chromosomes o Propriétés d hybridation de l ADN (séquences nucléotidiques complémentaires) o Révélation du complexe sonde-cible, à l aide de sondes fluorescentes (FISH), ou chromogéniques (CISH) ou métallographiques (SISH)

8 PRINCIPE SONDE CIBLE ADN marqué ADN Noyaux A T T C C ADN simple brin Dénaturation Thermique Hybridation spécifique T A A G G ADN simple brin Observation au microscope

9 Principe de l hybridation l in situ Speicher et al, Nature review genetics 2005

10 MATERIEL/ECHANTILLONS TISSULAIRES Empreintes tissulaires tissu frais ou congelé Suspensions de noyaux - tissus frais - tissus congelés - tissus fixés et inclus en paraffine Coupes tissulaires Coupes tissulaires - congelées - tissus fixés et inclus en paraffine

11 Sondes utilisées pour la technique de FISH

12 Sondes commercialisées Directement couplées à un fluorochrome (CY3,TR,FITC) ou marquées à la biotine ou digoxygénine (+2ème couche) 1- Sondes satellites: CEPs («Chromosome enumeration probes») Sondes DNA de séquences hautement répétées. 2- Sondes spécifiques d'un locus: LSI («Locus specific identifier») Détection d anomalies chromosomiques de «nombre» ou de structure: délétion, inversion, duplication, isochromosome, translocation chromosomiques

13 Sondes «maison» -Sondes cosmidiques ou BAC Une séquence précise complémentaire d'un gène d intérêt, est insérée dans un fragment d'adn circulaire bactérien ou cosmide. Réplication en grand nombre dans des bactéries. Lyse des bactéries Extraction d ADN PCR du fragment d intérêt Contrôle de la taille sur gel. Marquage par «Nick Translation» Contrôles de la spécificité sur chromosomes métaphasiques

14 Sonde marquée

15 Sondes Fusion Point de cassure Gène A Gène B Point de cassure Principe 2 sondes marquées de couleurs différentes qui s hybrident à leur locus respectif A et B situés sur 2 chromosomes différents Permet de connaître le gène partenaire Ventura et al,journal of Molecular Diagnoics 2006 intérêt: détection de translocations chromosomiques

16 Sondes split-signal ou break-apart Gene A breakpoint region Principe: 2 sondes marquées (couleurs #) qui flanquent la région des points de cassure du gène d intérêt Détection de translocations Indépendant du gène partenaire Interprétation plus facile +++: - diminue le risque de signaux «fauxpositifs» - lecture plus facile Ventura et al,journal of Molecular Diagnoics 2006

17 Méthode J1 - préparation des lames (3µm) déparaffinage prétraitement - digestion pepsine : 10 minutes - hybridation avec les sondes DNA dénaturation 5min 82 C, hybridation 14-20h 45 C J2 Lavages stringents, déshydratation, montage Lecture en double aveugle Acquisition d images J Hematopathol 2008, 1:

18 J1 Méthode 1. Déparaffinage - 3x5mn dans des bains de Xylène pur - réhydratation dans une série décroissante d éthanol - eau courante et lavage (2SSC ou wash du DAKO) 2. Prétraitement (rompre les liaisons covalentes liées à la fixation) - Solution de prétraitement (citrate) au Bain-Marie ou au micro-ondes - lavages 2x3mn à température ambiante 3. Digestion protéolytique (favoriser l'accès de la sonde au noyau) - Pepsine - +/-10mn à 37 C puis arrêt par lavages Conditions à adapter au type d'échantillon Compromis entre préservation du tissus et pénétration de la sonde

19 J1 Méthode Début de la technique pour empreintes et cytospins 4. Déshydratation (éviter une dilution de la sonde) - Bains d alcool croissants - Séchage 20 à l air 5. Application de la sonde - Décongeler quelques minutes - déposer 10 µl par lame - Poser une lamelle 22X22 - Sceller à la colle autour de la lamelle 6. Co-dénaturation et hybridation noyaux cibles et sondes sont dénaturés ensemble - Ex : 5 minutes à 82 C (conditions selon sonde) - Hybridation 15 à 20h à 37 ou 45 C sur plaque chauffante ou étuve ou hybridizer.

20 J2 Méthode 7. Lavages stringents ( Eliminer les hybridations non spécifiques) Augmenter la température et le % de formamide du bain ou Diminuer la concentration en sels favorisent la stringence 0,4SSC 72 C 2 ou 2 SSC/50% formamide 37 C 2X5 8. Déshydratation - dans des bains d alcool croissants -séchage rapide à l air 9. Montage en DAPI+ «anti-fading» -Appliquer10 µl de milieu -Recouvrir d une grande lamelle -Stockage à 4 C à l abri de la lumière

21 DETECTION DU COMPLEXE SONDE-GENE CIBLE Par Immunofluorescence directe ou indirecte Sonde couplée à un fluorochrome Sonde-DIG + anti-dig/fitc

22 FISH double couleur Sondes CEN 17 et HER2: amplification de HER2 Certif Patho Mol 2011

23 FISH Multi-couleurs Halling et al, Human Path 2007

24 C.I.S.H. Chromogenic In Situ Hybridization Technique indirecte http.hgv.org.au

25 C.I.S.H Sonde HER2 biotinylée +Streptavidine/Per +DAB Pas d'amplification du gène amplification HER2 >10 spots amplification HER2 avec des clusters

26 CISH double couleurs

27 Silver In Situ Hybridization Technique indirecte S.I.S.H Tissu sain : 2 signaux par noyaux Powell et al, Human Path 2007 Tumeur : amplification du gène HER2

28 Double marquage du gène g HER2 par S.I.S.H et de la protéine HER2 par immunohistochimie (IHC) SISH: Amplification du gène HER2 : «points noirs» dans les noyaux IHC: surexpression membranaire de la protéine HER2: marquage rouge de la membrane des cellules tumorales Powell et al, Human Pathol, 2007

29 FICTION Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation of Neoplasms Sonde fusion t(11;14) IHC Mib1 (bleu) Ventura et al, J Mol Diagn

30 Lecture des lames Equipement microscope à fluorescence équipé d une caméra et logiciel d acquisition et de traitement d images Lecture étape préanalytique: analyse de la lame HES +++ (qualité de la coupe, nécrose. et pourcentage de cellules tumorales (anti-cd20 par exemple) Contrôle qualité de la technique: aspect des noyaux au dapi)/intensité du signal/ bruit de fond lecture «en double aveugle»

31 Analyse automatisée e des signaux FISH sur coupes FFPE Logiciel Visilog 6.5 NOESIS Rearrangement du gène c-myc

32 APPLICATIONS Maladies génétiques acquises Cancérologie

33 I. Anomalies chromosomiques: de nombre ou amplification d un d oncogène ne Quelques exemples Cancer du sein+++ recherche d une amplification de l oncogène HER2 Tumeurs de vessie - monosomie du 9p21 (Tr papillaire de bas grade) - polysomies 3, 7 (Tr de haut grade) Lymphome de la zone marginale de type MALT Trisomie 3, 18

34 Facteurs pronostiques biologiques et moléculaires des cancers du sein STATUT HER2 - Oncogène HER-2 (c-erbb-2) (Human epidermal growth factor receptor 2) membre d une famille de gènes codant pour des récepteurs transmembranaires de facteurs de croissance (EGFR, HER2, HER3, HER4) - code pour une glycoprotéine transmembranaire dont la partie intra cytoplasmique possède une activité tyrosine kinase rôle dans la croissance et différenciation cellulaire % des cancers mammaires infiltrants sont HER2+

35 Récepteurs ERBB et signalisation Hynes et al, Nature Review Cancer 2005

36 La surexpression de la protéine HER2 par les cellules tumorales - marqueur d agressivité: les cancers HER2+ ont un pronostic plus péjoratif que les cancers du sein HER2- (tumeurs de haut grade, métastases ganglionnaires, résistance à certains types de chimiothérapie, récidive.) - cible thérapeutique: Trastuzumab (Herceptin ) (anticorps monoclonal humanisé) ciblant spécifiquement les cellules surexprimant la protéine HER2 Hynes et al, Nature Review Cancer 2005

37 Détection de la surexpression du gène g HER2 dans les cellules tumorales FISH/CISH Immunohistochimie - l expression de la protéine HER2 est corrélée à l amplification du gène HER2 - Détection par immunohistochimie +/- FISH, CISH

38 Détermination du statut HER2 par immunohistochimie 4 scores semi quantitatifs de marquage selon le nombre de cellules marquées et le caractère continu ou non du marquage membranaire HES Protéine HER2 Sein normal: score 0 Carcinome: score 1 Carcinome: score 2 l amplification doit être prouvée par FISH/CISH Carcinome: score 3

39 Détermination du statut HER2 par FISH interphasique: Hybridation In Situ Fluorescente Le gène HER2 est situé sur le chromosome 17 (17q12) -Sonde centromérique CEN-17 (FITC): permet de compter le nombre de chromosome 17 par noyaux - Sonde HER2 (Texas Red): permet de détecter le nombre de copies du gène HER2 par cellules tumorales

40 FISH double couleur CEN 17 et HER2

41 3 échantillons tumoraux 1 Détermination du statut HER2 par CISH: Hybridation In Situ Chromogénique Profil normal 2 copies HER2 (rouge) et 2 centromères CEN17 (bleu) par noyau Profil intermédiaire 2 2 à 6 copies HER2 par noyau mais rapport HER2/CEN 17<2,2 (comptage sur 40 noyaux) = pas de véritable amplification 3 Amplification sous forme de «clusters» Lame Duo CISH HER2

42 Wolff, JCO 2007

43 II. Anomalies chromosomiques de structure Délétions (del) 17p13 (locus du gène P53) dans les tumeurs du sein Inversions (inv) 2 cassures suivies d un recollement après inversion du segment chromosomique délétion Duplications (dup) duplication d un segment au sein d un même chromosome duplication

44 Anomalies chromosomiques de structure Isochromosomes 2 bras identiques aux 2 extrémités (2 courts ou 2 longs) isochromosome Translocations (t) chromosomiques définition=cassure et déplacement d un fragment de chromosome sur un autre chromosome - «spécifiques» de certaines tumeurs - «marqueur» diagnostique et évolutif - exemples: lymphomes - # méthodes de détection dont la FISH translocations réciproque

45 Exemple d applications d en hématologieh

46 Lymphome nouveaux cas/an en France Atteinte privilégiée des organes hématopoïétiques Hétérogénéité histologique d importance clinique et thérapeutique Tumeurs chimiosensibles (globalement 50% de guérison)

47 Classification OMS des hémopathies h lymphoïdes Blood 2008, 112 p4384 environ ~90 entités s différentes parmi les hémopathies h matures et immatures chaque entité est définie d à partir de ses caractéristiques ristiques cliniques, morphologiques, moléculaires et cytogénétiques tiques.

48 Classification OMS des hémopathies h lymphoïdes 3 catégories essentielles Lymphomes de Hodgkin Lymphomes B Lymphomes T/NK lymphomes non-hodgkiniens Au sein des lymphomes B et T/NK - lymphomes immatures stades précoces de la différenciation - lymphomes «périphériques» ou matures stades plus avancés de la différenciation Pour chaque entité définition de la cellule d origine ou contrepartie normale reposant essentiellement sur le stade de différenciation de la cellule tumorale

49 Répartition des lymphomes non Hodgkiniens LNH B de la zone marginale 3% LNH B zone marginale du MALT 8% LNH B folliculaire 22% autres 6% LNH B type LLC 8% LNH anaplasique T/nul 2% LNH B à cellules du manteau 6% Lymphomes T périphériques 7% LNH lymphoblastique 2% LNH B de Burkitt 1% Lymphome Diffus à grandes cellules B 35%

50 Outils diagnostiques PRELEVEMENT De bonne taille +++ Fixation au FORMOL Frais pour CONGELATION + ETUDE CYTOGENETIQUE +/- CMF ANALYSE MORPHOLOGIQUE HES, Giemsa IMMUNOHISTOCHIMIE/CMF MOLECULAIRES PCR, RT-PCR, PCR-Q Hybridation in situ Cyclin D1 CYTOGENETIQUE Conventionnelle et moléculaire FISH interphasique

51 Translocations chromosomiques et lymphomes Lymphome translocation récurrente Gènes Burkitt Folliculaire t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(p12;q24) t(8;22)(q24;q11) t(14;18)(q32;q21) t(3;14)(q27;q32) MYC/IGH IGK/MYC MYC/IGL BCL2/IGH BCL6/IGH Manteau t(11;14)(q13;q32) CCND1/IGH Lymphome Diffus à grandes cellules B (LDGCB) Marginal zone (MALT type) t(3;14)(q27;q32) t(14;18)(q32;q21) t(8;14)(q24;q32) t(11;18)(q21;q21) t(14;18)(q32;q21) t(1;14)(p22;q32) BCL6/IGH BCL2/IGH MYC/IGH API2/MALT1 IGH/MALT1 BCL10/IGH Anaplasique t(2;5)(p23;q35) NPM/ALK variants

52 Mise en évidence d une d translocation Cytogénétique conventionnelle et moléculaire (FISH) Southern blot PCR ADN FISH interphasique mise en évidence de la conséquence d une translocation: - transcrits: RT-PCR (compétitive, ou quantitative) (ex: transcrit de fusion API2-MLT, Cycline D1) - protéine: IHC (ex: cycline D1, ALK )

53 Etude comparative des différentes techniques de FISH, IHC, PCR et RT-PCR dans le diagnostic des lymphomes du manteau IHC (protéine cyclin D1): 69% RT-PCR (mrna): 77% PCR t(11;14): 37% FISH t(11;14): 97% (pourcentage de cas positifs sur les 35 cas de MCL analysés) Belaud-Rotureau et al, Mod Pathol 2002

54 Sondes ADN split-signal signal Principe: 2 sondes marquées (couleur #) qui flanquent la région du (des) points de cassure Détection de translocations Indépendant du gène partenaire Interprétation plus facile +++: - diminue le risque de signaux «faux-positifs» - lecture plus facile

55 Sondes «split»

56 FISH c-myc Objectif x40 Objectif x40 Apposition ganglionnaire Objectif x40 Zoom

57 BO-C Objectif x40 FISH c-myc Lymphome de Burkitt Objectif x40 Zoom Objectif x40 myélogramme

58 FISH c-myc Lymphome de Burkitt Objectif x40 Zoom Objectif x40 Coupe paraffine Biopsie gastrique fixée au formol

59 Révélation possible par Hybridation In Situ Chromogénique nique: : CISH Masse tumorale intracardiaque chez une femme de 18 ans Histologie: lymphome à grandes cellules Phénotype: CD20+, CD10+, MIB 100%, BCL2- CISH: réarrangement de cmyc absence de réarrangement de BCL2 Diagnostic: Lymphome de Burkitt BCL2 Colocalisation des 2 signaux: absence de réarrangement cmyc 1 signal de fusion + 1 signal bleu et un signal rouge séparés= réarrangement

60 Observation 1 Femme de 39 ans Douleurs abdominales depuis 3 mois Pas d antécédents d ulcère gastrique Examen clinique négatif

61 Endoscopie Janvier 2006 ulcère de l antre de 5x5cm Réalisation de biopsies gastriques fixées en formol, inclues en paraffine et coupe tissulaires de 5µm colorées par l HES (hématéine éosine safran).

62 Histologie (1) HE

63 Histologie (2) HE HE HE HE

64 Caractérisation risation immunohistochimique de la tumeur (1) CD20 BCL2 CD10 CD5

65 Immunohistochimie (2) BCL6 Mib1 EBERs - MUM1 P53

66 Hypothèse diagnostique Lymphome de Burkitt Nécessité d une étude cytogénétique à la recherche d un réarrangement de l oncogène cmyc

67 Cytogénétique tique du lymphome de Burkitt t(8;14)(q24;q32) Probe IGH / MYC Variants : t(2;8)(p11;q24) : 10% t(8;22)(q24;q11) : 15% cmyc (8q24) <-> IgH (14q32), IgK (2p11), IgL (22q11) gain(1q), der13q, 7q FISH interphasique Sondes «split»

68 FISH Interphasique Sonde DNA Split-signal c-myc Mise en évidence d un réarrangement de cmyc c-myc (

69 FISH IGH Mise en évidence d un réarrangement du gène codant pour la chaine lourde des immunoglobulines IGH IGH

70 Conclusion Confirmation du diagnostic de lymphome de Burkitt avec mise en évidence dans les cellules tumorales d une translocation t(8;14)(cmyc-igh) Prise en charge thérapeutique: chimiothérapie : cyclophosphamide, vincristin, prednisone, doxorubicin et methotrexate avec injections intrathécale de methotrexate. Endoscopie de contrôle tous les 6 mois Dernier bilan en mars 2008: en rémission complète

71 Evolution À 3 mois de traitement

72 Conclusions: FISH interphasique sur tissus fixés Avantages Inconvénients Flexibilité Coût Technique très sensible pour détecter des translocations sur tissus fixés d archive. Outil très attractif et efficace en particulier quand une analyse CGC n est pas possible mais peut être complémentaire de la CGC Nécessite un temps non négligeable au microscope à fluorescence pour l analyse des lames Intérêt de la CISH Intérêt de l analyse automatisée

73 Conclusions FISH interphasique avec les autres outils diagnostiques comme la cytogénétique conventionnelle, la CGH, PCR, est importante pour le diagnostic et la prise en charge des patients atteints de lymphomes Permet d identifier certaines entités comme les LF 3q27/BCL6+ ou des entités provisoires définies dans la classification OMS 2008 (BCLu) qui nécessitent d être mieux caractérisées Intérêt pour l identification de facteurs pronostiques dans les LDGCB (réarrangement de CMYC.)

74 Références FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal abnormalities in routine paraffin-embedded tissue Ventura et al, J Mol Diagn: (8) , In situ techniques in diagnostic pathology. Human Pathology: (38) , Detection of three common translocation breakpoints in non-hodgkin s lymphomas by fluorescence in situ hybridization on routine paraffinembedded tissue sections Haralambieva et al, J Pathol: (198) , 2002 Immuno-Fluorescence in situ hybridization Index predicts survival in patients with Diffuse Large B-Cell lymphoma treated with R-CHOP: A GELA study. C Copie-Bergman et al, J Clin Oncol 2009, 27:

75 Fishing is possible!

76 Département de Pathologie, Hôpital Henri Mondor, Créteil Pr Gaulard Pr Zafrani Pr Leroy Pr Allory Maryse Baia Nadine Martin Association pour la Recherche Thérapeutique, Génétique et Immunologique dans les Lymphomes (ARTGIL) PHRC Remerciements