ATTESTATION BIOTECH! Tronc commun!
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- Christophe Dufour
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1 ATTESTATION BIOTECH! Tronc commun! Les méthodes de séparation et d analyses des macromolécules biologiques! Chromatographies & Electrophorèses (la protéomique)! Les méthodes de la biologie moléculaire pour l expression des protéines! Clonage et PCR! Marc de Tapia detapia@unistra.fr 4 et 5 Octobre 2010
2 2-%$3*&$4%*#-')! 1901 Mikhail Tswett invente le terme de chromatographie («khrôma» couleur et «graphö» écrire). Il utilise des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes (tswett est le mot russe pour «couleur») 1931 Edgar Lederer introduit la chromatographie comme instrument d analyse. Il isole bon nombre de substances et détermine leur structure chimique et leur activité biologique Archer Martin et Richard Synge reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur invention de la chromatographie de partage Les premières HPLC font leurs apparitions (utilisation de pompe pour augmenter le débit d élution) Séparation des molécules par leurs différences d interactions avec une phase fixe et une phase mobile'!"#$%&'("))*$&'+'' La phase fixe :',! *%#-#&.%#"$'/0*$'!"##$%&!12"*/34'%35&'6#$4'4$'73.#$&8'"*'&"-#/4'243(9'/4' (.$.-#(*-4&'!'&*36.(4'#)2"3%.$%4',! #-'&4'(394'/4&''(&)%*+&'$(!,#-.!'/")!'4$%34'-4&'2.3%#(*-4&'/*'&*22"3%'4%'-.' &*:&%.$(4';'.$.-<&43'1=.$'/43'>..-&8'2"-.#34&?@'!"#$%&'("))*$&'+'' La phase mobile :!,! -4'!$01*(&''/"#%'&"-*:#-#&43'-.'&*:&%.$(4';'& '4%'/"#%'(#3(*-43'4$%34'-4&' 2.3%#(*-4&'/*'&*22"3%'"*'-4&')#(3"(.$.-#(*-4&',! #-'&4'(394'/4&''(&)%*+&'$(!,#-.!'/")!'4$%34'-4'!$01*(&''4%'-.'&*:&%.$(4';'.$.-<&43'1=.$'/43'>..-&8'2"-.#34&?@'
3 Les chromatographies *%#-#&4$%'-4&'23"23#9%9&'7-":.-4&'/0#$%43.(%#"$&'/4&'23"%9#$4&'' ' ' ' ' A'4$("):34)4$%&'4%'%.#--4&' ''!"#$%&'$(#&)"*+,-6.701*$/82*9901*$/' A'#$%43.(%#"$&'&29(#6#B*4&'.=4('*$'-#7.$/' ''!"#$%&'$(#&)"*+,23&99*/*':'' *%#-#&4$%'-4&'23"23#9%9&'/0#$%43.(%#"$&'/4&'.(#/4&'.)#$9&' ' ' ' ' A'23"23#9%9&'#"$#B*4&'' '!"#$%&'$(#&)"*+,-."&/(+01+,23*$/1' A'23"23#9%9&'C</3"2C":4&DC</3"2C<-4&' ''!"#$%&'$(#&)"*+,4"&1+,*/5+#1+' Courbe d élution type t 0 : début de l'injection V m : volume mort de la colonne t m : temps mort V e : volume d'élution d'un composé t e : temps de rétention d'un composé V e' : volume d'élution réduit (V e = V e' + V m ) t r' : temps de rétention réduit (t r = t r' + t m ) W b : largeur du pic à la base W h : largeur du pic à mi-hauteur V e (volume d'élution) = d (débit) x t (temps)
4 Vitesse de déplacement des solutés (1) Le pouvoir séparateur d une colonne est fonction des vitesses relatives d élution de chaque soluté. La vitesse de la molécule A est fonction de sa distribution entre les deux phases selon un équilibre (ou coefficient de distribution) K. Un équilibre K A stationnaire <=> A mobile Concentration en soluté dans la phase stationnaire Un coefficient de distribution Concentration en soluté dans la phase mobile Vitesse de déplacement des solutés (2) La séparation sera caractérisée par des temps de passage (ou volumes d élution) sur la colonne. Vitesse linéaire de déplacement du soluté Longueur de la colonne Temps (ou volume) de rétention Vitesse linéaire moyenne de la phase mobile (ou solvant) Longueur de la colonne Temps (ou volume) mort Relation entre vitesse de déplacement et coefficient de distribution V S = Volume de solutés dans la phase stationnaire V M = Volume de solutés dans la phase mobile Débit
5 Vitesse de déplacement des solutés (3) Certains paramètres affectant les vitesses relatives des solutés peuvent être modifiés : - Vitesse linéaire de la phase mobile (débit) - Coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile (composition du solvant) - Coefficient de diffusion du soluté dans la phase stationnaire (distribution) - Diamètre des particules du support (chimie du support) - Epaisseur de la couche liquide sur la phase stationnaire (chimie du support) Les Facteurs de capacité et de sélectivité 1) La capacité k permet de décrire la vitesse de progression dans la colonne Rapport des quantités d un soluté entre phases stationnaire et mobile adjacentes t'r = tr! tm 2) La sélectivité! permet de d estimer à quel point une colonne peut séparer deux solutés.
6 L efficacité d une colonne L efficacité d une colonne dépend du degré d élargissement du pic qui se produit au fur et à mesure de l élution (effet de dilution du dépôt par diffusion). Cet élargissement dépend de la distribution de la substance dans les deux phases. t R grand => pics larges t R petit => pics fins La hauteur L d une colonne définie un nombre de plateau théorique N (nombre de séparations théoriques) ayant chacun une hauteur H (hauteur de colonne qu occupe chaque soluté). L élargissement du pic est minimisé en réduisant la granulométrie du support, le compactage et le diamètre de la colonne. La résolution d une colonne La résolution R S est la mesure quantitative de la capacité à séparer deux substances A et B. t R (A) t R (B) -! Si R S > 1,5 : Séparation complète de A et B -! Si R S = 1,5 : Séparation incomplète de A et B -! Si R S < 1,5 : A et B mal séparés!a!b (! est la largeur de la base du pic)
7 Méthodes d optimisation Pas de règles mais la connaissance des paramètres d une chromatographie permet de jouer et d optimiser la séparation des molécules Modification de la hauteur équivalent à un plateau théorique" " diamètre colonne" " granulométrie du support chromatographique" Modification du facteur de capacité" " "composition de la phase mobile (force ionique, etc )" " "température" " "nature du solvant (polaire ou apolaire)" Modification du facteur de sélectivité" " "composition de la phase mobile (force ionique, etc )" " "température de la colonne (polaire ou apolaire)" " "composition de la phase stationnaire, effets chimiques" L élargissement de la bande de protéine dans la phase mobile est due par les différentes propriétés d interaction et de diffusion des protéines. La résolution augmente avec la longueur de la colonne. La résolution décroît avec les phénomènes de diffusion. Ces derniers peuvent être atténués par le débit et la vitesse de la phase mobile.
8 La sélectivité est un facteur plus important que l efficacité Bonne sélectivité Mauvaise sélectivité Bonne efficacité Bonne efficacité Mauvaise efficacité Mauvaise efficacité Les différentes chromatographies!"#$%&'$(#&)"*+,-6.701*$/82*9901*$/' ' "#$%&'()#'#$*+!#*!*,-..#+/'!"#$%&'$(#&)"*+,-."&/(+01+,23*$/1, ' '"0)&0)-1*1+!-&$-23#+/!!"#$%&'$(#&)"*+,23&99*/*':'' ' "-$*#),%*-&$+!+01%-4-23#+!,5#%!3$!.-6,$7/!!"#$%&'$(#&)"*+,4"&1+,*/5+#1+,;2+,)&#'&(+<,! "0)&0)-1*1+!897)&08&(#+:897)&089.#+/! ' ''
9 EC3").%"73.2C#4'/04F(-*&#"$A/#66*&#"$'1%.)#&')"-9(*-.#34?' Aussi appelé gel filtration: Support de polymères glucidiques (dextran) liés par de l agarose réalisant des pores de tailles définies. Les protéines de grandes tailles migrent rapidement car elles sont exclues des pores alors que les protéines de petites tailles pénètrent les pores du support migrent lentement. La séparation est fonction du volume de la protéine (rayon de Stokes) et de sa capacité à utiliser le volume des pores.
10 A6=> => => D&5,E,, G4'AG"' G%'A'G"' G4'H'4-*%#"$'="-*)4' G"'H'="#/'="-*)4' G%''H'%"%.-'="-*)4' D&5,, F$(,GHI'H,
11 Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent ainsi influencer l élution de la protéine indépendamment de sa masse molaire réelle :! la géométrie :! pour une même masse molaire, une protéine "allongée"» (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire (variation du rayon de Stokes qui influence les forces de frottement).! les modifications post-traductionnelles :! par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géométrie des protéines glycosyléess et les rendent plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.! la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents:! cette présence peut modifier la structure native de la protéine, sa géométrie, sa charge, sa polarité, etc!!"#$%&'$(#&)"*+,:."&/(+01+,23*$/1, Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements ionisables, qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions, au contact d'autres ions provenant d'une solution Echangeurs de Cations: polymères chargés négativement Echangeurs d Anions: polymères chargés positivement L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de charge et de concentration plus élevée. On utilise de petits ions fortement chargés : Cl -, HO -, Na +, H +... ou par variation de ph afin d éliminer les interactions ioniques. La Capacité de rétention d'un échangeur d'ions est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la résine peut échanger par gramme de résine sèche.
12 Résine cationique forte (acide / sodique): Sulfonique: Résine-SO 3 - / H + ou Na + Résine cationique intermédiaire: groupement phospho : Résine-H 2 PO 4 - / H + ou Na + Résine cationique faible: groupement carboxylique: Résine-COO - / H + ou Na + groupement carboxymethyl : Résine-CH 2 -COO - / H + ou Na + Résine cationique très faible: phénolique : Résine-O - / H + ou Na + Résines anioniques faibles: résines à groupements aminés secondaires et primaires. Résines anioniques fortes: résines à groupements aminés quaternaires. résines à groupements aminés tertiaires.
13 Elution par compétition! L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant : cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH 4 + cations divalents : Cd 2 + < Mn 2 + < Mg 2 + < Zn 2 + < Cu 2 + < Ca 2 + l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca 2 + < Al 3 + Elution par variation de ph! Considérons une protéine de pi = 5 : si le ph du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pi de la protéine La protéine est chargée positivement (zone bleue) => il faut utiliser un échangeur de cations si le ph du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pi de la protéine La protéine est chargée négativement (zone rouge) => il faut utiliser un échangeur d'anions.
14 !"#$%&'$(#&)"*+,23&99*/*':, La séparation des protéines est basée sur les interactions spécifiques. Les protéines n ayant pas d affinité pour le ligand sont éliminées lors du lavage. Le ligand est fixé sur un support inerte. L élution de la protéine fixée est réalisée soit par compétition, soit par variation de force ionique soit par variation du ph. Le ligand est fixé par covalence au support inerte par l'intermédiaire d'un bras de fixation ("spacer" en anglais) qui permet l élimination des contraintes stériques. Ce bras doit posséder une réactivité chimique aux deux extrémités bras aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle : - O - CH 2 - CO - NH - (CH 2 ) 6 - NH 2 (spacer long) bras hydrazide : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle : - O - CH 2 - CO - NH - NH 2 (spacer court) bras aminohexylique (ou aminododécylique) succinylée : permet la fixation d'un effecteur à fonction -NH 2 réactive : - O - CH 2 - CO - NH - (CH 2 ) n -NH - CO - CH 2 - CH 2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long)
15 La fixation suit l équilibre de formation du complexe P + L <=> PL E + S <=> ES Ab + Ag <=> Ab-Ag Constante d équilibre K a = (P).(L) / (PL) la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte (agarose -sépharose)!! seule la molécule présentant une affinité forte est retenue (utilisation de tampon de force ionique modérée, de détergents pour éliminer les interactions aspécifiques) L élution est obtenue par déplacement de l équilibre de liaison : * par le ligand libre en concentration élevée (GSH/GST-Ag) * par variation de ph (ProtéineA-Sépharose) * par variation de la force ionique Chromatographie d'adsorption et d absorption à polarité de phase inversée (ou phase reverse) -! basée sur la (ré)partition des solutés entre l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile. La séparation est fondée sur les interactions hydrophobes entre les molécules à séparer et la phase stationnaire. -! le soluté est soumis à une force de rétention (par adsorption) et à une force d'entraînement par la phase mobile. -! l'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.
16 Phase d absorption «normale» Support polaire et très polaire -! Dans un solvant apolaire les solutés sont en interaction avec les support et dans solvant polaire est fortement éluant -! Elution par augmentation de la polarité du solvant Absorption en Phase inverse Support apolaire -! Dans un solvant polaire, les solutés apolaires sont en interaction avec les support et les solutés polaires seront entrainés par la phase mobile -! Elution des solutés retenus sur la colonne est obtenue par augmentation de la polarité du solvant
17 50)+&%$#-$%6!)!!"#/&')"-9(*-.#34' 2I#' J%3*(%*34'"-#7")93#B*4' 2*%&),78'7)(&'&9,78"(),#%$&9'(), 1959 => Davis et Raymond publient simultanément l utilisation du PAG pour séparer les protéines! 1970 => Laemmli publie la séparation des protéines du bactériophage Lamba par PAGE!! => O Farrel : séparation de protéines sous formes de spots individuels par des Gels de polycacrylamide en deux dimensions pour les protéines!!!!1 ère dimension!= ISOELECTROFOCALISATION en fonction du phi!!!2 ème dimension!= CONDITIONS DISSOCIANTES en fonction du PM (SDS)! 1977 => Klose : Application à des extraits cellulaires et à des tissus! 1980 => Utilisations des ampholines (substances amphotères) : Stabilisation des gradients de ph (1 ère dimension) et amélioration de la reproductibilité! 1995 => Développement de la PROTEOMIQUE = Analyse systématique des protéines présentes dans des tissus, cellules ou organes donnés à un moment donné du développement, d un traitement, etc!
18 Principe général de l électrophorèse K#73.%#"$'/4')"-9(*-4&'(C.379&'/.$&'*$'(C.)2&'9-4(%3#B*4 Charge de la molécule Q Champ Electrique X M Vitesse de migration V QX = FV Force d accélération QX Force de frottement F F : fonction de la molécule (encombrement) et du milieu de migration (viscosité) Les supports électrophorétiques VEPWOJ'QXETOPYXOJ'''RS ' ''VZVLMJO'4%'!MTUELUTVKPWO'!LMNOPQOJ''''' ' 'RS ' ''!MTUVELUTVKPWO' Conditions d électrophorèses et choix du critère de séparation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
19 GELS D AGAROSE T/+,%$7:.07+,23&(&#$1+,U,=V>,>>>,2&7'$/, #+9#$*2*11+%+/',!"&Q/+1,23&(&#$1+,."&099:+1, R:(*$/1,+/,2$0L7+,":7*.+, F*:+1,)&#,2+1,."&Q/+1, F*/:&*#+1,,, S+7,23&(&#$1+,50,+/, %*.#$1.$)*+,:7:.'#$/*P0+, Les acides nucléiques sont visualisés sous UV grâce à un colorant phosporescent le bromure d éthidium qui s intercale entre les plateaux de bases
20 GELS DE POLYACRYLAMIDE : En faisant varier la concentration d'acrylamide et de methylène (bis acrylamide), on obtient des mailles très différentes par polymérisation. CH 2 =CH-CO-NH 2 acrylamide (CH 2 =CH-CONH) 2 CH méthylène bis acrylamide W@W84XS-O, W$2*0%,@$2+.Y7,W079&'+,;W@W<,4$7Y&.#Y7&%*2+,S+7,-7+.'#$)"$#+1*1'!"&#(+,/:(&'*5+,!"&Q/+,.&#L$/:+,"Y2#$)"$L+, T4'JWJ'&4'6#F4';'-.'2-*2.3%'/4&'23"%9#$4&'2.3'-0#$%43)9/#.#34' /0#$%43.(%#"$& ' C</3"2C":4& ' ; ' 3.#&"$ ' /0*$4 ' )"-9(*-4 ' /4 ' JW ' 2"*3 ' \ '.(#/4&'.)#$9&@'' ' RS'N"*%4&'-4&'23"%9#$4&'"$%'*$')])4'3.22"3%'(C.374'&*3').&&4'
21 @:)[',2+,73:."&/'*77$/,&5+.,0/+,)*)+''+,!&'"$2+,!05+,23:7+.'#$)"$#J1+, \&%)$/,, 23:7+.'#$)"$#J1+, S+7, X/$2+, \&%)$/,, 23:7+.'#$)"$#J1+, S+7,2:%$07:,+',.$7$#:, C%$&9'()!,+-*%49)!,(94*&'1)3)(&,7),=*D$(,"('=$%3)' K#73.%#"$'4$'6"$(%#"$'/4'-.'%.#--4'' "*'2"#/&')"-9(*-.#34' W.-%"$&' 7D)"-4' K.3B*4*3&' W4')#73.%#"$' ZZ'
22 W9%43)#$.%#"$'/*'!K'/0*$4'23"%9#$4' GELS D ISOFOCALISATION (polyacrylamide) : Première dimension! Séparation des protéines selon la charge ou pi! -! IEF (IsoElectroFocalisation)! -! IPG (Immobilized PH Gradient)! -! NEPHGE(Non Equilibrium PH Gradient Electrophoresis)! Deuxième dimension! Séparation des protéines selon la masse ou PM! SDS PAGE! Les protéines migrent dans les deux dimensions orientées perpendiculairement l une par rapport à l autre! V*7)4$%43'-.'.&)&.*':,2+,1:)&#&'*$/' ' RS'O%*/4'/0*$'73.$/'$"):34'/4')"-9(*-4&'4$'*$4'&4*-4'4F293#4$(4' V*7)4$%43'-.'.&)&.*':,2+,#:1$70'*$/' ' RS'!43)4%%34'-09%*/4'/4'=.3#.%#"$&')#$4*3&'4$%34')"-9(*-4&'/0*$4')])4'6.)#--4'
23 P&"4-4(%3"6"(.-#&.%#"$' V'&"$'2P^'*$4'23"%9#$4';'*$4' (C.374'7-":.-4'$4%%4'R_' X$'73./#4$%'/4'2I'4&%'9%.:-#'2.3' T.'23"%9#$4&')#734$%'%.$%'B*4'&.' (C.374'$04&%'2.&'$*--48'(04&%';'/#34' ;'*$'2I'97.-'.*'2P' IEF : IsoElectroFocalisation! (Immobilisation des protéines et des ampholines à l équilibre)! Ampholines : Molécules amphotères présentes dans le gel qui migreront entre les bornes de ph définies par les solutions d électrophorèse! IPG : Immobilized PH Gradient! (Immobilisation des protéines dans un gradient de ph préformé)! Immobilines : Molécules identiques aux ampholines mais qui sont immobilisées dans le support électrophorétique définissant un gradient de ph fixe et stable! Anode (+)! Cathode (-)! H +! OH -! H 3 PO 4! Ampholines ou Immobilines! NaOH! ph 3! ph 10!
24 NEPHG : Non Equilibrium PH Gradient Electrophoresis! Migration des protéines et des ampholines sans atteinte de l équilibre! Le gradient de ph évlu au cours de la migration! La molécule de pi donné qui a atteint la partie du gel de ph = pi continue de migrer! en suivant le ph! Anode (+)! Cathode (-)! H 3 PO 4! ph 3! Cl -! H +! Ampholines! ph fonction du Tps de migration! OH -! NaOH! +! NaCl! R:107&',230/+,:7+.'#$)"$#J1+,V@' T4&'23"%9#$4&'/4')])4'!K'4%'/4'2P' /#66934$%&'&"$%'&92.394&' C"3#`"$%.-4)4$%@'' T4&'23"%9#$4&'/4')])4'2P'4%'/4'!K' /#66934$%&'&"$%'&92.394&' =43%#(.-4)4$%'
25 pi PM 4.0 ph 8.0 Permet l identification de plusieurs centaines de spots Recherche de spots spécifiques d une condition donnée en fonction de l obtention de l extrait protéique séparé Carte de référence pour une cellule, un tissu ou un complexe protéique donné à un moment donné et/ ou dans des conditions physiologiques définies T.'23"%9")#B*4' a.$b*4&'/4'/"$$94&'#$6"3).%#&94&' E.3%4&':#A/#)4$&&#"$$4--4&'.$$"%94&'' Protéines acides plasmatique
26 Spectrométrie de Masse MALDI-TOF! Matrix Assisted Laser Desorption / Ionozation - Time Of Flight! (1988 Karas & Hillenkamp)! Matrice! +! Molécule! Laser pulse! +! +! M2! M2 +! Détecteur! Ionisation! +! +! M1 +! M1! Durée de vol! Time Of Flight! M2 +! Intensité! M1 +! Ordinateur! M/Z (rapport Masse / Charge)! La MS & l identification des protéines! Identification par les profils de digestion! Gel 2D! Digestion «"in gel"»! par une protéase spécifique! Analyse directe de masse des peptides! Par MALDI-TOF du mélange peptidique! Banques de données de profils de digestion! Identification de profils de digestion peptidique! Identification! des protéines!
27 Bio-Informatique! Branche de l'informatique appliquée à une partie de la biologie : la recherche sur les gènes et les protéines. Création de banques de données utilisant des méthodes de calculs spécifiques. F+1,L&/P0+1,2+,2$//:+1,)#$':$%*P0+1, E"$%#4$$4$%'/4&'#$6"3).%#"$&'":%4$*4&'2.3'Z4-'\W+''! P).74&'/4'74-&'.=4('/4&(3#2%#"$'/4&'23"%9#$4&'#/4$%#6#94&'! 2.3.)5%34&'/4'&2"%&'23"%9#B*4&'12I#'4%'!K?'4$'6"$(%#"$'/4'%#&&*&8'(4--*-4&'!!3"6#-&'/4'/#74&%#"$'4$`<).%#B*4' OF.)2-4&+'J>PJJA\W!VZO8'OEM\WaVJO8'K.#`4A\W!VZO8'J*:\W8' E<.$"\Wa.&48'4%(@' E")2"&94&'/0#).74&'4%'/4'6#(C#43&'%4F%4&'.=4('/4&'-#4$&'#$%43$4%')*-%#2-4&' a.&4&'/4'/"$$94&'/4'23"6#-&'/4'(.3%"73.2c#4'242%#/#b*4' a.&4&'/4'/"$$94&'/4'23"[4%&'/4'34(c43(c4'4$'23"%9")#b*4&''! 1-4=*348'/3"&"8'2-.$%4&8'4%(b?''
28 F+1,L&1+1,2+,2$//:+1,#:9:#+/.:+1, EPO_HUMAN (human plasma)
29 1 protein has been found in the clicked spot (2D-0013ET):General information about the" Entry namedha1_mouse! Primary accession number P24549! Entered in SWISS-2DPAGE inrelease 07, September 1998Last modified inrelease 14, October 2001Name and origin of the protein! DescriptionAldehyde dehydrogenase 1A1 (EC (Aldehyde dehydrogenase, cytosolic) (ALDH class 1) (ALHDII) (ALDH-E1).Gene name(s)aldh1a1 OR ALDH1 OR AHD2 OR AHD-2From Mus musculus (Mouse). [TaxID: c e_]" Taxonomy Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.References[1] #" MAPPING ON GEL. PubMed= ;[QEaP, OF!VJ<, OaP] Sanchez J.-C., Chiappe D., Converset V., Hoogland C., Binz P.-A., Paesano S., Appel R.D., Wang S., Sennitt M., Nolan A., Cawthorne M.A., Hochstrasser D.F.; "The mouse SWISS-2DPAGE database: a tool for proteomics study of diabetes and obesity."; Proteomics 1: (2001). 2D PAGE maps! Liver MAP LOCATIONS: " SPOT \WA cdoo: pi=7.82, Mw=52807 " SPOT \WA cdof: pi=7.29, Mw=52084 " SPOT \WA cdog: pi=7.47, Mw=52228 " SPOT \WA cdot: pi=7.63, Mw=52517 " SPOT \WA cdon: pi=7.08, Mw=52084 " MAPPING: Peptide mass fingerprinting hci. White adipose tissue MAP LOCATIONS: " SPOT \WA cack: pi=7.08, Mw=52138" SPOT \WA ca\t: pi=6.98, Mw=51975" SPOT \WA ca\k: pi=7.35, Mw=52138" MAPPING: MATCHING WITH THE MOUSE LIVER MASTER GEL hci. Brown adipose tissue MAP LOCATIONS: " SPOT \WA c!qo: pi=7.09, Mw=53128" Copyright! Méthodes en biologie moléculaire! Le clonage et la PCR!
30 Vecteurs d expression bactériens G4(%4*3&'/04F234&&#"$':.(%93#4$&'/4'23"%9#$4&'6*&#"$&'
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