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1 Physicochimie «Curie»-UMR 168 CNRS/Institut Curie Analyse structurale de protéines membranaires et de systèmes membranaires par microscopie électronique Chef d équipe : Daniel Lévy I.a. Introduction Le séquençage complet des génomes de différents organismes indique qu'environ 25% des gènes codent pour l'expression de protéines membranaires, en accord avec l importance majeure des protéines membranaires dans la vie cellulaire. Les protéines membranaires sont notamment impliquées dans les échanges transmembranaires d'ions, de solutés et de signaux métaboliques, la détection de signaux extracellulaires, l'association des cellules en tissus, la multi-résistance aux drogues. Elles sont la cible de nombreux agents thérapeutiques et leurs dérèglements la cause de nombreux syndromes. Toutefois, l état des connaissances de ces protéines est très en deçà de celui des protéines cytoplasmiques. Leur caractère amphiphile avec les domaines transmembranaires hydrophobes et extramembranaires hydrophiles, complique toutes les étapes nécessaires à leur étude à un niveau moléculaire, de la surexpression, la solubilisation, la purification, la reconstitution à la cristallisation. Notre équipe s intéresse à la fonction et la structure au niveau moléculaire de protéines membranaires, principalement depuis 2006 de protéines impliquées dans la multirésistance aux drogues (Fig. 1). Après surexpression, les protéines membranaires sont purifiées en détergent et reconstituées dans des protéoliposomes donnant accès à l étude de leur fonction. Leur structure est analysable par microscopie électronique, en particulier par cryo-microscopie électronique. Les informations structurales sont recueillies par deux approches : l analyse de particules isolées (SPA) de protéines purifiées en détergent qui apporte des informations jusqu à ~ 10! de résolution pour des protéines de tailles > 300 kd. En collaboration avec S. Marco (Institut Curie, INSERM U759), nous avons implanté cette approche dans l équipe et obtenu une reconstruction 3D d un complexe photosynthétique membranaire. L autre approche à plus haute résolution est la cristallographie électronique de cristaux 2D. Ceux-ci sont obtenus après reconstitution à haute densité protéique dans une bicouche lipidique des protéines purifiées. Ces deux approches nous ont permis de comprendre la formation de supercomplexes de protéines photosynthétiques qui sont de bons modèles pour aborder les déterminants d organisations supramoléculaire de protéines membranaires en membrane. Cette approche a également permis d analyser BmrA, et BmrC/BmrD, deux transporteurs bactériens de type «MDR», multi-drogues resistance. En parallèle, nous développons de nouvelles approches pour diminuer la quantité de protéines par analyse structurale pour s ouvrir à court terme aux protéines membranaires humaines très peu surexprimées. Enfin, la cryomicroscopie électronique, a permis de caractériser différents systèmes membranaires biomimétiques en collaboration avec différentes équipes de l Institut Curie. L année 2009 aura permis de progresser sur les aspects scientifiques et techniques suivants - Premiers cristaux 2D de BmrC/BmrD, un ABC transporter bactérien constitué de deux sous unités, homologue de l héterodimere humain ABCG5/ABCG8. Ces cristaux ont révélé une association inédite de dimères d hétérodimeres en membrane et démontré une conformation post-hydrolytique similaire de celle rapportée pour les transporteurs ABC homodimeriques. - Premières images de microscopie électronique d ABC transporteurs humains impliqués dans la chemioresistance et purifiés selon une nouvelle stratégie. - Installation et mise au point des conditions d imagerie haute résolution du nouveau microscope électronique FEG d Orsay. Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 1/6

2 Figure 1 : Représentation de l activité de l équipe. Nous travaillons sur la structure et la fonction de protéines membranaires. La fonction est étudiée après purification et reconstitution en proteoliposomes. La structure est étudiée par cryo-microscopie électronique en détergent ou en membrane sous forme de cristaux 2D. II. POINTS FORTS II.a. Super-complexes de protéines membranaires. Les supercomplexes de protéines membranaires sont des assemblages supramoléculaires de protéines capables de fonctionner individuellement et assemblées dans un super-complexe pour augmenter le rendement des réactions catalytiques. Des super-complexes ont été rapportés dans la chaîne respiratoire, la photosynthèse ou la multi-résistance aux drogues. Ce concept récent dans le cas des protéines membranaires est le plus avancé dans la photosynthèse bactérienne, ce qui en fait de bons models pour l étude des super-complexes membranaires. Chez ces bactéries, les éléments essentiels à la transformation de l'énergie lumineuse en énergie chimique sont localisés dans la membrane cytoplasmique (figure 2). L énergie lumineuse est collectée par des antennes (LH2 et LH1) et transmise en cascade au centre réactionnel (RC) où s'effectue une séparation de charges. Le cytochrome bc1 sert alors à entretenir un transfert cyclique d'électrons au travers du RC, via des molécules de quinol qui diffusent latéralement dans la membrane. Ce transfert cyclique d'électrons engendre un gradient électrochimique de protons utilisé par une ATPase de type F1F0 pour synthétiser de l'atp. Chez les souches Rhodobacter, une petite sous unité, pufx, 9 kda, présente dans le core complexe constitué par LH1 entourant le RC, LH1-RC, induit sa dimérisation et la formation d un super-complexe, 580 kda, avec des caractéristiques fonctionnelles spécifiques. Une étude structurale comparative de core complexes de différentes souches Rhodobacter par analyse de cristaux 2D et par analyse de particules isolées, nous a permis de comprendre le rôle de PufX dans la structuration Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 2/6

3 d un super-complexe dimerique, la biosynthèse des complexes et déformation tubulaires des membranes natives (Busselez et al., 2007; Gubellini et al., 2006; Scheuring et al., 2005 ; Scheuring et al., 2004b). Notre modèle de formation de supercomplexes, âprement discuté ces dernières années, a été confirmé en 2009 par des approches de modélisation moléculaire (Hsin et al., 2009). Figure 2 : Panel A : Représentation de l appareil photosynthétique bactérien. Panel B : (1) Reconstruction 3D par cryomicroscopie électronique du core complexe de Rb. Velkampii qui contient la sous-unité PufX mais est monomérique (coll. N. Boisset, IMPMC). (2) Carte de projection de cristaux 2D du core complexe dimérique ouvert de Rb. sphaeroides avec l organisation des sous-unités dont une paire de PufX associant les deux monoméres. Panel C : (1, 2) Membranes tubulaires de Rb. sphaeroides contenant les dimeres de core complexes. (3) Modèle de dimeres de PufX maintenu par un motif GXXXG présent chez Rb. sphaeroides cohérent avec la dimérisation de core complexes induites par PufX, alors que chez Rb. velkampii, ce motif est absent. (5) L angle induit par la paire de dimere de PufX génère la formation d un core complexe dimérique convexe, qui courbe la membrane native et conduit à la formation de tubes membranaire. Panel D : Représentation schématique de l assemblage du core complexe lors de la biosynthèse des sous-unités. Chez Rb. sphaeroides, PufX est la premiere sous unité synthétisée. Après dimérisation de PufX, les sous-unités! et " sont assemblées paires par paires, conduisant à des antennes LH1 de courbures opposées, qui ne peuvent se refermer pour des raisons stériques. Une ouverture est générée permettant le passage rapide des quinones vers le cyt. bc1. Chez Rb. velkampii, PufX ne dimerise pas, les sousunités! et " sont assemblées jusqu à la fermeture de l antenne LH1. II.b.Transporteurs ABC et MDR (Post-doctorants : Francesca Gubellini , Manuela Dezi, 2008-, PF. Fribourg, Thèse) (coll. J.M.Jault, IBS, Grenoble, A. Di Pietro, IBCP, Lyon) Depuis 2006, notre activité s est tournée principalement sur l analyse structurale de transporteurs membranaires appartenant à la famille des ABC transporteurs. Ces transporteurs ABC utilisent l hydrolyse d ATP pour le transport d une variété immense de substrats, lipides, stéroides, métaux lourds, antibiotiques etc... Certains ABC transporteurs dits MDR confèrent un phénotype ubiquitaire de résistance aux drogues, des bactéries pour la résistance aux antibiotiques, des plantes pour les herbicides, à l homme pour l élimination de drogues anticancéreuses. Malgré l abondance de données fonctionnelles du niveau moléculaire à cellulaire, la compréhension et la spécificité du transport de drogues est limitée par la disponibilité de données structurales. Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 3/6

4 Nous avons commencé à mettre en place les conditions de purification et d analyse structurale de transporteurs MDR bactériens et de certains MDR humains. Figure 3 : Représentation schématique des transporteurs ABC qui utilisent l hydrolyse d ATP pour l efflux de substrats. Trois ABC transporteurs humains sont présents dans les cellules tumorales et sont impliquées dans l efflux et la multi-resistance (MDR) aux drogues utilisées en chimiothérapie. Nous travaillons sur les homologues bactériens MDR et sur certains transporteurs humains MDR. Etude structurale du transporteur MDR bactérien BmrA (coll. S.Marco, Institut Curie, Orsay, J.M.Jault, IBS, Grenoble). Conformation dimérique «ouverte» en absence de nucléotide avec une forme «conique» de la protéine conduisant à la formation de structure tubulaire membranaire après reconstitution. (B) En présence de nucléotide, les membranes tubulaires sont transformées en membranes planes cristaux 2D de BmrA. Carte de projection de BmrA en conformation «outside open» après fixation/ hydrolyse d ATP et de drogues. Au centre, modèle du cycle catalytique du transport de drogues proposé pour BmrA. Nous travaillons avec BmrA et différents mutants, en présence de nucléotides, substrats et inhibiteurs (figure 3). Nous avons obtenu des cristaux 2D des formes pré- et post-hydrolytiques montrant une organisation homodimérique du transporteur et une conformation dite fermée des groupes catalytiques «NBD». En absence de nucléotide, une reconstruction 3D en particules isolées, révèle une conformation «ouverte» (coll. S. Marco, Institut Curie, INSERM U759). Cet ensemble permet de proposer un mécanisme de transport de drogues impliquant un changement conformationnel important des NBD puis transmis au niveau transmembranaire, qui serait l étape clé de la translocation de substrats (Orelle et al., 2008). En 2009, nous avons obtenu des premiers cristaux 2D de BmrC/BmrD, un hétérodimer de B. subtillis, homologue de l héterodimer humain ABCG5/ABCG8. Ces cristaux ont apportés deux informations inédites :une organisation en dimere d hétérodimeres en membrane lipidique, alors qu il est monomérique en détergent, révélant ainsi des interactions faibles intermoléculaires ; une conformation post-hydrolytique avec une ouverture des domaines transmembranaires vers le milieu extracellulaire similaire de celles observées avec les homodimeres bactériens (Figure 4). Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 4/6

5 Figure 4 : Analyse fonctionnelle et structurale de BmrC/BmrD un transporter bactérien hétérodimerique de B. subtillis de phénotype MDR (coll. J.M.Jault, IBS, Grenoble). (A) Purification de l hétérodimere His-BmrC/His-BmrD. (B) La chromatographie d exclusion de taille indique une espèce BmrC/BmrD monomérique en détergent. (C) Reconstitution unidirectionelle dans des protéoliposomes unilamellaires comme vérifié par cryo-microscopie électronique (D). (E) Activité ATPasique après reconstitution. (F, G) Cristaux 2D. (H) Carte de porejction montrant une organisation dimerique (BmrC/BmrD)2 en membrane. Les sous unités sont attribuées, BmrC en rouge, BmrD en bleu. La conformation est open outside en post-hyrolytique. II.c. Conception de nouveaux systèmes membranaires (Post-doc, A. Berquand, , coll. P.E. Milhiet, CBS, Montpellier) Dans le contexte de l analyse structurale des protéines membranaires, il est essentiel de développer de nouvelles méthodes de préparation d échantillons consommant moins de protéines et ainsi s ouvrir à moyen terme à l analyse structurale des protéines eucaryotes difficiles à surexprimer. Nous avions précédemment utilisé le concept de transfert de protéines présentes dans un volume, soit 3D, vers une surface fonctionnalisée avec un ligand, soit 2D, pour les concentrer et les cristalliser, diminuant ainsi la quantité de protéines à 1 ugr/essai (Fig. 4A). Nous avons continué à développer cette approche en utilisant de nouveaux lipides ligands (Hussein et al., 2009). En 2006, avec P.E. Milhiet (CBS, Montpellier), nous avons développé une nouvelle approche de reconstitution par transfert des protéines du volume dans une bicouche plane pour leur étude par AFM (Fig. 5).L approche réside dans l incorporation directe de protéines membranaires dans des bicouches planes préformées déstabilisées en détergent (figure 5). Cette approche est dérivée de nos expériences d incorporation directe de protéines membranaires dans des liposomes préformés pour des études fonctionnelles. Nous avons incorporé deux complexes membranaires de tailles différentes (LH1-RC, 300kD et LH2, 110kD) dans plusieurs conditions différentes (type de détergent, température, quantité de protéines) que nos collaborateurs ont ensuite imagés (Berquand et al., 2007; Milhiet et al., 2006). Les résultats indiquent que: i) les protéines sont incorporées à une densité suffisante dans les bicouches Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 5/6

6 lipidiques pour l analyse AFM à haute résolution, ii) l orientation des protéines est unique, iii) le processus est rapide, ~ 10 minutes, iv) la quantité de protéines est ~ 1 picomole de protéines par essai de reconstitution. Figure 5 : Nouvelles méthodes pour diminuer la quantité de protéines pour l analyse structurale. A. Cristallisation 2D de protéine à la surface d un film lipidique fonctionnalisé (Hussein., et al 2009). B. Incorporation directe de protéines dans des bicouches planes. Une bicouche lipidique plane est formée sur du mica par fusion de vésicule. L addition de détergent introduit des défauts dans la bicouche favorisant l insertion rapide de protéines membranaires. Après élimination du détergent, les protéines incorporées sont imagées par AFM. Image AFM haute résolution de complexes membranaires LH1-RC incorporés. On distingue les 16 sous unités de LH1-RC (PM ~ 280kD). Nous disposons ainsi de la méthode structurale qui consomme le moins de protéines. De plus, on s affranchit de l étape difficile de cristallisation 2D. Enfin, la rapidité du processus permet de travailler quelques minutes après la purification de protéines et d éviter l agrégation de protéines instables en détergent. Il est maintenant réaliste d envisager l analyse par AFM de protéines membranaires d origine humaine connues pour être instables, difficiles à sur-exprimer et à cristalliser. Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 6/6

7 II.d. Cryo-microscopie électronique (AI, Aurélie Di Cicco) La cryo-microsocopie électronique consiste à analyser par microscopie électronique des échantillons congelés à très grande vitesse dans de la glace vitreuse permettant de préserver leur intégrité. C est la technique utilisée pour l analyse structurale mais également pour la caractérisation de protéines interagissant avec les membranes (figure 6A, coll. L. Johannes, UMR 144), ou de matériaux biomimétiques (figure 6C,D). Ainsi, en collaboration avec M.-H Li (UMR 168), nous avons caractérisé les structures vésiculaires et tubulaires, «polymersomes», formées par des polymères biomimétiques (Boissé et al., 2009; Jia et al., 2009 ; Mabrouk et al., 2009; Xu et al., 2009). Figure 6. Image de cryomicroscopie de systèmes biomimétiques. (A) Sousunité B de la toxine de shiga (fleche) liée à son récepteur Gb3 incorporé dans des liposomes. (B) Nanopores (flèches) stabilisés par des détergents dans des bicouches lipidique C) polymersomes constitutés d amphiphiles diblock. (D) Polymersomes géants. III. PERSPECTIVES Nos recherches vont s orienter selon trois axes : i) analyse structurale de transporteurs membranaires procaryotes et eucaryotes principalement de la famille des transporteurs MDR, ii) développement de nouvelles approches d analyse de protéines membranaires iii) analyse de systèmes modèles membranaires et de préparations membranaires purifiées par cryo-microscopie électronique. Dans ce contexte, l Institut Curie a renforcée ces moyens techniques en 2009, avec l arrivée d un microscope électronique de type FEG, localisé à Orsay (Institut Curie, INSERM U759), plus puissant et de meilleure résolution que les microscopes actuels et la labellisation plateforme nationale d imagerie «IBISA». IV. REFERENCES Berquand, A., Levy, D., Gubellini, F., Le Grimellec, C., and Milhiet, P.E. (2007). Influence of calcium on direct incorporation of membrane proteins into in-plane lipid bilayer. Ultramicroscopy 107, Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 7/6

8 Boissé, S., Rieger, J., Di-Cicco, A., Albouy, P.A., Bui, C., Li, M.H., and B., C. (2009). Synthesis via RAFT of amphiphilic block copolymers with liquidcrystalline hydrophobic block and their self-assembly in water. Macromolecule Busselez, J., Cottevieille, M., Cuniasse, P., Gubellini, F., Boisset, N., and Levy, D. (2007). Structural basis for the PufX-mediated dimerization of bacterial photosynthetic core complexes. Structure 15, Gubellini, F., Francia, F., Busselez, J., Venturoli, G., and Levy, D. (2006). Functional and structural analysis of the photosynthetic apparatus of Rhodobacter veldkampii. Biochemistry 45, Hsin, J., Chipot, C., and Schulten, K. (2009). A glycophorin A-like framework for the dimerization of photosynthetic core complexes. J Am Chem Soc 131, Hussein, W., Ross, B.P., Lévy, D., Landsberg, M., Hankamer, B., and RP., M. (2009). Synthesis of Nickel-chelating fluorinated lipids for protein monolayer crystallization. Journal of Organic Chemistry 74, Jia, L., Cao, A., Lévy, D., Xu, B., Albouy, P.A., Xing, X., Bowick, M.J., and M.H.Li. (2009). Smectic polymers vesicles.. Soft Matter 5, Mabrouk, E., Cuvellier, D., Pontani, L.L., Xu, B., Lévy, D., Keller, P., Brochard-Wyart, F., Nassoy, P., and M.H.Li. (2009). Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter 5, Milhiet, P.E., Gubellini, F., Berquand, A., Dosset, P., Rigaud, J.L., Le Grimellec, C., and Levy, D. (2006). Highresolution AFM of membrane proteins directly incorporated at high density in planar lipid bilayer. Biophys J 91, Orelle, C., Gubellini, F., Durand, A., Marco, S., Levy, D., Gros, P., Di Pietro, A., and Jault, J.M. (2008). Conformational change induced by ATP binding in the multidrug ATP-binding cassette transporter BmrA. Biochemistry 47, Scheuring, S., Busselez, J., and Levy, D. (2005). Structure of the dimeric PufX-containing core complex of Rhodobacter blasticus by in situ atomic force microscopy. J Biol Chem 280, Scheuring, S., Francia, F., Busselez, J., Melandri, B.A., Rigaud, J.L., and Levy, D. (2004b). Structural role of PufX in the dimerization of the photosynthetic core complex of Rhodobacter sphaeroides. J. Biol. Chem. 279, Xu, B., Piñol, R., Nono-Djamen, M., Pensec, S., Keller, P., Albouy, P.A., Lévy, D., and Li, M.H. (2009). Selfassembly of liquid crystal block copolymer PEG-b-smectic polymer in pure state and in dilute aqueous solution. Faraday Discussion 143, Rapport d activité (2009) Equipe D. Lévy 8/6

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