Techniques de biologie moléculaire utilisées dans un cadre diagnostique. A. CALENDER 7.11 couvrant l ensemble des techniques

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1 Techniques de biologie moléculaire utilisées dans un cadre diagnostique A. CALENDER 7.11 couvrant l ensemble des techniques

2 Introduction Diagnostic clinique Confirmation par l analyse génétique Traitement et suivi adapté Étude des apparentés Traitement et suivi adapté et précoce des apparentés porteurs de la mutation Exclusion des apparentés non porteurs de la mutation

3 Etude du génome Cytogénétique conventionnelle «Etude à l échelle du chromosome» Etude du caryotype Fish Analyses génétiques Cytogénétique moléculaire CGH array Biologie moléculaire «Etude à l échelle du nucléotide» Séquençage dhplc, HRM Multiplex

4 Diagnostic génétique Recherche d'anomalies au niveau de l'adn génomique des patients. Anomalie pathogène diagnostic et suivi du patient Variant non classifié nécessité de test fonctionnel afin d'évaluer son caractère pathogène

5 Biologie moléculaire Mutation de petite taille : Mutation ponctuelle Délétion / duplication /insertion de petite taille Grands réarrangements : Délétion/duplication totale d un gène Délétion / duplication d un ou plusieurs exons

6 Plan Recherche de mutation de petite taille Techniques de criblage Technique dhplc Technique HRM Technique de Confirmation = Séquençage Classification des variants Analyse In silico Analyse ARNm Techniques quantitatives et semi-quantitatives PCR en temps réels Fluorophore lié à ADN double brin Hydrolyse de sondes Techniques de recherche des grands réarrangements MLPA MPLC

7 Techniques de criblage

8 Méthodes de criblage QUAND? Pour les gènes de grande taille Pour les pathologies avec de nombreux patients POURQUOI? Analyse plus rapide Lecture et analyse des résultats plus facile Gain de temps technique Gain sur les coûts de réactifs

9 Principe de formation des Hétéroduplexes 1/2 Gène d intérêt Amplification par PCR à partir d amorces spécifiques Variant génétique Dénaturation de l ADN double brin par Chauffage à 95 C

10 Principe de formation des Hétéroduplexes 2/2 Mésappariements Homoduplexes Hétéroduplexes Renaturation en ADN double brin par refroidissement progressif

11 Conditions d obtention des hétéroduplexes PCR très spécifique : Taq Polymerase proofreading protocole PCR Touchdown Analyses par comparaison entre deux résultats Propriétés thermiques différentes des homoduplexes: dhplc: Température d analyse spécifique HRM: Courbe de dénaturation

12 Technique dhplc dhplc: denaturing Hight Performance Liquid Chromatography Développée depuis 2000 Un seul fournisseur : Transgenomic Plusieurs conditions d utilisation: Dénaturantes (80 C) (simple-brin) Non dénaturantes (50 C) (double-brins) Semi dénaturantes (double-brins)

13 Principe de la technique dhplc 1/2 Rétention sur Colonne dhplc des acides nucléiques Phase Stationnaire: PS-DVB Phase mobile: TEAA et ACN PS-DVB Flot de Phase mobile PS-DVB Phase stationnaire Flot de Phase mobile Interaction hydrophobe entre PS-DVB et TEAA Homoduplexe Flot Hétéroduplexe Flot Interaction ionique entre TEAA et ADN

14 Principe de la technique dhplc 2/2 Élution des mésappariements et des homoduplexes Augmentation progressive de la concentration en ACN Flot ACN ACN Flot Élution en premier des hétéroduplexes PS-DVB Flot ACN ACN ACN ACN Flot Élution en second des homoduplexes

15 Appareils de dhplc

16 Principe de l appareil dhplc Chromatographie liquide Comme les HPLC classique Phase solide spécifique aux acides nucléiques DETECTION RETENTION SEPARATION INJECTION

17 Résultats dhplc 1/2 Homoduplexes Hétéroduplexes Détection des ADN par UV Analyse informatique A G C T A T C G

18 Résultats dhplc 2/2 Analyse par comparaison avec le profil d un échantillon non atteint Choix des paramètres d analyses très délicat

19 Avantages et inconvénients de la dhplc Très bonne sensibilité Préparation rapide Lecture rapide Appareil semi-automatique Plusieurs applications possibles Mise au point délicate (PCR et technique) Maintenance importante Analyse nécessite expérience de l opérateur Pas de reproductibilité parfaite

20 Applications dhplc Genotypage Criblage de mutations Gene mapping (par génotypage multiple) Détection de méthylation (après traitement au bisulfite)

21 Technique HRM HRM: Hight Resolution Melting Développée depuis 2003 Plusieurs fournisseurs Mesure d une fluorescence émise par des fluorophores (dyes)

22 Appareils de HRM

23 Principe et caractéristiques du RotorGene Q Gamme de température C Vitesse de température +/- 2,5 C Précision de +/- 0,02 C température

24 Étapes Amplification en présence d un fluorophore intercalant l ADN Formation des hétéroduplexes Dénaturation de l amplicon avec mesure de la fluorescence en temps réel Analyse des courbes de fusion obtenues

25 Nécessité de dyes saturants Dyes non saturants Réincorporation du dye Fluorescence non linéaire à la courbe de dénaturation des ADN Dyes saturants Réincorporation impossible Linéarité entre fluorescence et courbe de dénaturation des ADN

26 Principe de la HRM Dye émet de la fluorescence quand: Incorporation sur ADN double-brins Fluorescence en % Excitation par une source d énergie 1 ADN se dénature Relargage du dye Fin de la fluorescence 2 3 Température en C

27 Courbes de visualisation des résultats 1/4 Courbes de fusion brutes Standardisation de la fluorescence par rapport à la valeur la plus forte Résultats sous forme de % Permettent de voir: Homogénéité entres les courbes PCR inefficaces Vérification «Blanc de PCR»

28 Courbes de visualisation des résultats 2/4 Courbes dérivées Permettent de : Voir la spécificité de la PCR Placer les fenêtres de normalisation

29 Courbes de visualisation des résultats 3/4 Courbes normalisées Obtenues après normalisation Permettent de comparer les courbes entres elles

30 Courbes de visualisation des résultats 4/4 Courbes des différences Obtenues par comparaison informatique point par point avec une ou plusieurs courbes de référence Permettent de comparer les courbes avec une référence connue (généralement le WT)

31 Résultats HRM Variant 1 Variant 1 Variant 2 Variant 2 Variant 3 Variant 3 Normalisation des courbes : mise à niveau des intensités des courbes Dérivé mathématique des courbes normalisées par rapport à une courbe de référence Analyse par comparaison avec le profil d un échantillon non atteint

32 Avantages et inconvénients de la HRM Très bonne sensibilité Lecture rapide Préparation rapide Maintenance simple Cadence importante Mise au point PCR délicate Analyse nécessite expérience de l opérateur Moins performant sur fragments >300pb Appareils non polyvalents

33 Applications HRM Genotypage Criblage de mutations Diagnostic microbiologique Quantification ARN Etude de la compatibilité HLA Détection de méthylation (après traitement au bisulfite) Contrôle de l amplification PCR Caractérisation de clones Détection d hétéroplasmie de l ADN mitochondrial

34 Séquençage

35 Principe séquençage 1/3 Cible et amplification de la région à étudier par PCR puis séquençage

36 Principe séquençage 2/3 Au vue du nombre de copie, au final, statistiquement, toutes les bases sont marquées

37 Principe séquençage 3/3

38 Séquenceurs 1/2 Séquenceur à 16 capillaires =16 échantillons en même temps Électrophorèse des fragments d ADN dans un tube très fin (=capillaire) remplit de gel d acrylamide (=polymère) Migration des fragments ADN chargé ( ) grâce à leur phosphate vers l electrode (+) Détection par excitation au laser des fluorophores couplés aux ddntp Conversion des longueurs d onde lues en données biologiques (1 longueur d onde = 1 nucléotide)

39 Séquenceurs 2/2

40 Fonctionnement du séquenceur capillaire 1/3

41 Fonctionnement du séquenceur capillaire 2/3

42 Injection électrocinétique

43 Fonctionnement du séquenceur capillaire 3/3 Nappe de capillaires Sens de l electrophorèse

44 Détection du signal 2/2

45 Détection du signal 1/2

46 Résultats du séquenceur

47 Résultats du séquençage

48 Substitution hétérozygotte Substitution homozygotte

49 Délétion hétérozygotte

50 Limites du séquençage 1/2 On ne trouve que ce que l on cherche Allèle 1 Exon 3 Allèle 2 Exon 3 Zone étudiée Délétions ou duplications non mises en évidence Allèle 1 Exon 3 Allèle 2 Zone étudiée

51 Limites du séquençage 2/2 Coûteux et très longs Mosaïques difficilement détectables

52 Classification des variants

53 Diagnostic des modifications non classifiées Sont considérées comme mutations pathogènes : Codon stop (décalage du cadre de lecture ou substitution) Variation au niveau des sites consensus d épissage (10% des mutations) Variation de novo Modification déjà décrite comme pathogène dans la littérature. Problèmes : Séquençage principalement des séquences codantes et des jonctions introns-exons. Comment considérer une modification non classifiée?

54 Exemples de variants non classifiés Gène MEN1 : - 10 exons - exon 1 non codant - début de l exon 2 non codant. ATG 1 Silent/ PM Upstream ATG Deep intronic TGA 2 c.30g>t p.l10l c.600c>t p.g200g c.1314c>t p.t438t c.1-10g>a c.1-16g>a c.1-22c>a c c>t c c>t c delc Effet potentiel sur le processus d épissage

55 Rappel des bases de l épissage Site donneur Site de branchement ARN prémessager Site accepteur ARNm Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005

56 Rappel des bases de l épissage Autres séquences consensus jouant un rôle dans l épissage : ESE (exonic splicing enhancer) ESS (exonic splicing silencer) ISE (intronic splicing enhancer) ISS (intronic splicing silencer) Wang & Cooper, Nature Reviews Genetics, 2007

57 Mutations pouvant avoir un effet sur l épissage Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005

58 Tous les variants peuvent potentiellement affecter l épissage Variants des sites consensus d épissage (exon ou intron) Variants introniques ou exoniques hors des sites consensus d épissage

59 Conséquences des variants sur le mécanisme d épissage Houdayer & Stoppa-Lyonnet, med & sci, 2005

60 Conséquences des variants sur le mécanisme d épissage Gène NF1 : ~50% des mutations affectent le processus d épissage Ars et al., hum mol genet, 2000

61 Techniques d étude des anomalies d épissage Analyse de l ADN génomique Analyse in silico Analyse de l ARNm

62 Analyse de l ADN génomique Séquençage de l ADN : Parties codantes Jonctions intron-exon. Avantages : Robustesse de la molécule d ADN Facilité de l extraction Systématisation des techniques de séquençage. Inconvénients : Anomalies hors zones séquencées non détectées Difficulté d interprétation de certaines modifications (30% pour BRCA1).

63 Analyses in silico Matrices permettant d identifier les sites régulateurs de l'épissage : Splice Site Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) MaxEntScan (http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/xmaxentscan_scoreseq.html) GeneSplicer (http://www.tigr.org/tdb/genesplicer/gene_spl.html) Splice Site Finder (http://www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html) ESE Finder (http://www.exon.cshl.org/ese/index.html) Rescue ESE (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-exe/) Human Splicing Finder (http://www.umd.be/hsf). Avantages : Screening informatique rapide. Inconvénients : Relativement efficaces pour les modifications des sites consensus d épissage Insuffisante pour les autres modifications.

64 Analyse de l ARNm Méthodes d analyse de l ARN: Analyse directe de l ARNm Utilisation de la technique des minigènes.

65 Analyse directe de l ARNm Technique d'étude : Extraction d'arn total issu de sang ou de cellules d une lignée lymphoblastoïde établie à partir du sang du patient Reverse transcription de l'arnm en ADNc puis amplification par PCR Dépôt sur gel d agarose afin de détecter un (ou des) ADNc de taille(s) anormale(s) Séquençage des ADNc de taille anormale. Patient Témoin

66 Analyse directe de l ARNm Contrôle Patient Exon 7 Exon 7 Exon 8 Intron 7 Exon nucléotides La substitution d'un nucléotide du site donneur d'épissage entraîne la rétention de l'intron.

67 Analyse directe de l ARNm Avantages : Puissance diagnostique de l ARNm Si l ARNm est disponible, technique envisageable dans un laboratoire de diagnostic. Inconvénients : Fragilité de l ARNm Impossible si le prélèvement est dégradé ou lors d envoi d ADN déjà extrait Nécessité d établir des lignées lymphoblastoïdes dans certains cas.

68 Analyse de l ARNm par la technique des minigènes 1/2 PCR du fragment d intérêt à partir de l ADN du patient Les amorces avec sites de clivage d enzymes de restriction clonage dans un vecteur d expression (pcdna, pcineo ). Tournier et al., Hum Mutat, 2008

69 Analyse de l ARNm par la technique des minigènes 2/2 Transformation de bactéries pour l amplification du vecteur Extraction de l ADN plasmidique à partir des bactéries Transfection transitoire (HeLa, HEK293 ) Extraction de l ARNm Analyse par RT-PCR. Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005

70 Analyse de l ARNm par la technique des minigènes Avantages : Robustesse de l ADN Puissance diagnostique de l ARN. Inconvénients : Technique longue Génération d OGM Actuellement non envisageable dans un laboratoire de diagnostic.

71 Classification des variants : conclusions L analyse des séquences codantes de l ADN n est pas suffisante pour détecter toutes les mutations. Dans certains cas, le processus d épissage peut être affecté. Les outils bioinformatiques sont potentiellement prometteurs mais non suffisants actuellement. L analyse de l ARNm par la technique des minigènes reste difficilement envisageable en diagnostic de "routine".

72 PCR en temps réel

73 Principe de la qpcr Détection et quantification d un émetteur fluorescent pendant le processus d amplification Augmentation de la fluorescence proportionnelle à la quantité d amplicon produite durant la réaction (lors de la phase exponentielle)

74

75 PCR en temps réel 1/2 2 types de technologies de détection : Fluorophore lié à ADN double brin = SybR Green Sondes fluorescentes par hydrolyse de sondes = TaqMan

76 PCR en temps réel 2/2 Permet une mesure de la quantité d ADN dans un échantillon Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle Phase exponentielle Sortie du bruit de fond : Cycle de sortie (Ct)

77

78 CT value CT cycle treshold Le CT est le nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence atteigne un certain seuil Il existe une relation linéaire entre la valeur du Ct et le log du nombe de copies CT

79 SybR Green 1/2 SybR Green va s intercaler dans la double hélice ADN Réaction de PCR standard + SYBR Green Émission de fluorescence uniquement quand intercalé à l ADN Augmentation de la fluorescence à chaque cycle Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle Phase exponentielle = quantitatif avec un facteur 2 à chaque cycle Comparaison avec une gamme obtenue sur un gène témoin Quantification

80 SybR Green 2/2

81 Sonde TaqMan Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sont ajoutés au milieu réactionnel Les deux amorces permettant l amplification (amorce directe et amorce inverse complémentaire Une sonde qui peut s hybrider sur une séquence correspondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!) La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser, et un quencher dont la longueur d onde d excitation correspond à la longueur d onde d émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sont à proximité, le quencher absorbe la fluorescence du reporter. 570 nm 488 nm 520 nm Reporter Fluorescéine ou FAM 5 Quencher 3 TAMRA

82 Pendant la PCR, la sonde s hybride sur l ADN simple brin lors de l étape d hybridation des amorces 488 nm FAM 570 nm Hybridation TAMRA nm Elongation nm nm Taq: ADN polymérase 5-3 et Activité Exonucléase nm Mesure à la fin de l étape d élongation

83 Sonde TaqMan

84 Exemple de TaqMan

85 Autres techniques qpcr HybProbe Molecular Beacons Scorpion primers Eclipse probe Amplifluor Chemistry LUX primers BD Qzyme primers

86 RT- PCR : Reverse Transcriptase PCR ARN : matrice d'amplification - transformation d ARNm en cdna sous l action d une transcriptase reverse - amplification du cdna par PCR. Trois types d amorces : - oligo dt qui s hybrident sur la queue poly A des ARNm - amorces d hexanucleotides qui s hybrident à différents endroits de l ARNm - amorce spécifique de l ARNm à étudier

87 Trois types d amorces RT AAAAAAAA TTTTTTTT AAAAAAAA AAAAAAAA RT

88 Applications qpcr Quantification d ADN et ARN Détection et quantification microbienne Gene Expression Genotypage

89 Techniques de recherche de grands réarrangements

90 Grands réarrangements Délétion ou duplication 1 copie délétion 2 copies duplication 3 copies

91

92 Résultats MLPA

93 Résultats MLPA

94 Principe MPLC PCR multiplexe Sur appareil dhplc Marquage par fluorescence : intégration d un fluorophore directement dans la phase mobile modules supplémentaires Séparation par des tailles différentes

95 Résultats MPLC 1/2 Exon 1 VHL Exon 2 VHL Exon 3 VHL Patient sain Exon 24 NF1 Patient sain et patient muté délétion des exons 2 et 3 Patient sain et patient muté après normalisation

96 Résultats MPLC 2/2 MPLC BHD Exons 8 et 2 BHD Exon 1 BHD Exons 7 et 6 BHD Exons 11 et 10 BHD Exons 14, et 9 BHD Exons 4 et 5 BHD Ti 305

97 Conclusions Outils moléculaires utilisés doivent être adaptés à ce qui est recherché Certains variants nécessitent d autres analyses : corrélation dans la famille, étude sur une population témoin Techniques de routine pour l instant mais d autres approches sont en développement : analyse génomique par MS, Next generation Sequencing Plateform

98

99 HybProbes

100 Molecular Beacons

101 Scorpion primers

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