Examen 4F : Les biotechnologies, partie I

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1 Nom, Prénom : Corrigé Examen 4F : Les biotechnologies, partie I Durée 45 minutes. Total 49 points. 1. QCM (= questionnaire à choix multiples). Vous avez, pour chaque question, une ou plusieurs réponses possibles. Toujours noter toutes les réponses exactes, même si elles vous paraissent être «contenues» dans une autre. 8pts A.- Parmi les outils suivants issus des biotechnologies, lequel n est pas associé à son utilisation : a) Enzyme de restriction production de PFTR (polymorphisme de taille des fragments de restriction). b) ADN ligase enzyme qui découpe l ADN en créant des fragments de restriction à bouts collants. c) ADN polymérase employée dans une amplification en chaîne par polymérase pour développer des fragments d ADN. d) Transcriptase inverse production d ADNc (c=complémentaire) à partir d ARNm. e) Electrophorèse séquençage de l ADN. B.- La première étape dans le clonage d un gène est : a) l insertion d un plasmide dans une bactérie. b) l isolement du gène d intérêt à partir d un organisme qui le contient. c) la culture des cellules. d) le traitement des plasmides avec les enzymes de restriction. C.- Après l introduction du plasmide et la mise en culture des cellules dans le protocole de clonage d un gène, nous obtenons : a) que des bactéries transformées (ayant intégré le plasmide). b) des bactéries transformées et non transformées (pas d intégration du plasmide). c) des bactéries transformées uniquement avec le plasmide recombiné. d) des bactéries transformées uniquement avec le plasmide non recombiné. D.- Lors de la PCR (Polymerase Chain Reaction), les acteurs suivants interviennent : a) ARN polymérase. b) Taq polymérase humaine. c) 1 seule amorce spécifique. d) 4 désoxyribonucléotiques différents, à savoir l adénine, la cytosine, la guanine et la thymine. E.- Lors de la PCR (Polymerase Chain Reaction), les étapes suivantes interviennent : a) la dénaturation durant laquelle les amorces se fixent sur l ADN à amplifier. b) l hybridation durant laquelle se déroule la dénaturation du fragment d ADN double brin. c) l élongation durant laquelle se déroule la fabrication des brins complémentaires dans le sens 3 5. d) la dénaturation se déroule à une température de 94 C et dure quelques secondes. 1

2 F.- Parmi les organismes suivants, lequel a le plus grand génome et le plus petit nombre de gènes par million de paires de bases? a) H. influenze (Bactérie) b) S. cerevisiae (Levure) c) A. Thaliana (Plante) d) D. melanogaster (Drosophile) e) H. sapiens (Humain) G.- Dans les méthodes de production de l ADN recombiné, le terme vecteur peut désigner : a) l enzyme qui découpe l ADN en fragments de restriction. b) l extrémité cohésive d un fragment d ADN. c) un marqueur PTFR. d) un plasmide employé pour introduire de l ADN dans une cellule vivante. e) une sonde d ADN servant à identifier un gène particulier. H.- La société Celera Genomics a séquencé le génome humain en effectuant a) une cartographie génétique de chaque chromosome. b) une cartographie physique poussée de chaque chromosome à partir de grands fragments chromosomiques. c) le séquençage de petits fragments d ADN, puis la détermination de la séquence nucléotidique globale par assemblage des fragments. d) a et b e) a, b et c 2.- Les enzymes de restriction (8.5pts) Ci-dessous est représentée la liaison entre deux nucléotides qui est rompue par l'enzyme de restriction BamH I. 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 5' Soient les enzymes de restriction BamH I, Pst I, Xho I et Mbo I dont les sites reconnus sont: BamH I : 5' G/GATCC 3' ; OK (0.5pt) Pst I : 5' CTGCA/G 3' ; OK (0.5pt) Xho I : 5' C/TCGAG 3' ; NON Mbo I : 5' /GATC 3'. OK (0.5pt) (=1.5pt) a) Déterminer quelle(s) enzyme(s) de restriction peuvent agir sur la séquence ci-dessous et indiquer la position des coupures sur le document (5.5pts) = 1.5pt + 4pts 2

3 5 ATACGG /(BamH I) /(Mbo I) GATCCGAGCTCTC / (Mbo I) GATCGTCTGCA /(Pst I) GAAATTCC 3 3' TATGCCCTAG /(BamH I) / (Mbo I)GCTCGAGAGCTAG / (Mbo I) CAG /(Pst I) ACGTCTTTAAGG 5' = 8 x 0.5pt = 4 pts b) Donner la définition détaillée d une enzyme de restriction et son origine (1.5pt) Ce sont des protéines qui peuvent couper des fragments d'adn au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction (1pt). Origine : bactérienne (0.5pt) c) Expliquer comment l organisme qui produit ces enzymes protège-t-il son propre ADN contre leur action (1.5pt). Il produit des méthylases (enzymes) (0.5pt) reconnaissent le site de restriction sur son ADN ajoute des groupements méthyl (CH3) (1pt) empêchent la coupure. 3.- Agrobactérium tuméfaciens (18pts) a) Donner la structure détaillée de cette bactérie. (Schéma avec tous les composants détaillés, y compris ceux du plasmide Ti) (5pts) Membrane plasmique (0.5pt) Chromosome bactérien (0.5pt) Plasmide Ti (0.5pt) qui contient ADN-t (0.5pt) qui porte un gène codant pour le développement de la tumeur (0.5pt) + un gène codant pour la synthèse et la libération des opines (0.5pt). On trouve ensuite une région VIR, (0.5pt) qui contient des gènes qui permettent la fixation de la bactérie aux cellules végétales (0.5pt). Une OR qui permet de répliquer le plasmide (0.5pt) et deux gènes qui permettent à la bactérie de métabolisé les opines (0.5pt) b) Expliquer en détails les différentes étapes qui permettent à cette bactérie d effectuer un transfert de gène sur une plante et citer les conséquences de ce transfert sur la plante (5.5pts) 1.- Blessure au niveau de la plante (microblessures: insectes, vers, formation de racines latérales, gel (0.5pt) 2.- Emission de composés phénoliques par les cellules végétales endommagées (0.5pt) 3.- Chimiotactisme d Agrobactérium tumefaciens (0.5pt) 4.- Composés phénoliques activent la région de virulence (0.5pt) - Code une endonucléase ADN-T (0.5pt) 5.- La bactérie est capable de se fixer aux Ȼ de la blessure (0.5pt) 6.- La bactérie transfert une partie de son matériel génétique (ADN-t) (0.5pt) Conséquences : 7.- L ADN-T s intègre à celui de la plante (0.5pt) 8.- La plante produit d hormones de croissance (0.5pt) 9.- Croissance désordonnée et illimitée des Ȼ infectées Tumeur (galle du collet) (0.5pt) 10.- La plante synthétise et libère dans le sol des opines (0.5pt) 3

4 c) Cette bactérie n effectue aucune transgenèse sur les céréales, expliquer pourquoi? Citer ensuite et expliquer en quelques mots les méthodes de transfert direct employées pour transformer les céréales (7.5pts) Car les céréales ne produisent pas (0.5pt) de composés phénoliques (0.5pt) qui interviennent dans le chimiotactisme d agrobactérium tuméfaciens (0.5pt) - Le polyéthylèneglycol (PEG) (0.5pt) : agent chimique qui déstabilise la membrane plasmique (0.5pt) des protoplastes (0.5pt) - L électroporation (0.5pt) : appliquer de courts chocs électriques aux protoplastes (0.5pt) ce qui permet l ouverture de pores au niveau de la membrane plasmique permettant le passage de l ADN (0.5pt) - La microinjection (0.5pt) : microseringues (sous microscope) (0.5pt) permettant l introduction directement dans des cellules isolées (0.5pt) - Canon à gènes (0.5pt) : propulser le transgène à l intérieur de la cellule isolée (0.5pt). Le gène est fixé des projectiles microscopiques (0.5pt) 4.- Thérapie génique (14.5pts) La presse a annoncé en décembre 1999 qu une équipe médicale française de l'hôpital Necker à Paris a réussi à guérir deux jeunes patients de 8 et 11 mois atteints d une maladie génétique grâce à une thérapie génique. C est donc le premier succès de cette technique. a) Expliquer en quelques mots ce qu est la thérapie génique (1pt). La thérapie génique permet de remplacer un allèle mutant défectueux par un allèle fonctionnel (0.5pt) ou de surexprimer une protéine (0.5pt) dont l activité aurait un impact thérapeutique. b) De quelle maladie souffraient ces deux patients et expliquer la brièvement? (1.5pt) Enfants «bulles» (Déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X (DICS-X)) (0.5pt). Il s agit d un problème de différenciation des lymphocytes (absence de récepteurs à l interleukine (IL-2)) qui ne peuvent pas combattre les antigènes (1pt) c) Expliquer en détails l élaboration du vecteur contenant le gène thérapeutique et le protocole utilisé pour administrer ce vecteur au patient (12pts) Isoler (0.5pt) et cloner (0.5pt) le gène d intérêt thérapeutique Réaliser un vecteur Etape A: Création d une lignée cellulaire d encapsidation (0.5pt) 4

5 0.5pt On introduit dans une cellule les gènes viraux suivants (0.5pt) : - Pol = gène codant pour la synthèse d enzymes (transcriptase inverse) (1pt) - Gag = gène codant pour les protéines de la capside (1pt) - Env = gène codant pour la synthèse des protéines de l enveloppe (1pt) Cette cellule est maintenant une cellule d encapsidation car elle produit des particules virales vides (0.5pt) Etape B: Modifications des virus non pathogènes = sécurisés (0.5pt) On leur enlève les gènes nécessaires à leur réplication (0.5pt) Pol = gène codant pour la synthèse d enzymes (transcriptase inverse) Gag = gène codant pour les protéines de la capside Env = gène codant pour la synthèse des protéines de l enveloppe 0.5pt 5

6 Remplacer gènes pol, gag et env par le gène thérapeutique (0.5pt) génome rétroviral (ARN) est désarmé (0.5pt) Etape C: Infection Ȼ d encapsidation avec le virus modifié (0.5pt) 3pts BON TRAVAIL!!! 6