DEVELOPPEMENT D UNE NOUVELLE METHODE DE DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE DE LA MALADIE DE CROHN
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- Dorothée Bastien
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1 CONFERE 17 6 ET 7 JUILLET 2017, SEVILLE, ESPAGNE. DEVELOPPEMENT D UNE NOUVELLE METHODE DE DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE DE LA MALADIE DE CROHN Zoé Desmazières 1, Clémence Tréminio 1, Abdellatif Elm Selmi 1 1 Laboratoire de Biologie Moléculaire EBI Résumé : La maladie de Crohn se caractérise par des symptômes communs à de nombreuses maladies intestinales tels que les vomissements, diarrhées ou encore douleurs abdominales : il est donc difficile aujourd hui de diagnostiquer cette pathologie de façon précise sans être invasif. Nous avons donc élaboré une méthode non invasive permettant un diagnostic rapide et précis de la maladie de Crohn pour pouvoir innover dans ce domaine. Cette méthode se fonde sur le défaut de production du 15-HETE, un dérivé lipidique, par son enzyme, la 15-lipoxygénase 2. Ce défaut de production entraîne une augmentation de la perméabilité intestinale facilitant alors le passage de pathogènes et conduisant donc à des maladies inflammatoires chroniques de l intestin telles que la maladie de Crohn. Notre méthode de diagnostic permettra ainsi de quantifier le 15-HETE de manière indirecte, à savoir en quantifiant l enzyme 15-LOX 2 responsable de la production du 15-HETE, par un test ELISA et de comparer la valeur obtenue à une valeur seuil prédéfinie pour pouvoir ensuite conclure sur le diagnostic de la maladie de Crohn. Mots clés : Diagnostic, Maladie de Crohn, 15-HETE, méthode immuno-enzymatique, ELISA 1 INTRODUCTION Les maladies inflammatoires chroniques de l intestin (MICI) regroupent la maladie de Crohn et les recto-coliques hémorragiques (RCH). Elles provoquent une inflammation chronique, intermittente ou continue de la paroi d une partie du tube digestif. La maladie de Crohn peut atteindre tous les segments du tube digestif mais plus particulièrement l iléon terminal, le côlon et l anus. En France, la maladie de Crohn touche environ une personne sur 1000, avec 5 à 10 nouveaux cas/ habitants/an. On note une légère prédominance féminine. Elle peut débuter à tout âge mais son pic de fréquence est entre 20 et 30 ans. [1] Le diagnostic de la maladie de Crohn repose sur plusieurs critères : l histoire clinique, la présence d anomalies biologiques aspécifiques (une élévation du taux de CRP, anémies), l iléocoloscopie avec biopsies et l imagerie. [2] Ce diagnostic est dit différentiel. En effet, il est nécessaire d'éliminer les autres étiologies de colite aiguë en se basant sur un faisceau d arguments : interrogatoire, examen clinique digestif, extra-digestif et proctologique, prélèvements de selles pour examen bactériologique, parasitologique et recherches de toxine de Clostridium. Pour pouvoir ainsi innover dans ce domaine, nous avons élaboré une méthode non invasive permettant un diagnostic rapide, peu coûteux et précis de la maladie de Crohn. Cette méthode se fonde sur la découverte du rôle crucial d un dérivé lipidique, l acide 15- hydroxyeicosatétraénoïque (15-HETE) dans la maladie de Crohn. En effet, le défaut de production de
2 ce dérivé lipidique entraîne une augmentation de la perméabilité intestinale facilitant donc le passage de pathogènes. Cela aurait une conséquence directe sur l'endommagement de la barrière intestinale conduisant à des MICI telles que la maladie de Crohn. Nous allons donc nous baser sur cet argument et ces découvertes pour développer une méthode novatrice et peu coûteuse du diagnostic de la maladie de Crohn. La méthode de diagnostic que nous allons donc proposer sera fondée sur un prélèvement sanguin (par prise de sang) qui sera ensuite analysé grâce à un kit ELISA permettant d isoler et de quantifier le dérivé lipide 15-HETE (par spectrophotométrie). 2 OBJECTIF La maladie de Crohn se caractérisant par des symptômes communs à de nombreuses maladies intestinales (tels que les vomissements, diarrhées, douleurs abdominales), il est aujourd hui difficile de diagnostiquer cette pathologie de façon précise sans être invasif. Notre objectif est donc de proposer une méthode non invasive, peu coûteuse et efficace de diagnostic de la maladie de Crohn. Cette méthode se fonde donc sur la découverte du rôle crucial d un dérivé lipidique, l acide 15- hydroxyeicosatétraénoïque (15-HETE) produit par une enzyme, la 15-lipoxygénase 2 (15 LOX 2). En effet, lors d une atteinte par la maladie de Crohn, une équipe de l INSERM du CHU de Nantes a montré qu on pouvait observer un défaut de la production du 15-HETE par la 15-lipoxygénase 2. [3] Figure 1 : Schéma de régulation des cellules gliales entérique et de la barrière intestinale Ce défaut de production entraîne ainsi une augmentation de la perméabilité intestinale facilitant donc le passage de pathogènes et un risque accru d endommagement de la barrière intestinale conduisant à des MICI telles que la maladie de Crohn. [3] Notre solution serait donc de proposer une méthode de diagnostic permettant de quantifier indirectement le 15-HETE (en quantifiant l enzyme 15 LOX 2 responsable de la production du 15 HETE) et de comparer cette valeur à une valeur seuil pour pouvoir conclure sur un éventuel diagnostic de MICI. Pour cela, nous proposons donc un kit immuno-enzymatique Elisa, permettant d immobiliser les enzymes 15 LOX 2 et de les quantifier par la suite par spectrophotométrie.
3 Ce kit comprendra donc les anticorps anti 15 LOX 2 immobilisés, et il suffira de déposer une goutte de sang du patient dans les puits. Ensuite, pour procéder au dosage quantitatif afin de comparer la quantité de 15 LOX 2 à une valeur seuil que nous aurons prédéfini, nous utiliserons la méthode de la spectrophotométrie. Le résultat obtenu sera alors comparé à des valeurs seuil prédéfinies afin de conclure sur le risque de pathologie du patient. Ce kit ELISA permettrait d ajouter, à un faisceau d arguments aujourd hui très peu spécifiques de la maladie et trop invasifs pour les patients, une nouvelle méthode peu couteuse et rapide. De par sa simplicité d exécution, les médecins pourraient alors instaurer une prise en charge beaucoup plus rapide et adaptée, par rapport aux méthodes actuelles, dans le but d améliorer la qualité des soins. 3 ETAT DE L ART BIBLIOGRAPHIQUE Actuellement, le diagnostic de la maladie de Crohn repose sur un faisceau d arguments et est dit différentiel : Tout d abord, des anomalies biologiques aspécifiques comme une élévation du taux de CRP (supérieur à 6mg/L), une élévation du taux fécal de calprotectine (supérieur à 250 microgrammes par grammes de selle) ou encore des anémies sont constatées par prise de sang et tests de selles. Puis, une endoscopie oeso-gastro-duodénale et une iléo-coloscopie avec biopsies des zones lésées ainsi que des zones macroscopiquement saines sont réalisés. Ces examens permettent d identifier les zones évocatrices de la maladie de Crohn mais ces lésions endoscopiques ne sont pas spécifiques. Figure 2 : Endoscopie digestive Enfin, un examen histologique est réalisé à partir des biopsies. Des granulomes épithélioïdes et giganto-cellulaires sans nécrose caséeuse sont très évocateurs de la maladie mais ne sont présents que dans 30% des cas. Figure 3 : Examen histologique
4 Pour finir, un entéro-scanner et/ou une entéro-irm sont effectués pour rechercher une atteinte iléale distale présente dans environ deux tiers des cas. Ces deux examens apportent les mêmes informations. L avantage de l entéro-irm est l absence d irradiation mais il existe des contreindications : claustrophobie, certains types de pacemaker, femmes enceintes (pas d ingestion de produits de contraste par principe de précaution). Les contre-indications de l entéro-scanner sont : femmes enceintes et insuffisance rénale en cas d ingestion de produit de contraste. [1] Nous pouvons remarquer que les diagnostics existants sont peu spécifiques de la maladie et trop invasif. On peut donc en conclure qu il existe un réel besoin d innovation et de diagnostic spécifique et non invasif. 4 DEMARCHES EXPERIMENTALES ENVISAGEES POUR L OBTENTION DU PROTOTYPE Nous allons élaborer une méthode non invasive permettant un diagnostic rapide et précis de la maladie de Crohn. Cette méthode se fonde sur la découverte du rôle crucial d un dérivé lipidique, l acide 15-hydroxyeicosatétraénoïque (15-HETE) produit par une enzyme, la 15-lipoxygénase 2 (15- LOX 2). En effet, lors d une atteinte par la maladie de Crohn, une équipe de l INSERM du CHU de Nantes a montré qu on pouvait observer un défaut de production du 15-HETE par la 15-lipoxygénase 2. Notre méthode de diagnostic permettra donc de quantifier le 15-HETE de manière indirecte, à savoir en quantifiant l enzyme 15-LOX 2 responsable de la production du 15-HETE, et de comparer la valeur obtenue à une valeur seuil prédéfinie pendant l étude pour pouvoir ensuite conclure sur une possibilité de maladie inflammatoire chronique de l intestin comme la maladie de Crohn. Voici les différentes étapes des démarches expérimentales envisagées : 4.1. Validation des échantillons Nous allons tout d abord récupérer des échantillons sanguins de sujets sains et de patients atteints de la maladie de Crohn. Ces échantillons proviendront d un hôpital avec lequel nous aurons mis en place un partenariat. Ils seront alors validés par les méthodes de diagnostic actuels par un professeur en gastro-entérologie. Cette étape est indispensable pour pouvoir ainsi avancer dans notre phase de recherche Préparation des anticorps Une fois nos échantillons validés, nous souhaitons produire des anticorps monoclonaux anti 15- LOX-2, pour ainsi pouvoir réaliser une quantification indirecte du 15-HETE. Une fois les anticorps produits, nous les validerons par un western blot avec l enzyme marquée Validation du dosage des biomarqueurs par notre méthode Après avoir reçu nos anticorps monoclonaux spécifiques, nous établirons une gamme étalon et nous validerons en deux étapes notre méthode : - - Premièrement par la caractérisation de l interaction anticorps-enzyme dans un contexte purifié. En effet, nous effectuerons plusieurs tests afin de connaître, par exemple, la sensibilité et la spécificité des anticorps. Sur les échantillons des sujets sains et des patients par un dosage quantitatif par spectrophotométrie en recherchant une différence significative de leurs valeurs en 15-LOX 2.
5 De là, nous établirons les valeurs seuils qui seront par la suite utilisées après quantification par les kits. Ces valeurs seuils seront primordiales pour pouvoir établir une fourchette de valeurs indiquant de manière significative si le patient est atteint ou non de maladies inflammatoires chroniques de l intestin. Le but sera donc de comparer la valeur détectée aux valeurs seuils précédemment établies et cela nous permettra de conclure sur le diagnostic de la maladie de Crohn et d'ajouter ce critère à un ensemble de faisceaux d'arguments cliniques et biologiques le moins invasifs possibles. Ces tests vont donc nous permettre de valider à la fois nos biomarqueurs et notre méthode en testant les anticorps anti 15-LOX 2, et en ayant un aperçu de la précision du dosage quantitatif par spectrophotométrie Développement du kit Une fois la méthode et les biomarqueurs validés, nous lancerons la phase de validation du prototype. Ce dernier pourra être réalisé à notre laboratoire et par la suite une production industrielle pourra être envisagée. Figure 4 : Exemple de kit ELISA 5 RESULTATS ATTENDUS Les étapes seront les suivantes pour procéder au diagnostic de la maladie de Crohn : 1) Prélèvement sanguin 2) Pratique du test ELISA avec notre kit 3) Quantification de l enzyme
6 Tout d abord, nous attendons une différence significative du taux de 15 LOX 2 au sein des échantillons sains et des patients. Ces valeurs seuils seront primordiales pour pouvoir établir une fourchette de valeurs indiquant de manière significative si le patient est atteint ou non de maladies inflammatoires chroniques de l intestin. On pourra ainsi comparer la valeur obtenue lors de la prise de sang aux valeurs seuils permettant de conclure sur le diagnostic de la maladie de Crohn et d'ajouter ce critère à un ensemble de faisceaux d'arguments cliniques et biologiques le moins invasifs possibles. 6 CONCLUSION Les MICI sont en constante augmentation, on a observé plus de 60% de progression en 8 ans. Il est donc nécessaire et indispensable de prévenir au mieux ces maladies qui touchent une large part de la population et constituent une réelle préoccupation de santé publique. Pour cela, des recherches sur de nouveaux traitements thérapeutiques sont engagées mais il existe aussi un gros manque de diagnostic précis et non invasif de ces maladies. En effet, la plupart des méthodes proposées actuellement sur le marché ne sont pas assez précises et les biomarqueurs utilisés sont souvent peu spécifiques aux maladies inflammatoires chroniques de l intestin et plus particulièrement à la maladie de Crohn. La méthode que nous proposons est une méthode rapide, simple et non invasive qui s inscrirait dans un faisceau d arguments permettant alors de confirmer ou orienter le diagnostic vers celui de la maladie de Crohn. Notre kit de diagnostic pourra être utilisé à la suite d une prescription par un médecin d une prise de sang recherchant les anticorps anti 15 LOX 2. Le médecin évaluera ensuite grâce au dosage de 15 LOX 2 du patient en comparaison avec les valeurs seuils si le diagnostic de la maladie de Crohn est pertinent et peut alors être posé. Notre méthode permettra donc d éviter d une part des opérations invasives telles que des endoscopies, coloscopies, fibroscopies qui s avèrent être parfois inutiles et permettront aux médecins de prescrire un traitement adéquat sans passer par des phases de traitements non adaptés à la pathologie du patient. Effectivement, en gastro-entérologie les symptômes sont souvent assez similaires d une pathologie à l autre (diarrhées, constipations, douleurs abdominales, vomissements, spasmes ) et le diagnostic est parfois difficile sans l aide de biomarqueurs précis et spécifiques d une pathologie. Dans l avenir, une fois que notre kit de diagnostic sera mis sur le marché après marquage CE, nous travaillerons sur la recherche de biomarqueurs présentant une spécificité et une sensibilité encore plus importante, ou nous chercherons à améliorer la spécificité et la sensibilité de notre kit en utilisant toujours le 15-HETE. Notre objectif est de faire évoluer la façon de diagnostiquer la maladie de Crohn et d universaliser le diagnostic par kit ELISA à l aide de biomarqueurs afin d éviter au maximum les méthodes invasives.
7 7 REFERENCES [1] Collégiale des universitaires en hépato-gastro-entérologie, Les maladies inflammatoires chroniques de l intestin chez l adulte et l enfant, Hépato-gastroentérologie Chirurgie digestive, Elsevier Masson, p , [2] F.Carbonnel, Maladie de Crohn, La revue du praticien médecine générale, Publication n 818, [3] M.Neunlist, Les acides gras, essentiels au système nerveux de l intestin (aussi), INSERM, 2015.
8 8 ANNEXE Protocole kit ELISA : La première étape appelée "coating" de l'antigène : Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4 C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage. La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser : On incube à 37 C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage. La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection : On incube à 37 C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grâce à l'apparition d'une coloration. La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés : On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps recherché. Contact principal : TREMINIO Clémence Coordonnées : Laboratoire de Biologie Moléculaire, EBI, c.treminio@hubebi.com
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