Analyse mycologique des blés et des farines

Dimension: px

Commencer à balayer dès la page:

Download "Analyse mycologique des blés et des farines"

Caroline Émond
il y a 6 ans
Total affichages :

1 Analyse mycologique des blés et des farines Objet : L objet de cette note technique est de décrire la méthodologie à suivre pour évaluer la contamination des grains de blé et des farines par les moisissures, qui constituent les micro-organismes les plus significatifs, les seuls à pouvoir représenter un danger réel dans les conditions habituelles d activité de l eau de ces produits (altération des propriétés organoleptiques, accumulation de mycotoxines). Cette note comporte 3 parties : - la numération des propagules de moisissures dans une farine ; - la recherche, dans les grains de céréales, de moisissures susceptibles de représenter un danger ; - l identification des 3 genres de moisissures les plus importants en matière de toxinogenèse dans les céréales : Aspergillus, Penicillium et Fusarium. 1- Numération des propagules de moisissures dans les farines 1.1- Principe Les moisissures se trouvent sous différentes formes susceptibles de donner naissance à un nouveau mycelium dans les milieux de culture favorables : spores de toutes sortes, fragments de filament, touffes de filaments, etc. Chacun de ces éléments est une unité de propagation ou propagule. Cette technique consiste à suspendre une quantité donnée de farine dans un milieu liquide dispersant, à ensemencer des dilutions successives de cette suspension mère dans un milieu nutritif gélosé favorable puis, après incubation, à compter le nombre de «thalles» qui proviennent, en principe, chacun d un propagule Mode opératoire - Bien homogénéiser l échantillon de farine avant de commencer l analyse ; - Dans un récipient stérile, peser aseptiquement 1g de cette farine ;

2 - Ajouter 9ml d eau physiologique stérile (8,5 g de NaCl/l) à 0,1% de tween 80 (le rôle du tween est de favoriser la dispersion des spores) : 1ml de cette suspension mère représente 0,1g de farine; - Agiter fortement ; - Procéder à une série de dilutions décimales de la suspension mère dans des tubes à essais contenant 9 ml d eau physiologique stérile au tween 80 (le nombre de dilutions dépendra de la charge présumée de la farine en moisissures) ; - Dans une série de boîtes de Petri, répartir 1ml de chacune des dilutions préparées précédemment ; - Couler aseptiquement dans chaque boîte 15 à 20 ml de milieu gélosé stérile ramené à C, puis bien homogénéiser : les milieux utilisés sont le milieu de Sabouraud Agar, le milieu MEA (Malt Extract Agar) ou le Czapeck-Dox Agar ; - Après solidification, incuber les boîtes 6j à 25 C ou 4j à 30 C ; - Compter les «thalles» dans chacune des boîtes et ramener le nombre trouvé au gramme de farine en tenant compte des dilutions opérées (ne pas retenir les boîtes où les «thalles» se touchent trop). 2- Recherche de moisissures potentiellement dangereuses sur les grains de céréales 2.1- Principe Un grain de céréale peut porter de nombreuses spores de moisissures qui, tout en étant nombreuses, ne représentent aucun danger, ni pour la stabilité du produit au stockage, ni pour la santé du consommateur. Les espèces réellement dangereuses sont celles capables de se développer sur les grains dans les conditions de stockage habituelles. Dans le blé, elles commencent généralement leur développement au niveau du sillon. Pour les mettre en évidence, il faut débarrasser le grain des espèces sans intérêt qui accompagnent normalement les poussières de surface. Si elles n étaient pas enlevées, ces moisissures sans intérêt gêneraient, par leur croissance rapide dans les milieux de laboratoire, le développement des espèces dangereuses.

3 Cette manipulation consiste à laver soigneusement les grains de leurs poussières de surface pour enlever les moisissures sans intérêt, puis à disposer les grains à la surface d un milieu nutritif gélosé approprié dans des boîtes de Petri et, après incubation, à observer le développement éventuel de moisissures, puis à les isoler pour étude et identification éventuelle Mode opératoire - Prélever aseptiquement quelques grains de la céréale à étudier ; - Les placer dans un flacon contenant de l alcool à 76 ou de l eau physiologique stérile et agiter légèrement pour débarrasser les grains de leurs moisissures de surface sans intérêt (en cas d utilisation d alcool, repasser les grains rapidement dans de l eau distillée ou de l eau physiologique stériles sans agitation pour supprimer les restes d alcool) ; - Disposer 4 à 5 grains à l aide de pinces stériles à la surface d un milieu gélosé dans une boîte de Petri, de préférence le sillon vers le bas ; - Incuber comme précédemment ; - Observer le développement éventuel de moisissures partant des grains : on peut regarder les boîtes toutes les 24 heures à partir du 2 ème jour ; - Repiquer et purifier les souches en boîte de Petri par les techniques microbiologiques classiques en vue de l identification et/ou la conservation. 3- Identification des principaux genres de moisissures 3.1- Principe Les 3 principaux genres de moisissures qui comportent des espèces dangereuses pour la stabilité des céréales et de leurs dérivés au stockage et/ou pour la santé du consommateur sont Aspergillus, Penicillium et Fusarium. L identification de ces 3 genres repose essentiellement sur l observation microscopique de leurs cultures ou de prélèvements de cultures. Il s agit notamment de noter : - la nature cloisonnée ou non des filaments végétatifs ; - la forme et le cloisonnement éventuel du conidiophore ; - la forme spécifique de la tête conidienne ;

4 - la forme, la taille et le caractère unicellulaire ou pluricellulaire des conidies ; - d autres aspects spécifiques à chaque genre Modes opératoires Plusieurs techniques peuvent être proposées pour observer les moisissures en vue d une identification ; nous en présentons quelques-unes Observations des cultures in situ dans une boîte de Petri. Les «thalles» de moisissures sont observés directement en plaçant la boîte de Petri qui les contient sous l objectif du microscope. Les parties périphériques des «thalles», peu denses, sont plus propices à une bonne observation. Les avantages de cette technique sont sa simplicité, d une part, et la possibilité de regarder les structures intactes de la moisissure, d autre part. Son principal inconvénient réside dans le fait qu on ne peut généralement pas passer à des forts grossissements Observations de cultures sur lames Des lames porte-objets préalablement stérilisées reçoivent un petit volume d un milieu gélosé approprié, qui est soigneusement étalé en une couche mince, puis ensemencé par touche centrale avec la souche à identifier. Les lames sont placées à l intérieur de boîtes de Petri vides stériles, avec un peu de coton imbibé d eau pour éviter la déshydratation du milieu, puis incubées à C. Quand le développement de la moisissure est jugé suffisant, on place la lame sous l objectif du microscope et on observe. Par rapport à la technique précédente, celle-ci permet de plus forts grossissements, mais elle nécessite la culture préalable sur lame Technique du scotch Appliquer une bande de scotch sur la partie à prélever d un «thalle», puis coller la bande sur une lame porte-objets et observer.

5 Également simple et pratique, cette technique présente néanmoins l inconvénient de souvent briser les structures de la moisissure au cours du prélèvement Observation entre lame et lamelle. Une goutte d eau est déposée sur une lame porte-objets. On prélève, à l aide d un stylet (ou d une lame de rasoir), une fraction suffisante (mais la plus fine possible) d une culture sur milieu gélosé de la souche à étudier et on la dépose dans la goutte d eau. Ensuite, avant d observer, on recouvre délicatement le prélèvement d une lamelle, sans trop écraser le mycelium et sans laisser de bulles d air entre la lame et la lamelle. Le principal inconvénient de cette technique est que les spores ont tendance à se disperser dans l eau, ce qui défait les têtes conidiennes. Remarque : pour améliorer la qualité de l observation, on peut ajouter dans l eau du «bleu coton» Résultats Genre Penicillium

6 Genre Fusarium Genre Aspergillus

Documents pareils

Test d immunofluorescence (IF)

Test d immunofluorescence (IF) 1.1 Prélèvement du cerveau et échantillonnage Avant toute manipulation, il est fondamental de s assurer que tout le personnel en contact avec un échantillon suspect soit