Les différents niveaux de contrôle génétique. Approches des processus épigénétiques I. Annie Sainsard-Chanet

Transcription

1 Les différents niveaux de contrôle génétique Approches des processus épigénétiques I Annie Sainsard-Chanet

2 Modéle de régulation des gènes repose sur la spécificité des facteurs de transcription (activateurs et répresseurs) DNA Binding Domain Activation Domain

3 Il doit exister d autres niveaux de régulation A partir d un œuf, pourquoi certaines cellules se différencient-elles en cellules musculaires, cellules nerveuses, cellules épithéliales? Au cours du développement, des centaines de milliers de gènes sont régulés simultanément pour permettre la différenciation cellulaire

4 Le contrôle épigénétique 1ère définition en 1942 de C. Waddington : «Etude des processus par lesquels le génotype, l ensemble des gènes en interaction avec l environnement, engendre le phénotype» définition moderne: Holliday, Science 1987, Dev Gen 1994 Russo, Martienssen et Riggs, 1996 (in Epigenetic regulation of gene expression, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) «changements dans l expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou la méiose, et qui ne résultent pas de modifications de la séquence de l ADN»

5 Hérédité «génétique» Basée sur des changements de l information génétique ou mutations: modification d une séquence d ADN Changements stables, transmissibles en mitose et en méiose, irréversibles Hérédité «épigénétique» Basée sur des changements de l expression génique, stables, héréditaires (transmis à travers les générations mitotiquesdifférenciation cellulaire et développement embryonnaire- et parfois méiotiques), qui ne reposent pas sur des modifications de la séquence primaire d acides nucléiques Changements le plus souvent réversibles Ces modifications peuvent se produire spontanément, en réponse à l environnement, en réponse à la présence d un allèle donné même si celui ci n est plus présent dans les descendants

6 Hérédité épigénétique: Toute hérédité qui ne repose pas sur la transmission de la séquence primaire de l ADN Mécanismes épigénétiques: Très variés

7 Processus épigénétiques très variés connus chez microorganismes, nématode, insectes végétaux, animaux jouent un rôle fondamental développement embryonnaire apparition et développement de certains cancers empreinte parentale compensation de dose et inactivation de l X systèmes de défense contre virus et éléments mobiles chez plantes maladies à prions.

8 Processus épigénétiques reposent sur mécanismes variés et agissent à tous les niveaux de régulation - régulation au niveau transcriptionnel: Changements dans la structure de la chromatine: Modifications de la méthylation de l ADN et de la structure des histones: hérédité chromatinienne. Cette régulation au niveau transcriptionnel = TGS (transcriptional gene silencing) - régulation au niveau post-transcriptionnel: fondée sur des ARN (non messagers: sirnas (small interfering RNA), microarns. RNA interférence, quelling, PTGS - régulation au niveau traductionnel: Rôle de petits ARN: mirnas - régulation au niveau post traductionnel: prion, changement de la structure d une protéine cellulaire avec propriété de l isoforme modifiée (prion) de transformer l isoforme cellulaire en prion - boucles de rétroaction, mise en route d un réseau métabolique auto entretenu - hérédité de structure

9 A- Régulation au niveau transcriptionnel : Hérédité chromatinienne Hérédité chromatinienne: modifications héritables de la structure de la chromatine Modifications: au niveau de l ADN: méthylation au niveau de la structure de la chromatine: modifications post traductionnelles des histones (acétylation, phosphorylation, méthylation, ubiquitination, poly-adp ribosylation) incorporation de protéines chromatiniennes non-histones (HMG) peuvent affecter le repliement du nucléofilament incorporation de chaperons d histones, de facteurs de remodelage rôle de petits ARNs non codants

10

11 La méthylation de l ADN : une marque épigénétique Méthylation inexistante chez S. cerevisiae, C. elegans Complexe chez les plantes Chez les mammifères, la méthylation de l ADN ne s effectue que sur les Cytosines des doublets CpG (Chez bactéries: sur G et A) NH2 DNMT NH2 N H ADN méthyltransférase N CH 3 O N O N cytosine 5 méthyl-cytosine

12 La méthylation de l ADN : une marque épigénétique Chez mammifères, la méthylation a lieu au niveau de dinucléotides CpG 5' 3' m m ATCGTATCACG TAGCATAGTGC m m Réplication méthylation de novo DNMT3a, 3b 3' 5' 5' 3' 5' 3' m m ATCGTATCACG TAGCATAGTGC 3' 5' ATCGTATCACG 3' 5' TAGCATAGTGC m m méthylation de maintenance DNMT1 5' 3' 5' 3' m m ATCGTATCACG TAGCATAGTGC m m m m ATCGTATCACG TAGCATAGTGC m m 3' 5' 3' 5' ADN méthylé sur les deux brins ADN hémi-méthylé ADN méthylé sur les deux brins 2 types de DNMT: les DNMTs qui assurent la maintenance les DNMTs qui assurent la méthylation de novo (établissement des profils de méthylation durant le développement précoce) Grâce à la symétrie des CG et aux DNMT de maintenance qui reconnaissent l asymétrie de méthylation: méthylation des C est une marque héritable

13

14 Mutants d ADN-méthyltransférase chez les mammifères Souris Ddnmt1, Ddnmt3a et b: Déficit global en méthylation génomique mort embryonnaire et sévères défauts de développement, Les DNA Methyltransférases sont essentielles pour le développement Homme dnmt3b: Défaut de méthylation des séquences d ADN satellite syndrome ICF: Immunodéficience, instabilité Centromérique, anomalies Faciales), première maladie génétique directement associée à un défaut constitutif de méthylation de l ADN: les profils de méthylation, effacés au cours de la période préimplantatoire normale, sont rétablis de façon spécifique au début de la gastrulation. Chez les patients ICF cette vague de méthylation de novo est défaillante.

15 La méthylation de l ADN se répercute sur des modifications des histones et est associée le plus souvent à une compaction des nucléosomes et une répression transcriptionnelle

16 La méthylation de l ADN est une marque épigénétique de répression transcriptionnelle

17 Les îlots CpG chez les mammifères Régions de quelques centaines de pb qui présentent une forte densité en dinucléotides CpG Les îlots CpG ne sont pas répartis au hasard dans les génomes mais se trouvent préférentiellement dans les régions promotrices en amont des gènes. Environ la moitié des gènes humains contiennent des îlots CpG dans la région des promoteurs. Ces séquences recrutent des complexes responsables de modifications de la chromatine bloquant l initiation de la transcription

18 Méthylation et cancer Les ilôts CpG méthylés dans tissus normaux sont hypométhylés Dans certains cancers: hyperméthylation sélective de ces ilôts conduit au «silencing» de gènes suppresseurs de tumeurs, de gènes impliqués dans le cycle cellulaire, dans la réparation de l ADN, dans l apoptose Ailleurs dans le gènome: Hypométhylation générale augmente avec l âge et dans cellules cancéreuses entrainant une perte de méthylation de séquences répétées (éléments transposables, virus) et un risque accru d instabilité génétique.

19 Comment connaître le pattern de méthylation de l ADN 1) profil de digestion comparé entre isoschizomères sensibles ou insensibles à la méthylation Promoteur BRCA1 de cellules cancéreuses: digestion par l enzyme HpaII (methylcytosine-sensible) ou par son isoschizomere MspI (methyl-insensible) MspI HpaII CCGG GGCC Dans les cellules cancéreuses, le promoteur BRCA1 est hyperméthylé

20 2) séquençage après traitement au bisulfite

21

22

23 Autres marques épigénétiques Les modifications des histones :

24 Chromatine : constitue le support de l'information génétique. C'est une structure complexe constituée d'adn et de protéines, localisée dans le noyau cellulaire. Nucléosome : est l'unité fondamentale de la chromatine. Il est composé d'adn et d'histones. Il constitue le premier niveau de compaction de l'adn dans le noyau. Histones: Pièces maitresses de la compaction de l ADN en chromatine, jouent un rôle majeur dans la régulation Euchromatine : représente la chromatine qui apparaît décondensée pendant l'interphase. Structure active de la chromatine Hétérochromatine : représente la forme condensée de la chromatine qui ne change pas d'état au cours du cycle cellulaire. Structure inactive de la chromatine Hétérochromatine constitutive : est formée principalement de séquences répétées et contient peu de gènes. Elle est généralement concentrée dans des régions situées à proximité des centromères et des télomères. Hétérochromatine facultative : contient des régions codantes pouvant adopter les caractéristiques structurale et fonctionnelle de l'hétérochromatine.

25 X 6 X 40 X 1000 euchromatine X hétérochromatine 2 m d ADN dans un noyau de 5 microns

26 Nucleosome Contains a nucleosome core particle 146 base pairs of supercoiled DNA Around a core of eight histone molecules Histone core Two copies of H2A, H2B, H3 and H4 Octamer H1 resides outside of core Linker histone Binds to linker DNA Connecting one nucleosome core particle to next

27

28 La chromatine 10,000 nm 11 nm 30nm Fibre de 11 nm («collier de perles») 1kb : 55 nm 1kb : 333 nm Fibre de 30 nm 1kb : 17 nm 2 mètres d ADN dans le noyau d une cellule humaine ou de maïs (Adapté de : Waterborg s chromatin homepage)

29 Histone Deacetylases Chromatin Remodeling Factors Histone Acetylases Chromatin Remodeling Factors

30 L état de la chromatine (euchromatine/hétérochromatine)dépend largement de modifications chimiques des histones Schématiquement l hétérochromatine est hypoacétylée et hypermytélée, l euchromatine est hyperacétylée et hypométhylée

31 LE NUCLEOSOME Modifications post traductionnelles des histones (acétylation, phosphorylation, méthylation, ubiquitination) fournissent un répertoire de marques épigénétiques héritables et réversibles: elles contrôlent l état de compaction de la chromatine: Hypothèse du code des histones

32 Principales enzymes de modifications de la chromatine: HAT : Histone Acétyl-Transférases HDAC : Histone Dé-Acétylases HMT : Histone Méthyl-Transférases Complexes de remodelage

33

34 Interrelations régulatrices entre les différentes modifications des histones Chaque modification d histones peut en influencer d autres.

35 Liens méthylation de l ADN et modifications des histones HMT MBD HDAC

36 Code des histones: Transformation de l information codée par les modifications d histones en une réponse contrôlant l expression génique Les modifications chimiques des histones (méthylation, acétylation de certaines Lys, phosphorylation de certaines Ser) serait "lues" par des protéines ou complexes protéiques capables de reconnaître et d'interpréter des profils de modifications spécifiques entrainant un état de compaction donné de la Chromatine Les modifications chimiques des histones serviraient à recruter des protéines régulant la structure de la chromatine Plusieurs milliers de combinaisons de modifications possibles pour 1 histone donnée

37 Plusieurs milliers de combinaisons de modifications possibles pour 1 histone donnée Une combinaison particulière de modifications d histones correspondrait à un état chromatinien particulier.. chromatin states vary from cell to cell type and along chromosomes. The epigenome refers to these states at the whole genome level. Typically, a multi-cellular organism will be characterized by one genome, but by as many epigenomes as there are cell types.

38 «Code épigénétique» Régions actives: hyperacétylation des histones Interconnections entre marqueurs épigénétiques de l hétérochromatine La modification d un site peut influencer la modification d un autre site Possibilités de changements rapides et réversibles en réponse à des signaux externes tels stress

39 Ac -acetylated histones H3 Lys9 CpG-Me -methylated Cytosine HDAC -histone deacetylases DNMT -DNA methyltransferase HMT-histone methyltransferase MBD -methylated DNA binding domain HDAC deacetylates lysine residues as the prerequisite for methylation HP1 protein recognizes MeK9, binds also HMT and heterochromatin can spread

40 Code génétique et code des histones Code épigénétique serait décrypté par une pléiade de protéines effectrices qui reconnaissent les modifications des histones et conduisent à une compaction donnée de la chromatine. Ces marques épigénétiques (transmissibles et réversibles) peuvent s étaler sur de très grandes distances permettant la co-régulation de plusieurs gènes.

41 Chromatine transcriptionnellement active: ADN non méthylé, histones acéthylées Chromatine transcriptionnellement inactive: ADN méthylé, histones déacéthylées

42 Hérédité chromatinienne au cours du développement Le développement des animaux, repose en partie au moins sur des processus épigénétiques fondés sur la mémoire chromatinienne. - Empreinte parentale chez les animaux - Inactivation aléatoire de l un des deux chromosomes X chez les mammifères femelles

43 Empreinte parentale chez les mammifères: marquage épigénétique différenciant les gènes selon leur origine parentale Contrairement à la grande majorité des gènes qui s expriment à partir des 2 allèles, les gènes soumis à empreinte parentale s expriment de façon monallèlique, soit à partir de l allèle paternel soit à partir de l allèle maternel

44 Pour un gène soumis à l empreinte parentale, l allèle exprimé dépend de l origine parentale du chromosome qui le porte. Marquage différentiel des chromosomes parentaux au cours de la gamétogenèse. Le marquage est stable au cours des divisions mitotiques

45 Contributions parentales non-equivalentes Bardot = mère ânesse, père cheval Mulet = Mère jument, père âne

46

47 Phénomène de l empreinte découvert grâce à 3 types d observations: Des embryons monoparentaux (gynogénotes/parthénogénotes, andrénogénotes) de souris sont inviables Des souris porteuses de certaines disomies maternelles ou paternelles présentent des défauts de développement Un certain nombre de pathologies humaines ou malformations sont préférentiellement transmises par le père ou la mère Hypothèse: L allèle paternel et maternel de certains gènes ne s exprimeraient pas de façon identique au cours du développement

48 Chez les mammifères, la présence simultanée d un génome d origine paternelle et un génome d origine maternelle est nécessaire au développement de l embryon Si l on échange entre eux 2 pronoyaux mâles, on obtient des embryons viables à génome biparental (5 et 6) L échange du pronoyau femelle d un œuf fécondé (1) avec le pronoyau male d un autre œuf fécondé (2) donne des embryons 2n uniparentaux (3) et (4) non viables.

49 Transplantation des pronoyaux et Développement post implantatoire Gynogénotes: embryons obtenus par retrait, après fécondation, du pronoyau mâle: génome d origine uniquement maternel: Début de développement des tissus embryonnaires mais pas des annexes embryonnaires: le zygote n est pas viable Androgénotes: embryons obtenus par retrait, après fécondation, du pronoyau femelle: génome d origine uniquement paternel: Début de développement des annexes embryonnaires mais pas des tissus embryonnaires: le zygote n est pas viable

50 Rôle complémentaire des génomes haploïdes paternel et maternel Présence simultanée d un génome d origine paternelle et d un génome d origine maternelle est indispensable au développement normal de l embryon Les génomes parentaux sont donc fonctionnellement différents bien qu ils contiennent une information génétique globalement identique ils sont porteurs d une empreinte différentielle qui leur a été apposée avant la formation des pronoyaux dans le zygote

51 Le phénomène de l empreinte parentale suppose la réversibilité de celle ci Les empreintes de l allèle maternel du mâle A doivent être effacées, et une empreinte doit être ajoutée à l allèle paternel de la femelle B afin que toutes les F1 possèdent un allèle paternel actif et un allèle maternel inactif Empreinte (méthylation de novo) apposée durant la gamétogenèse mâle et femelle Avant cet établissement dans la lignée germinale, les empreintes des parents sont effacées et les nouvelles empreintes sont établies selon le sexe de l embryon Cet effacement a lieu dans les lignées germinales primordiales (cellules précurseurs des cellules germinales) s effectue par perte de méthylation de l ADN

52

53

54

55

56 - Caractéristiques des gènes soumis à l empreinte: Expression monoallélique stable au cours des divisions cellulaires réversible à la méïose Regroupement des gènes en clusters (4 Mb) Méthylation différentielle des dinucléotides CpG entre les 2 allèles au niveau d éléments de contrôle: DMR (differentially methylated regions), l allèle méthylé: non exprimé DNMT3A et 3B responsables de la méthylation de novo DNMT1 responsable du maintien de la méthylation au cours des divisions cellulaires (des souris délétées DNMT1 -/- sont inviables) Les motifs de méthylations de l ADN entrainent des modifications de la chromatine Différences de la structure de la chromatine des deux allèles Nombre de gènes soumis à empreinte connus chez l homme: 60 Estimation : entre 100 et 1000 gènes

57 Différences de la structure de la chromatine des deux allèles: méthylation différentielle de l ADN des deux allèles acétylation et méthylation différentielle des histones des deux allèles

58 Deux maladies dues à des mutations localisées dans une région soumise à l EP

59

60

61

62 Empreinte parentale IC PW AS Allèle maternel IC Allèle paternel Gènes NON exprimés, méthylés Gènes exprimés, NON méthylés

63 Rôle biologique de l empreinte parentale? Guerre des sexes? («théorie du conflit d intérêt reproductif») Les gènes hérités du père tendraient à favoriser la croissance de l embryon augmentant les chances de transmettre les gènes du père Les gènes hérités de la mère tendraient à limiter la croissance de l embryon afin de ne pas compromettre la survie de la mère et de l ensemble de sa descendance

64 COMPENSATION DE DOSE ENTRE LES CHROMOSOMES SEXUELS : AU MOINS TROIS MANIERES DE FAIRE... Mammifères Drosophile C. elegans Femelles : Males : Femelles : Inactivation d un des deux chromosomes X transcription du seul chromosome X transcription des deux chromosomes X (Xi) X X X X X Y X Y X Y ou X O From E. Heard Chez l homme: Chromosome X: 905 gènes, Chromosome Y: 96 gènes

65 Découverte de l inactivation du chromosome X Le locus Mottled (Mo) sur le X Femelles, pelage bigarré Mâles, pelage uniforme From E. Heard

66 L inactivation du chromosome X chez les femelles mammifères Chatte hétérozygote pour une mutation sur le chromosome X XGFP Y XGFP X Xao Xib XaGFP Xi Xio Xab XiGFP Xa mosaïque Xao Xib Inactivation aléatoire (embryon précoce) Xio Xab Transmission clonale (cellules somatiques)

67 Cycle d inactivation du chromosome X From E. Heard

68 L INACTIVATION DU CHROMOSOME X Exemple classique de régulation épigénétique à l échelle d un chromosome entier. Traitement différentiel de deux chromosomes homologues dans un même noyau. Transition euchromatine heterochromatine en quelques divisions cellulaires au cours du développement précoce. Une fois établi, l état inactif est hautement stable et hérité de façon clonale (réactivation < 10-9 sauf cas particuliers: certains cancers, vieillissement?)

69 Comment est initié le processus d inactivation de l X? Comment touche t il l ensemble du chromosome? Comment est il maintenu?

70 Les Cellules Souches Embryonnaires (ES) : Système Modèle pour l Etude de L inactivation du Chromosome X Female embryo Embryon femelle Embryonic stem (ES) cells Cellules ES Les Both deux X chromosomes X sont active actifs In vitro differentiation Differenciation in vitro From E. Heard Inactivation aléatoire d un chromsome X Inactive X chromosome

71 Xic transcrit en un ARN non codant: Xist From H. Heard and P. Avner,1994, review

72 Inactivation en cis P1 P2 L ARN Xist ( X-Inactive-Specific-Transcript ) A F B C D E - Transcrit nucléaire de nucléotides - Transcrit non codant - Exprimé à partir des 2 X très brièvement puis exprimé uniquement à partir du X inactif (expression monoallélique de Xist) - Produit en grande quantité, l ARN Xist décore le chromosome X inactif - Environ transcrits de Xist/noyau FISH: Fluorescent In Situ Hybridization: Système couplé anticorps/fluophore

73 Comment Xist amorce t il l inactivation du chromosome X entier?

74

75 Xa Modifications des histones sur le chromosome X Me2 Ac Me2 Me ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSA Ac Ac Ac Ac H3 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT... H Xi ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSA H3 Me2 (Me3) Me3 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT... H Me2 * SGRGKQGCKARKAKTRSS * cell cycle regulated? Me1 * H2A Ub1 VLLPKKTESHHKAKGK 119

76 Marques de l X inactif Méthylation de la Lys27 de H3 Hypométhylation de la Lys4 de H3

77 Dolly: introduction d un noyau remis à zéro d une d une cellule différenciée dans un ovule énucléé 1996 Carbon Copy le 1er chat cloné (2004) présente une fourrure différente de celle de sa mère Hérédité épigénétique: Même génotype - phénotype différent Différences entre jumeaux!! Un lot de clones.

78 Fraga et al, PNAS, 2005

79 Epigénétique et maladies

80