Stratégies de purification de complexes supramoléculaires

Transcription

1 Stratégies de purification de complexes supramoléculaires Electrophorèse Purification par affinité en tandem : TAP-tag

2 Electrophorèse des protéines Conditions dénaturantes (SDS-PAGE) Conditions «natives (CN et BN-PAGE)

3 Electrophorèse des Protéines En conditions dénaturantes sur gel 1D de polyacrylamide (SDS PAGE) : migration proportionnelle à la taille (nb charges /unité de longueur) Le gel 2D (pi = première dimension) permet de visualiser des différences de migration dues à des modifications post-traductionnelles (phosphorylation) Estimation de taille et de pureté Possibilité de séparation en conditions natives

4 Gels 2D Expression différentielle Tissu sain Tissu cancéreux 1-3: expression augmentée dans le tissu cancéreux 4-11: expression diminuée dans le tissu cancéreux

5 Cas de complexes non caractérisés Séparation à deux dimensions du complexe supramoléculaire en électrophorèse Applications : * complexes chez E. coli et Pseudomonas aeruginosa * complexe des deshydrogénases à NADH de la membrane mitochondriale interne chez S. cerevisiae

6 Blue Native / SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN/SDS-PAGE

7 BN/SDS-PAGE : Principe Séparation à deux dimensions par électrophorèse : Méthode «native» en première dimension (le colorant apporte les charges pour la migration) En conditions dissociantes en seconde dimension puis Analyse protéomique par LC-MS/MS

8 SDS-PAGE Les protéines membres d un même complexe co-migrent dans la première dimension et les spots correspondants sont de forme similaire, alignés dans la seconde dimension. Cas A : protéines non impliquées dans un complexe trouvées sur l hyperbole (courbe en pointillés) Cas B : protéines impliquées dans un complexe homo-multimérique. Pas de spots de forme similaire alignés sur une verticale Cas C: protéines impliquées dans un complexe hétéro-multimérique. Spots de forme similaire alignés sur une même verticale BN/SDS-PAGE BN-PAGE Crédit : Marc Bonneu, CGFB

9 BN/SDS-PAGE Les principaux complexes protéiques d E. coli ont été séparés par 2-D BN/SDS- PAGE et identifiés par LC-MS/MS après clivage protéolytique in gel : 306 complexes répartis en : - 50 hétéro-multimériques homo-multimériques

10 BN-PAGE/Protein Correlation Profiling Total Protein Extract Desalting Separation of complexes by BN-PAGE Gel slicing (40 pieces) In-gel Proteolysis LC-MS/MS analysis

11 Application à Pseudomonas aeruginosa 4-12% 7-12% 7-18% 667 KDa 667 KDa 443 KDa 667 KDa 443 KDa 7-18% 7-12% KDa KDa % 150 KDa 150 KDa 998 protéines identifiées par 3 peptides au moins S. Vilain et al. - Congrès EUPA 2013

12 PCP Dans la fraction 10 du gel 4-12%, 5 protéines présentent la même distribution sur le gel BN-PAGE

13 Complexe incluant les NADH deshydrogénases de la membrane mitochondriale (1 int. et 2 ext.) chez S. cerevisiae Membranes Mitochondriales Electrophorèse «native» SDS-PAGE Test d activité Clivage protéolytique in gel MS et (LC)-MS/MS Identifications

14 Analyse d un mélange de protéines après électrophorèse 1D et clivage protéolytique Intens. x10 9 1,2 G 2197,24 1,0 H 2496,32 0,8 0,6 0,4 0,2 1611, ,72 H G G H F, G H 1833,98 H F F H 2013, , ,47 G G 2706,40 H 2872,48 F F G 3452,48 G 0, m/z

15 Analyse de complexes supramoléculaires Complexe des NADH déshydrogénases mitochondriales de levure : 38 protéines Implication de plusieurs ORFs Logique de l assemblage Déshydrogéna ses externes CYB2 DLD1 NDE1 NDE2 GUT2 SDH1 FUM1 MDH1 IDH2 CIT1 NDI1 Cycle des acides trica rboxyliques ALD7 YLR 089C YOR 356W PUT2 YPR 004C Métabolisme des acides aminés HSP60 ATP1 MRF1 Grandier-Vazeille et al. Biochemistry, 40, 2001,

16 Tandem Affinity Purification TAP -tag

17 Stratégie d analyse des complexes multiprotéiques d une cellule Stratégie élaborée pour purifier des centaines ou milliers de protéines Construction d une chimère entre la protéine d intérêt et deux étiquettes pour la chromatographie d affinité Robustesse et fiabilité Gavin et al., Nature 415, 2002,

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19 La robustesse et la fiabilité sont acquises par l utilisation de plusieurs points d entrée (hameçons) différents (indiqués par des flèches sur les gels SDS-PAGE)

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21 Caenorhabditis elegans interactome map, showing 5,500 protein interactions among 3,000 proteins N Blow Systems biology: Untangling the protein web Nature 460, (2009)

22 Discussion / TAP-Tag Première stratégie de caractérisation de complexes multiprotéiques à l échelle d un protéome Chaque complexe requiert un ajustement des conditions chromatographiques Aumoins l une des étiquettes est de grande taille et peut affecter l assemblage de certains complexes Aucune information sur la stœchiométrie

23 Objectifs?