L3 BCP, GENETIQUE-TD. Exercice H1. Tous les exercices doivent être préparés avant les TD.

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1 L3 BCP, GENETIQUE-TD Tous les exercices doivent être préparés avant les TD. Le cours de génétique reprend les bases des enseignements de génétique de L1 ou L2. Pour suivre correctement les cours assurez-vous d avoir les notions minimales requises. Exercice H1 Un biologiste veut approfondir l'étude de la voie de biosynthèse de l'orotidylate (O) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Un biochimiste a déjà identifié 5 précurseurs potentiels de l'orotidylate qu'il distingue par les lettres (Z), (R), (D), (U) et (E). -Comment peut-il envisager ses expériences en utilisant une approche génétique? Le biologiste utilise comme souche sauvage [+] une cellule haploïde de levure [O + ] capable de se multiplier dans un milieu Minimum (Min) dépourvu d'o. A partir de cette souche de référence il isole de manière indépendante 9 mutants qui nécessitent la présence d'o pour croître (milieu Min+O). Ces 9 mutants d'auxotrophie [O - ] sont nommés de O 1 à O 9. 1) Le biologiste réalise alors 5 tests de croissance au cours desquels il remplace par l'un des 5 précurseurs potentiels la supplémentation d'o du milieu. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. -A partir de ces résultats, ordonnez les précurseurs de l'orotidylate dans une voie métabolique en précisant l'identité de l'étape bloquée pour chaque mutant. Tableau 1 : croissance = +, absence de croissance = - Souche Min Min+O Min+Z Min+R Min+D Min+U Min+E [+] O O O O O O O O O ) Par la suite, le biologiste réalise un test de complémentation fonctionnelle avec les mutants O 3, O 5, O 7, O 8 et O 9. Le tableau 2 rapporte les phénotypes des diploïdes obtenus lors des croisements des mutants avec la souche [+] et des mutants entre eux. -Quelles informations apportent un test de complémentation fonctionnelle? Justifiez le choix des mutants étudiés. -Interprétez les résultats de ce tableau en regroupant les 5 mutants analysés en groupes de complémentation fonctionnelle. -Quelle est la particularité du mutant O 7? Tableau 2 : + et - correspondent respectivement aux phénotypes [O + ] et [O - ] [+] O 3 O 5 O 7 O 8 O 9 O O O O O ) Pour finir, le biologiste analyse la méiose du diploïde obtenu précédemment lors du croisement O 7 x [+]. Sur les 1000 spores analysées en vrac, seules 400 spores s'avèrent être prototrophes pour l'orotidylate. -Comment appelle-t-on ce test? Que pouvez-vous conclure de ce résultat (préciser au maximum votre réponse)? 4) En tenant compte de l'ensemble des résultats, -Indiquez, en le justifiant, le nombre minimum de gènes impliqués dans la biosynthèse de l'orotidylate. 1/5

2 Exercice H2 Après des mutagenèses effectuées sur deux souches sauvages haploïdes de la levure Saccharomyces cerevisiae, l'une de signe sexuel a (souche A) et l'autre de signe a (souche B), on a obtenu 15 mutants auxotrophes pour l'adénine, 8 à partir de la souche A (notés ade1 à ade8) et 7 à partir de la souche B (ade9 à ade15). 1) On croise des mutants [ade - ] de signe sexuel a avec des mutants [ade - ] de signe sexuel a et on examine la croissance des clones diploïdes obtenus sur un milieu dépourvu d'adénine. Les résultats sont présentés sur le tableau ci-dessous : -Que sont les tests réalisés ici et que peuvent-ils donner comme informations respectivement? -Pourquoi avoir réalisé ces tests en parallèle? -D'après ces résultats, à combien estimez-vous le nombre minimum de gènes impliqués dans la biosynthèse de l'adénine chez la levure? +: croissance -: absence de croissance [+] [+] ) On observe que sur milieu complet, le mutant ade2 donne des colonies rouges tandis que les 14 autres mutants [ade - ], et les souches sauvages A et B, donnent des colonies blanches. -Explicitez clairement le phénotype du mutant ade2. Quelles hypothèses d'ordre génétique pouvez-vous proposer pour expliquer ces phénotypes? 3) Dans la descendance méiotique du croisement ade2 x B : les 120 examinées contiennent toutes 2 spores donnant des colonies [ade +, blanche] et 2 spores donnant des colonies [ade -, rouge]. -Comment interprétez-vous ces résultats? -Comment concilier cette information avec les hypothèses que vous avez proposées? Question de cours 1 On cherche à isoler les gènes intervenant dans la voie de biosynthèse de l arginine. Pour décortiquer cette voie, on se propose d utiliser la levure comme système modèle. -Pourquoi choisir la levure? Vous isolez à partir de la souche sauvage S six mutants auxotrophes [arg - ] notés arg1, arg2.. arg6. Sachant que tous les croisements sont possibles, on ne tient pas compte du signe sexuel des levures. -Quelles expériences allez-vous réaliser afin d analyser ces 6 mutants? Après analyse des mutants, on retrouve des résultats montrant que parmi les 6 mutants il y a un mutant dominant et 3 groupes de complémentation, un mutant appartient à deux groupes alors que les autres appartiennent à un seul groupe de complémentation. Il existe plusieurs possibilités de classement des mutants pour obtenir ce résultat. -Choisissez une possibilité et faites le tableau du test de complémentation correspondant à ces résultats. Question de cours 2 Qu est-ce qu un test de ségrégation? Qu est-ce qu un test de complémentation? Quelles informations apportent-ils? Comment les distinguez-vous? 2/5

3 Exercice H3 Soient 3 souches mutantes de levure M1, M2 etm3 auxotrophes pour l adénine [ade - ]. A) Nombre de gènes mutés dans chaque souche : analyses des spores en vrac Dans le but de connaître le déterminisme génétique de l auxotrophie pour l adénine dans cette collection de mutants, les 3 souches mutantes ont été croisées avec une souche S «sauvage» prototrophe pour l adénine. 1) Les levures diploïdes obtenues sont [ade + ]. -Comment s appelle ce test génétique? Quelle information apporte-t-il? 2) Après la sporulation des diploïdes [ade + ], on observe pour chaque croisement une ségrégation dans laquelle la moitié des spores donnent des colonies [ade - ] et l autre moitié des colonies [ade + ]. -Comment s appelle ce test? Que pouvez-vous conclure de ce résultat? -Indiquez les génotypes des souches S, M1, M2, M3 et des différents types de spores obtenues B) Nombre de gènes mutés dans chaque souche : analyses en On reprend les croisements entre la souche S et chacune des souches mutantes pour faire une analyse en. 20 sont analysées pour chacun des croisements. a) Dans les croisements M1 x S et M2x S, les 20 sont formées de «2 spores [ade - ], 2 spores [ade + ]». b) Dans le croisement M3 x S, on trouve 19 formées de «2 spores [ade - ], 2 spores [ade + ]» et 1 tétrade formée de «1 spore [ade + ], 3 spores [ade - ]». -Comment s appellent ces? Que pouvez-vous conclure à partir de leurs nombres respectifs? -Ces résultats modifient-ils la réponse à la question A-2? -Ecrivez le génotype des souches M1, M2, M3, S et des spores composant chaque tétrade. C) Nombre de gènes mis en évidence dans les 3 souches Suite à la modification de leurs signes sexuels, ces trois souches mutantes ont été croisées entre elles : les spores diploïdes obtenues sont [ade + ]. -Comment s appelle ce test? Pourquoi a-t-on fait ces croisements? -Que pouvez-vous conclure de ces résultats? D) Localisation des gènes des souches M1 et M2 les uns par rapport aux autres Le croisement entre M1 et M2 donne après sporulation 950 spores [ade-] et 50 spores [ade+]. -Que pouvez-vous conclure de ce résultat? -Indiquez les génotypes des souches M1 et M2 et des différents types de spores obtenues. -Faites un bilan de l ensemble des informations obtenues dans ce problème. Exercice H4 (extrait du CC 2011) Dans le cadre d un programme génétique on effectue des mutagenèses sur la levure afin d isoler des mutants d auxotrophie. On isole ainsi 8 souches de levure auxotrophes pour l uracile [ura - ] notées m1, m2 m3 m8. On s aperçoit que la souche m8 est également auxotrophe pour l adénine [ade - ] 1. Comment a-t-on isolé les souches [ura - ]? 2. Quelles hypothèses génétiques pouvez-vous formuler pour expliquer le phénotype de la souche m8 [ura -, ade - ]? Comment allez-vous procéder pour les vérifier? On croise la souche m8 avec la souche sauvage, après la méiose le phénotype des spores haploïdes présentes dans les est analysé. On obtient les types et nombre de ci-dessous [ura-, ade-] [ura-, ade-] [ura-, ade+] [ura-, ade-] [ura-, ade+] [ura-, ade+] [ura+, ade+] [ura+, ade+] [ura+, ade-] [ura+, ade+] [ura+, ade-] [ura+, ade-] 3. Quel est le nom de chaque tétrade? Ecrivez le génotype des spores parentales. Quel est celui des spores présentes dans les? Que pouvez-vous conclure? Justifiez clairement votre réponse. 3/5

4 Question de cours 3 Vous isolez à partir d une levure sauvage prototrophe blanche, une levure [ade-, rouge]. 1. Quelles hypothèses génétiques permettent d expliquer les phénotypes de cette levure? On veut cloner le/les gènes révélés dans cette expérience. 2. Comment allez-vous procéder pour isoler le gène à partir d une banque d ADN de levure? 3. Selon les hypothèses posées en 1, qu attendez-vous comme phénotype des levures ayant intégré le plasmide portant le gène impliqué dans ces phénotypes? Exercice H5 (d après le CC 2013) La respiration mitochondriale débute par le cycle de Krebs suivi des réactions dites de phosphorylations oxydatives où un des facteurs clé est le cytochrome c. La quantité de cytochrome c est estimée par spectrométrie et on a montré qu il existe chez S. cerevisiae deux isoformes du cytochrome c: l'iso-1 et l'iso-2 cytochrome c, représentant respectivement 95% et 5% de la quantité totale de cytochrome c chez le sauvage. Dans le but d'identifier les gènes impliqués dans la synthèse du cytochrome c, on a recherché des mutants présentant un déficit en cytochrome c. Ces mutants se développent sur milieu contenant du glucose mais ne peuvent pas métaboliser le lactate [lac-]. Parmi les mutants obtenus, on a montré par spectrophotométrie que le mutant M7 présente très peu de cytochrome c, 5% par comparaison à la souche sauvage A, alors que les mutants mutés pour d autres gènes ont une activité plus importante. Le gène muté dans cette souche M7 a été cloné, analysé et appelé CYC-1. Afin de rechercher d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse du cytochrome c, on a criblé à partir de la souche M7 des révertants capables de pousser sur du milieu contenant du lactate comme seule source de carbone. On a ainsi pu isoler les révertants R1, R2 et R3 de phénotype [lac + ]. 1. Quelles hypothèses génétiques peuvent expliquer l'apparition des révertants? Ces trois lignées sont croisées avec la souche sauvage A, les diploïdes sont de phénotype [lac + ]. La descendance méiotique de ces croisements est donnée dans le tableau suivant 4 [lac+] 3 [lac+] ; 1[lac-] 2 [lac+] ; 2 [lac-] total R1 x A R2 x A R3 x A Que pouvez-vous conclure? Ecrivez le génotype des trois souches révertantes. Pour préciser le mode d'action des suppresseurs présents dans les souches R1 et R2, on les croise avec la souche C de génotype trp1-1 cyc1-1, où cyc1-1 correspond à une délétion du gène CYC-1, et de phénotype [trp -, lac - ]. Les diploïdes issus de ces croisements sont de phénotype [trp +, lac + ]. On analyse la descendance méiotique de ce croisement, d une part au niveau des phénotypes [lac+] / [lac-] et d autre part au niveau des phénotypes [trp+] / [trp-]. a) Etude [lac+] / [lac-] Les observées sont les suivantes : 2 [lac+] ; 2 [lac-] 1 [lac+] ; 3 [lac-] 4 [lac-] total R1 x C R2 x C b) Etude [trp+] / [trp-] Les observées sont les suivantes : 2 [trp+] ; 2 [trp-] 3 [trp+] ; 1 [trp-] 4 [trp+] total R1 x C R2 x C Que pouvez-vous conclure sur le mode d'action des suppresseurs? 4/5

5 Question de cours 4 Des chercheurs ont identifié chez la souris le gène Bop1 codant pour une protéine nucléolaire impliquée dans la maturation des ARN ribosomaux et l assemblage des ribosomes. Par une recherche dans des banques de séquences ils ont identifié un gène homologue chez la levure, noté ERB1, qui a été cloné. Afin de mener une étude fonctionnelle de ERB1 les chercheurs ont construit des levures délétées de ce gène en utilisant une souche diploïde auxotrophe vis à vis de l uracile du fait de la délétion du gène URA3, ura3 / ura3. 1. Expliquez par un schéma comment ces levures ont été obtenues (et sélectionnées) et écrivez leur génotype. Justifiez l emploi de levures diploïdes pour réaliser cette expérience. Les levures diploïdes obtenues sont viables et [ura + ], en revanche leur méiose produit des composées de 2 spores non-viables (incapables de pousser) et 2 spores viables [ura - ]. 2. Interprétez ces résultats. Question de cours 5 (d après le CC2011) On s intéresse à un facteur de transcription dimérique régulant une partie du métabolisme de la proline dans la levure. Ce facteur codé par le gène noté A comporte un domaine N-ter d activation transcriptionnelle, un domaine intermédiaire de dimérisation et un domaine C-ter d interaction avec l ADN. En réponse à un signal, la protéine monomérique rentre dans le noyau, se dimérise et reconnaît l ADN. Les levures haploïdes sauvage a + se développent aussi bien que les levures diploïdes a + /a + sur un milieu sans proline. 1. Faites un schéma récapitulant le fonctionnement du gène A dans la cellule. Quelle quantité de facteur de transcription est nécessaire pour assurer la synthèse de la proline? On construit des levures portant des allèles mutants du gène A, a 1 à a 4, décrits ci-dessous : - a 1 : codon stop prématuré conduisant à une absence totale de protéine. - a 2 : codon stop prématuré conduisant à une protéine tronquée, sans domaine de liaison à l ADN mais capable de se dimériser. - a 3 : délétion dans le domaine de liaison à l ADN changeant la spécificité de fixation du facteur. - a 4 : délétion du signal de localisation nucléaire. 2. Quel sera le phénotype des levures haploïdes sur un milieu sans proline? Chacune des souches mutantes haploïdes est croisée avec la souche sauvage de référence 3. Discutez les phénotypes possibles des levures hétérozygotes pour chacune de ces mutations ainsi obtenues : peuvent-elles pousser sur un milieu dépourvu de proline? Argumentez vos réponses et précisez dans chaque cas envisagé parmi quel type d allèles on peut classer chacune des mutations. 5/5