Héréditaire du Métabolisme» Outils de diagnostic moléculaire B. CARCY Réponses aux énoncés

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1 2016/17 DFGSP2 TD UE optionnelle «Maladies Héréditaire du Métabolisme» Outils de diagnostic moléculaire B. CARCY Réponses aux énoncés

2 Exercice 1. A-Dans la cadre d une recherche de mutation responsable d une maladie héréditaire du métabolisme (MHM) au sein d une famille dont certains membres présentent une déficience enzymatique caractéristique, le gène (1200pb) codant pour cette enzyme a été amplifié par PCR (entre les régions 1 et 2) puis séquencé à partir du génome diploïde de 3 hommes (2 sains et un malade). Les résultats du séquençage, dans la région où une différence de profil est observable entre les 3 individus, sont présentés sur la Figure 1. Q1 : Sur quel principe repose la méthode de séquençage de Sanger et Coulson qui a été utilisée? 1- Terminaison de chaine ADNsb par didésoxyribonucléotide 2- Tous les fragments générés se terminent par un ddntp 3- On génère autant de fragments d ADN sb qu il y a de bases à séquencer et ils sont tous différents d une base 4- On détermine l ordre par électrophorèse (5 =>3 des plus petits vers les + grands) Q2 : Quelle est la différence majeure entre cette méthode et celle du pyroséquençage? Dans le cas du pyroséquençage, les dntp sont ajoutés séquentiellement (un à un). C'est la libération d'un PPi (transformé en ATP par une ATP sulfurylase, lui même étant transformé en signal lumineux par une luciférase) qui provoquera un flash lumineux.

3 Q3 : Quelle est la nature de la mutation dans ce gène? - Par comparaison homme sain1 (N/N) avec homme malade (M/M) on voit substitution base A>T en 4ème position. Il s agit donc d une microlésion/mutation ponctuelle/snp/rflp EcoRI (car dans palindrome GAATTC du site EcoRI) - Confirmé par hétérozygote N/M (sain2) où on observe superposition bases A/T. Q4 : Quelle serait le mode de transmission de cette maladie? Peut-elle être de type récessive lié à l X? - Récessive (car Homme2 est sain mais hétérozygote ) et autosomique car les 2 allèles visibles sur cellule diploide dans hétérozygote. - Ne peut être lié à l X sinon on aurait homme sain 2 avec même profil que homme malade (hémizygote) B- La séquence des 2 amorces permettant d amplifier le gène codant pour l enzyme est la suivante: 5 -CTATGGCATAGCATCCTATA (sens) et 5'-CCTAAATGCCATCGGTACTA (antisens). Q1 : donnez la séquence des 2 extrémités du brin 5'-3' codant sur lesquelles se sont hybridées ces 2 amorces TAGTACCGATGGCATTTAGG-3 (amorce R= antisens) ATCATGGCTACCGTAAATCC-5 5 -CTATGGCATAGCATCCTATA (amorce F= sens) 3 -GATACCGTATCGTAGGATAT => donc le brin 5'-3' codant est : 5 -CTATGGCATAGCATCCTATA TAGTACCGATGGCATTTAGG-3 Q2 : Donner un programme PCR qui a permis d amplifier le plus spécifiquement possible ce gène. 1- Dénaturation : 90 C pd 30s 2- Hybridation : - La Tm des amorces est calculée selon Tm=4GC+2AT : o pour F => 8X4+12X2=56 C o pour R=> 4X9+11X2= 58 C - la T d hybridation est 5 C < à la + petite Tm soit : 51 C pd 30s 3- Elongation : 72 C pendant 1mn (Taq ADN polymerase) 4- Puis on répète 29X ces 3 étapes=> factuer d amplification est 2 puissance 30.

4 C- La digestion enzymatique du fragment PCR par l enzyme de restriction EcoRI (site de reconnaissance stricte G/AATTC) scinde l amplimère de l individu sain 1 en 2 fragments de 500 et 700pb mais pas celui de l individu malade. Q1 : Qu attendrait-on par ce type d approche chez l individu sain 2? 3 bandes à 1200/700/500pb Q2 : Comment appelle-t-on ce type de diagnostic moléculaire? PCR-RFLP Exercice 2. A- Dans le cadre d une analyse de MHM de transmission récessive liée à l X, au sein d une famille composée d une fille saine et d un garçon malade, les résultats de séquençage du gène responsable de cette maladie à partir du génome diploïde d une mère (saine) et de sa fille montrent (dans la région de la mutation) les profils suivants : Q1 : Citez une MHM qui pourrait correspondre ce type de transmission? la maldie de Fabry (déficit en galactosidase A). La mère est porteuse de la mutation mais non malade (récessive). Elle est donc hétérozygote N/M. La fille est saine donc homozygote N/N. Le profil de séquençage de la fille est donc la copie N du gène (11 bases)

5 Q2 : Interprétez ces profils et déterminez quelle pourrait être la nature de la mutation. L analyse des profils de séquençage de la mère (comparée à la fille) suggère sur la copie M du gène soit un double SNP (A>G et T>A en position 9 et 10, respectivement) soit une insertion d une base (G entre les bases G et A des positions 8 et 9) : Hypothèse 1 (c est un double SNP en position 9 et 10) : alors l allèle M serait AAACCGGGGAT (alors que l allèle N est AAACCGGGATT, selon la fille N/N). Ainsi par séquençage des 2 allèles en même temps (sur diploïde hétérozygote) alors on a : AAACCGGGGAT (M) => AAACCGGG G/A A/T T AAACCGGGATT (N) Hypothèse 2 (c est une insertion d une base G entre les bases G et A des positions 8 et 9) : alors l allèle M serait AAACCGGGGATT (alors que l allèle N est AAACCGGGATT, selon la fille N/N). Ainsi par séquençage des 2 allèles en même temps (sur diploïde hétérozygote, la mère) alors on a : AAACCGGGGATT (M) => AAACCGGG G/A A/T T/T T AAACCGGGATT (N) B- Le profil de séquençage (sur ADN diploïde) chez le garçon malade est le suivant. Q1- Qu en concluez-vous quant à la nature de la mutation et sur sa conséquence la plus probable sur l expression de l enzyme? Chez le garçon malade on ne voit que la copie M (hémizygote car porté par chr X)

6 C est l Hypothèse 2 (c est une insertion d une base G entre les bases G et A des positions 8 et 9) car on lit AAACCGGGGATT (alors que l allèle N est AAACCGGGATT, selon la fille N/N). Ainsi par séquençage des 2 allèles en même temps (sur diploïde hétérozygote, la mère) alors on a bien AAACCGGG-G/A-A/T- T/T-T La conséquence la + probable est le décalage du cadre de lecture ouvert (orf) et donc apparition d un codon stop prématuré. Donc non expression de l enzyme d où déficit d activité enzymatique. Q2 : Le père de cette famille peut il être atteint par cette maladie? Non car selon ce mode de transmission (récessive lié à X) le père transmet la mutation à toutes ses filles et à aucun garçon. Or ici le garçon est malade.

7 Exercice 3. Le séquençage d un gène chez un individu atteint d une MHM de transmission autosomique récessive a montré l existence d une délétion de 3pb. On vous propose de mettre au point un test de diagnostic moléculaire de cette délétion par les méthodes DGGE et SSCP. Pour ce faire, on met à votre disposition 2 amorces qui permettent d amplifier par PCR un fragment de 65pb chez un individu homozygote sain. Q1 : Sur quels principes reposent ces 2 approches dérivées de la PCR? Une mutation peut induire une variation de conformation des fragment d ADN simple brin (SSCP) ou du point de fusion des ADN double brin (DGGE).

8 Q2 : Donner les profils attendus par ces 2 techniques pour l analyse d individus N/N, M/M et N/M? indiquez à quoi correspondent les bandes sur le gel (ou les pics si électrophorèse capillaire) 1- SSCP 2- DGGE

9 Q3 : citez 2 autres méthodes qui reposent sur le même principe que la DGGE. Quelle est la différence majeure entre ces 2 méthodes? D-HPLC et HRM utilisent la propriété qu une mutation peut induire une variation de Tm des fragments d ADNdb. La 2ème doit se faire par PCR en temps réelle contrairement à la 1ère 1- D- HPLC

10 2- HRM (High Resolution Melting Curve)

11 Exercice 4. Les techniques D-HPLC et HRM peuvent être utilisées pour mettre en évidence des épimutations (méthylation en 5 des cytosines du motif 5 -CpG-3 ). Q1 : Décrivez le principe de mise en évidence de ces méthylations. Q2 : quelles seraient les séquences des fragments PCR issues d une analyse de méthylation sur les 2 allèles suivants : Q3 : quelle autre méthode permettrait d analyser la méthylation de l ADN? le Southern blot à l aide d izoschisomères (2 enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence mais une des 2 est sensible à la méthylation alors que l autre non ; Cf Cours BioMol UE11 DFGSP2). Les 2 enzymes génèrent donc des profils de restriction distincts selon que l'adn est méthylé ou non.

12 Exercice 5. On vous propose d utiliser la technique MLPA pour identifier des macrolésions au sein de 2 familles où existent une même MHM. Pour ce faire, le gène impliqué est analysé par MLPA sur le génome diploïde de 3 individus atteints. Les profils (axe des ordonnées correspond à la quantité d ADN amplifié estimée par qpcr) obtenus chez les 3 individus différents (ainsi que chez un individu contrôle) sont les suivants : Q1 : Principe de la technique MLPA?

13 Q2 : Interprétez les graphes et indiquez quelle(s) est(sont) la(les) macrolésion(s) mise(s) en évidence. S il existe plusieurs macrolésions, quels sont à priori les individus de la même famille? 2 types de macrolésions analysé ici : délétion exon 8 (pour individus 1 et 2 de la même famille) et duplication exon9 (autre famille). Q3 : Quel serait le profil d un individu N/M pour la pathologie associé à l exon9? voir graphe exemple 2