INTÉRÊT DE LA DÉTECTION DE BIOMARQUEURS MOLÉCULAIRES CIRCULANTS DANS LES TUMEURS SOLIDES
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- Gilbert Pinette
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1 INTÉRÊT DE LA DÉTECTION DE BIOMARQUEURS MOLÉCULAIRES CIRCULANTS DANS LES TUMEURS SOLIDES Dr Véronique Haddad LABORATOIRE DE BIOLOGIE DES TUMEURS CHU de BORDEAUX
2 Les CTCs = Circulating Tumor Cells
3 RAPPELS Tumeur =prolifération de cellules de type bénigne ou maligne Tumeur primitive Métastases = tumeur se développant à distance de la tumeur primitive (autre site de prolifération) CTC Lien entre la tumeur primitive et les métastases Transitent par: Sang Vaisseaux lymphatiques
4 CTC-PHYSIOPATHOLOGIE Paterlini Brechot, Cancer letters 2007
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6 CTC- COMPLÉXITÉ Dans le sang différents types de cellules Cellules tumorales qui circulent en colonie (microemboles) Cellules épithéliales circulantes QUI NE SONT PAS FORCEMENT DES CELLULESTUMORALES CIRCULANTES Cellules endothéliales circulantes Cellules souches (tumorales ou non) circulantes Toutes ces cellules sont regroupées sous le nom de Cellules Circulantes Non Hématologiques = toutes cellules étrangères anormalement présentes dans le sang.
7 METHODES DE DETECTION (1) Les CTCs sont présentes en très faible quantité dans le sang : ce sont des évènements très rares (3 ou 4 dans 10mL de sang) Pour détecter les CTC dans le sang il faut donc procéder à des méthodes d enrichissement et de purification. Il existe des méthodes indirectes et des méthodes directes : Méthodes indirectes : méthodes d immunodétection et les méthodes de biologie moléculaire Méthodes directes : méthodes de séparation des cellules et les méthodes d enrichissement des cellules.
8 METHODES DE DETECTION (2) Il y a environ une trentaine de méthodes mais seulement 2 nous intéressent : la technique CellSearch et la technique ISET. 3 grands principes de détection des CTC qui nous permettent de les identifier : les CTC sont plus grosses que les autres cellules du sang : > microns (Globule Rouge = 7 microns, Lymphocyte non activé = 9-10 microns, PNN non activé = microns). Les CTC sont plus denses que les autres cellules. Les CTC peuvent êtres captées par des anticorps.
9 CELLSEARCH-VERIDEX Définition des CTC selon CellSearch Cellule intacte ronde ou ovale de tailles > 4 microns DAPI+ avec un rapport NC > 0,5 Cytokératine + et CD45 -
10 FAUX POSITIFS CHEZ DES PATIENTS AVEC UNE MALADIE BENIGNE DU COLON Klaus Pantel et al. Clinical Chemistry (2012) 53 patients avec des maladies bénignes coliques (ex: diverticulose, maladie de Crohn ) Test avec CellSearch et EPISPOT Résultats: CellSearch system : 11.3% patients avec CTC EPISPOT: 18.9% patients avec CTC
11 TECHNIQUE ISET(ISOLATION BY SIZE OF EPITHELIAL TUMOR CELLS) Définition des CTC selon ISET Taille du noyau > 16 microns Irrégularité du contour nucléaire Chromatine irrégulière Présence de cytoplasme visible Rapport NC> 0,8
12 SENSIBILITÉ : ISET VS CELLSEARCH ISET détecte des CTCs chez plus de patients et en plus grand nombre
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14 AUTRES ETUDES Pronostic: Cancer du sein CTC>5 mauvais pronostic avec OS (Hayes et al. 2006; Cristofanilli et al. 2005, 2004) CTC après ttt OS Cancer colique CTC> 3 mauvais pronostic avec OS (Cohen et al. 2009) CTC après ttt OS Théranostique Biopsie en «temps réel» Cancer du sein: HER2 amplification (Meng et al. 2004) switch dans le temps : 9/24 patients 3/9 traités : RC Mutations EGFR (Sequist et al. 2009) Sensibilité 99,1% Spécificité 100%
15 EN RESUMÉ Quantification des CTCs Aide pour le pronostic Mesure de la réponse à la thérapie Sélection de patients pour chimio adjuvante Détection de maladie résiduelle Caractérisation moléculaires des CTCs Biopsie en «temps réel» Détection de résistance au traitement Compréhension des mécanismes tumoraux Recherche de nouvelles cibles thérapeutiques (gènes)
16 L ADN tumoral circulant
17 GENERALITES Découverte de l ADN plasmatique Lupus érythémateux (Koffler et al., 1973) Arthrite rhumatoïde Glomérulonéphrite Pancréatite ADN tumoral plasmatique Nombreux cancers (Anker et Stroun, 2000) Détection et/ou diagnostic des cancers? Taux d ADN circulant Individus sains : ng/ml Tumeurs : centaines de ng/ml Métastases > tumeur locale Corrélation entre le taux d ADN circulant et la progression de la maladie dans le cancer du poumon (Anker et al., 1999)
18 ORIGINE Nombreuses hypothèses Relargage actif par les lymphocytes activés, ceci indépendamment de la machinerie de réplication cellulaire Provenance tissulaire Présent sous la forme de fragments similaires à ceux détectés dans des cellules en apoptose L ADN plasmatique peut contenir des altérations géniques identiques à celles des tumeurs (Chen et al., 1999) Cet ADN a donc un lien direct avec les tumeurs Présence d ADN dans le plasma de patients cancéreux pourrait être la conséquence d une circulation de cellules dans un processus métastasique ou le relargage passif d ADN tumoral suite à la mort de cellules cancéreuses in situ.
19 ISOLATION ET AMPLIFICATION Isolation Tubes EDTA ou citrate de sodium Héparine inhibition PCR Centrifugation et collecte du plasma ou du sérum Extraction d ADN immédiate ou congélation à -20 C minimum Kit d extraction spécifiques Amplification Technique ultra-sensible car peu d ADN plasmatique tumoral (<1% de l ADN plasmatique total) PCR temps réel avec blocage de l allèle wt
20 TUMOR DNA IN PLASMA AT DIAGNOSIS OF BREAST CANCER PATIENTS IS A VALUABLE PREDICTOR OF DISEASE-FREE SURVIVAL Silva et al. Clin Cancer Res 2002
21 UTILITY OF CIRCULATING B-RAF DNA MUTATION IN SERUM FOR MONITORING MELANOMA PATIENTS RECEIVING BIOCHEMOTHERAPY Shinozaki et al., Clin Cancer Res Différence OS entre BRAFswt et BRAFsmt avant chimiothérapie
22 UTILITY OF CIRCULATING B-RAF DNA MUTATION IN SERUM FOR MONITORING MELANOMA PATIENTS RECEIVING BIOCHEMOTHERAPY Shinozaki et al., Clin Cancer Res. 2007
23 CIRCULATING DNA: DIAGNOSTIC TOOL AND PREDICTIVE MARKER FOR OVERALL SURVIVAL OF NSCLC PATIENTS Catarino et al., Plos One, 2012
24 PLASMA DNA TESTING IN PATIENTS WITH ADVANCED CANCERS Perkins et al., Plos One, 2012 Discordances entre FFPE et cpdna Taux cpdna tumoral trop bas Hétérogénéité tumoral Sensibilité technique NGS
25 EN RESUMÉ Quantification de cpdna Aide pour le pronostic Mesure de la réponse à la thérapie Détection de maladie résiduelle Caractérisation moléculaires des cpdna Biopsie en «temps réel» Détection de résistance au traitement Compréhension des mécanismes tumoraux Recherche de nouvelles cibles thérapeutiques (gènes) Sensibilité de la technique < 1% NGS??
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