Les patients présentant des infections respiratoires hautes telles que sinusites, otites, angines et rhinopharyngites ont été inclus dans l étude.

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1 I. MATERIELS ET METHODES : I.1. Matériels I.1.1. Cadre de l étude Ce travail a été effectué à l Unité de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de Bacteriologie-Virologie (Hôpital Aristide Le Dantec). I.1.2. Population d étude Le recrutement clinique des patients a eu lieu au niveau des services d ORL et de Pédiatrie de l Hôpital Aristide Le Dantec ainsi qu au niveau d un cabinet privé d ORL, de septembre 2005 à mars Les patients présentant des infections respiratoires hautes telles que sinusites, otites, angines et rhinopharyngites ont été inclus dans l étude. C est ainsi que plusieurs prélèvements pathologiques ont été recueillis : pus de l oreille moyenne prélèvements de gorge pus de sinusites prélèvements de nez I.1.3. Matériels et réactifs I Matériel de prélèvement Écouvillons stériles Tubes à hémolyse Seringues Eau physiologique Glacière Réfrigérant

2 I Matériel d isolement Anse de platine Boîtes de Pétri Bec Bunsen Gélose Müller-Hinton (MH) Gélose trypticase-soja Sang de mouton Sang de cheval Gentamicine Bacitracine Polyvitex Jarre d incubation Génerateur de CO 2 ou bougie Etuve à 37 C Autoclave I Matériel pour l identification Lames porte-objet Microscope optique Pipettes Pasteur Peroxyde d hydrogène 3% Bâtonnets Disques d optochine Desoxycholate de sodium 10% Slidex pneumo kit Disques de Bacitracine Slidex StreptoA Api NH Extrait d hemine chlorydrate à 200 µg/ml Galerie Micro CSB

3 I Matériel pour antibiogramme I Matériel pour la détection de la production de bêtalactamase (méthode à la cefinase) Pipette Pasteur Disques de Nitrocéfine Eau physiologique Lame porte-objet Pince I Matériel pour l évaluation de la sensibilité Disques d antibiotique Solvants et diluants appropriés selon l antibiotique Poudre d antibiotique Pinces Bandelettes E-test Boîtes de Pétri Gélose Columbia sans ou avec sang cuit Gélose Müller-Hinton Sang de cheval Polyvitex Eau physiologique Eau distillée stérile Pipettes graduées Tubes Mac Farland 0,5-31 -

4 I Matériel d exploitation des résultats Le logiciel WHONET 5.3 a été utilisé pour l exploitation des résultats - Matériels et Méthodes - I Matériel de conservation des souches Cryotubes Bouillon cœur-cervelle Glycerol GSC en tube ou en pente Lait écrémé I Contrôle de stérilité et d efficacité I Contrôle de stérilité Celui-ci consiste à laisser les milieux préparer pendant 24 h dans l étuve et à vérifier si le lendemain il n y a pas eu pousse d une quelconque bactérie. Si non, le milieu sera utilisé ; si oui, le milieu sera jeté et un autre sera préparé. I Contrôle d efficacité Celui-ci consiste à repiquer les souches de référence des bactéries à isoler sur les milieux préparés et de vérifier si après 24 h d incubation celles-là ont poussé. Dans le cas où il y a eu pousse, le milieu est dit efficace. I.2. Méthodes I.2.1. Prélèvements I Conditions de réalisation des prélèvements Le respect des règles d asepsie et de stérilité était de rigueur. La qualité des prélèvements joue un rôle important dans la suite de l analyse et sur les résultats obtenus

5 Les prélèvements ont essentiellement été réalisés par écouvillonnage pour les pus d otites, les rhinorrhées et les sécrétions pharyngées et par ponction à la seringue des pus de sinusites. Les écouvillons seront ensuite placés dans des tubes stériles contenant 0,5 ml d eau physiologique stérile. Les otorrhées : elles ont été recueillies par écouvillonnage après nettoyage du conduit auditif externe par un antiseptique. Les prélèvements sinusiens : ils ont été effectués par aspiration à la seringue des sécrétions purulentes de l écoulement méatique ou par écouvillonnage dans le pharynx postérieur. Les prélèvements pharyngés : l éviction des contaminations salivaires a au préalable été réalisé. Le frottement d un écouvillon sur la surface de chaque amygdale et sur la muqueuse pharyngée a été effectué après abaissement de la langue pour bien voir l oropharynx et les amygdales. Les rhinorrhées : elles ont été recueillies par écouvillonnage à l aide d un spéculum nasal. I Transport des prélèvements Les écouvillons et les seringues ont été transportés au laboratoire dans une glacière contenant des réfrigérants. Les prélèvements étaient acheminés au laboratoire et pris en charge dans un délai de quatre heures car la flore commensale d accompagnement se multiplie rapidement, ce qui peut fausser les résultats. De plus, les agents infectieux comme Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae et Moraxella catarrhalis sont extrêmement fragiles

6 En plus de ces quatre germes, plusieurs autres pourront êtres identifiés tels que des staphylocoques, des bacilles à Gram négatif non entérobactéries, des streptocoques, et des entérobactéries. I Conservation des prélèvements Les écouvillons sont déchargés dans de l eau physiologique, bouillon cœurcervelle et conservés à -70 C. Ceci dans le but de pouvoir réisoler la bactérie identifiée en cas d un résultat douteux. La décongélation est faite à la température ambiante du laboratoire. I.2.2. Examen macroscopique Il a consisté en l appréciation de l aspect purulent ou non des prélèvements. I.2.3. Examen microscopique après coloration de Gram et/ou au bleu de méthylène A partir des produits pathologiques, deux frottis ont été réalisés : L un coloré au Gram et l autre au bleu de méthylène. L observation microscopique à l objectif 100 permet d apprécier : Le nombre de polynucléaires L aspect de la flore Le nombre de cellules épithéliales I.2.4. Isolements I Ensemencement Celui-ci a été fait à l aide d écouvillons pour les pus de sinusites et d oreilles et d anses de platine pour les prélèvements pharyngés

7 I Milieux de culture En vue d obtenir des colonies des germes à identifier, les prélèvements ont été ensemencés sur des milieux appropriés, incubés dans des conditions précises. Pour Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae et Moraxella catarrhalis, il s agissait de milieux sélectifs. Ces milieux sont les suivants : Gélose Columbia + 5 % de sang de mouton pour Streptococcus pyogenes Gélose Colmbia + 5% de sang de cheval + Gentamicine ou GSC + Polyvitex pour Streptococcus pneumoniae Gélose Columbia + 5% de sang de cheval + Bacitracine ou GSC + Polyvitex pour Haemophilus influenzae GSC + Polyvitex ou supplément G pour Moraxella catarrhalis et les autres espèces de Streptocoques En plus de ces quatre bactéries, d autres colonies de germes devront être identifiés sur des milieux différents : Gélose Chapman pour les Staphylocoques Gélose CLED, et MAC CONKEY pour les bacilles à Gram négatif non Entérobactéries et les Entérobactéries Des milieux d enrichissement seront également utilisés pour faciliter l isolement de certaines bactéries ; ces milieux sont : le bouillon Schaedler le bouillon thioglycolate le bouillon glucosé tamponné

8 Il faut en outre préciser que les sécrétions rhinopharyngées ont été ensemencées après dilution au 1/1000. Pour ces prélèvements qui sont potentiellement contaminés par la flore salivaire, on ne pourra affirmer que la culture est positive qu après dénombrement du nombre de bactéries par ml. Tableau II : Corrélation entre le nombre de colonies observées après dilution au 1/1000 sur les milieux de culture et le nombre de bactéries par ml de sécrétion Nombre de colonies sur les boîtes Nombre de bactéries/ml de sécrétions Moins de 5 colonies Entre 10 5 et 10 6 de 5 à 50 colonies Entre 10 6 et 10 7 de 50 à 500 colonies Entre 10 7 et 10 8 Plus de 500 colonies De 10 8 et au-delà I.2.5. Identification I Streptococcus pneumoniae I Examen macroscopique des colonies Streptococcus pneumoniae donne sur gélose au sang cuit de petites colonies mucoïdes ou à dépression centrale, transparentes, rondes, et développant une hémolyse de type alpha (α-viridans)

9 I Examen microscopique des colonies Technique de la coloration au bleu de méthylène - verser du bleu de méthylène sur la préparation séchée et fixée - laisser agir pendant 30 secondes - laver à l eau - sécher entre deux feuilles de papier buvard - Lire au microscope, à l objectif 100 Technique de la coloration de Gram - Première phase de coloration : recouvrir la préparation de violet de gentiane, laisser agir une minute - Laver au lugol, puis recouvrir la lame de lugol et laisser agir 30 secondes et recommencer cette opération - Phase de décoloration : laver successivement à l eau et à l alcool jusqu à ce que le liquide qui s égoutte soit incolore - Deuxième phase de coloration : recouvrir la lame de fuschine et laisser agir 30 secondes - Laver à l eau et sécher entre deux feuilles de papier buvard, puis lire au microscope à l immersion à l objectif 100 Interprétation : Les bactéries colorées en violet sont dites à Gram positif (+) Les bactéries colorées en rouge sont dites à Gram négatif (-) Un frottis coloré au Gram à partir d une colonie a été réalisé. L observation au microscope optique à l objectif 100 avec une goutte d huile à immersion a montré des diplocoques Gram positif à forme lancéolée, en flamme de bougie

10 I Test à la catalase Principe : La catalase est une enzyme qui décompose le peroxyde d hydrogène 3% en oxygène gazeux et en eau. Technique : Un frottis à partir des colonies isolées a été réalisé. Ensuite quelques gouttes d eau oxygénée (peroxyde d hydrogène) y sont déposées. La libération d oxygène s est matérialisée par la production de bulles ; la bactérie est alors dite catalase positive. Résultats : Streptococcus pneumoniae est catalase négative. I Test à l oxydase Principe : Sous l action d une cytochrome-oxydase, le di-méthyl-para-phénylène diamine, incolore, est transformé en une semi-quinone violacée qui s oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre. Technique : - Réactif (à conserver à + 4 C et à l obscurité) o Solution aqueuse à 1% de chlorhydrate ou d oxalate de di-méthylpara-phénylène diamine dont on imbibera un papier buvard blanc o Ou disques de papier buvard imprégnés de cette substance dans le commerce - Placer le disque Ox sur une lame porte-objet et l imbiber avec une goutte d eau. Prélever à la pipette boutonnée une parcelle de culture et la

11 poser sur le disque. La présence d oxydase entraînera une coloration violette. Streptococcus pneumoniae est oxydase négative. I Test à la bile-esculine Principe : Ce milieu est destiné à l isolement sélectif et à la différenciation des Streptocoques D pour lesquels la tolérance à la bile et à l hydrolyse de l esculine est considérée comme des caractères constants. Résultats : Si le milieu ne change pas de couleur, la bile-esculine est négative. Mais si on observe un pigment noir, le test est positif. Streptococcus pneumoniae est bile-esculine négative. I Test de lyse par les sels biliaires Principe : Les colonies de Streptococcus pneumoniae sont «dissoutes» ou lysées en 30 min en présence d une suspension de bile. Le rôle de la bile sur les bactéries peut être rapporté à celui des sels de sodium d acides organiques. Le desoxycholate de sodium à 10% agit comme la bile sur les bactéries. Technique : Une ou deux gouttes d une solution de desoxycholate de sodium à 10% sont déposées sur une colonie alpha hémolytique

12 La boîte de Pétri a été incubée à l étuve à 35 C pendant deux heures avec le couvercle légèrement entrouvert pour favoriser l évaporation du réactif. L examen de l endroit où le réactif déposé a été réalisé au bout de deux heures afin de rechercher la présence ou la lyse de colonies présumées de Streptococcus pneumoniae. L hémolyse alpha-viridans demeure mais la colonie disparaît. NB : La sensibilité à l optochine et la lyse par les sels biliaires sont spécifiques des pneumocoques. I Test de sensibilité à l optochine Principe : Streptococcus pneumoniae est sensible à l optochine (chlorhydrate d ethylhydrocupreine), alors que les autres streptocoques et en particulier les streptocoques non groupables alpha hémolytiques ne le sont pas. Technique : Une suspension du germe isolé a été inondée sur une boîte de gélose au sang. Après séchage, un disque d optochine a été appliqué à l aide d une pince à la surface de la gélose. L incubation se fera à 35 C en atmosphère enrichi de CO 2 pendant 18 heures au bout desquelles la présence ou non de zone d inhibition matérialisée par un halo clair a été recherchée et le diamètre a été mesuré. Résultats : Pour les pneumocoques, une zone d inhibition supérieure à 14 mm sera observée alors que les autres streptocoques ne seront pas inhibés. Si le diamètre est inférieur à 14 mm, des tests complémentaires sont effectués

13 I Test d agglutination au latex (Slidex pneumo kit) Principe : Le Slidex pneumo-kit est un test d'identification rapide de S. pneumoniae par agglutination de particules de latex. Les antigènes capsulaires sont identifiés en utilisant des particules de latex sensibilisées par des groupes spécifiques d'anticorps anti-pneumocoque. On note la formation d'agrégats visibles lorsque les particules de latex réagissent avec les antigènes. Le latex reste en suspension en cas d'absence d'antigènes. Technique : Sur deux cercles différents d'une carte d'agglutination, une goutte d'eau physiologique a été déposée. A l'aide d'une anse de platine, quelques colonies prélevées ont été mises en suspension dans l'eau physiologique de manière à obtenir dans chaque cercle une suspension opalescente. - dans le premier cercle une goutte de latex anti-s.pneumoniae (R1) a été déposé, et dans le second cercle une goutte de latex témoin (R2), - la carte a été soumise à un mouvement rotatif pendant deux minutes au maximum après avoir homogénéisé le contenu de chaque cercle à l'aide de deux bâtonnets différents. Résultats : Une réaction positive se traduit par une agglutination visible en deux minutes dans le cercle contenant le réactif R

14 I Microméthode d identification Nous avons eu à utiliser des microplaques CSB streptocoques comme test de confirmation. Principe : Les galeries CSB streptocoques permettent la mise en évidence d activités enzymatiques ou d assimilation de substrats carbonés en milieu approprié (fermentation) ou hostile. Les microplaques sont ensemencées avec un inoculum qui reconstitue le milieu. Après incubation, la lecture est effectuée directement ou après addition de réactifs de révélation. La lecture des réactions est faite à l aide d un tableau de lecture microplaque CSB system. I Streptococcus pyogenes I Examen macroscopique des colonies Sur gélose au sang ordinaire (GSO), Streptococcus pyogenes a donné des colonies lisses, translucides développant une hémolyse de type bêta. Ce sont des streptocoques bêta-hemolytiques. I Examen microscopique des colonies Il montre après coloration des cocci à Gram positif disposés en courtes chaînettes. I Test à la catalase Streptococcus pyogenes est catalase négative. I Test à l oxydase Streptococcus pyogenes est oxydase négative

15 I Test à la bile-esculine Ce test est négatif pour Streptococcus pyogenes. I Test de sensibilité à la bacitracine Principe : Les streptocoques bêta-hemolytiques du groupe A sont en général sensibles à la bacitracine. Toutefois ce test n est pas fiable car les microcoques et les stomatocoques sont sensibles à cet antibiotique. Il s agit donc d un test de présomption. Technique : Une culture pure de streptocoques bêta-hemolytiques a été mise en culture de manière à obtenir une turbidité égale à celle du tube 0,5 de la gamme de Mac Farland. L inoculum est ensemencé sur une gélose au sang et après séchage le disque de bacitracine a été déposé. Après 24 heures d incubation à 35 C en atmosphère riche en CO 2, la présence ou non d une zone d inhibition a été noté. Interprétation : Une absence de zone d inhibition a orienté vers des streptocoques β- hémolytiques autres que ceux du groupe A

16 I Test d agglutination au latex (Slidex strepto A) - Matériels et Méthodes - Principe : Le Slidex Strepto A est un test d'agglutination au latex pour le groupage et l'identification des streptocoques β-hémolytiques du groupe A. L'extraction enzymatique de l'antigène spécifique de groupe, retrouvé au niveau de la paroi bactérienne, est d abord réalisée. Cet antigène est ensuite identifié par des particules de latex sensibilisées par un antisérum antistreptocoque spécifique de groupe. La réaction antigène-anticorps se matérialise par une agglutination visible à l'œil nu. Le latex reste en suspension homogène si l'antigène n'est pas présent. Technique : Préparation de l'extrait 0,4 ml d'enzyme d'extraction ont été introduits dans un tube à essai. En cas de culture sur milieu solide, deux ou trois colonies ont été prélevé et mises en suspension dans la solution d'enzyme. Ce mélange a été incubé à 37 C pendant 10 à 15 minutes. Agglutination Après avoir remis le latex en suspension en agitant énergiquement le flacon: - Une goutte de la suspension de latex a été déposé dans un cercle d'une carte d'agglutination ; - à l'aide d'une pipette Pasteur, une goutte de l'extrait a été prélevé et déposée à côté de la goutte de latex. Avec un bâtonnet, les deux gouttes ont été mélangées de manière à répandre la suspension à la surface du cercle ;

17 - la carte a été agitée suivant un mouvement rotatif pendant deux minutes au maximum. Résultats : L'apparition d'une agglutination permet l'identification des streptocoques du groupe A. I Microméthode d identification (Voir Streptococcus pneumoniae) I Haemophilus influenzae I Examen macroscopique des colonies Les colonies sont fines, lisses, rondes en gouttelettes de rosée. Elles sont volumineuses avec une tendance à s étaler. I Examen microscopique des colonies La coloration de Gram montre des bacilles à Gram négatif, isolés, de petite taille, polymorphes immobiles avec parfois une prédominance de coccobacilles. I Test à la catalase Haemophilus influenzae est catalase positive. I Test à la cytochrome oxydase Haemophilus influenzae est oxydase positive. I Mise en évidence du phénomène de satellitisme L exigence en facteur V a été confirmée par l épreuve de la croissance en satellitisme autour d une strie de Staphylococcus aureus qui apporte le facteur V et sur gélose au sang de cheval qui apporte le facteur X

18 Mode opératoire : Sur une boîte de gélose au sang de cheval, - Faire une strie avec une souche viable de Staphylococcus aureus de 24 heures - Ensemencer en stries serrées, la souche à étudier sur toute la boîte de gélose au sang de cheval - Incuber 24 à 48 heures à 37 C sous une atmosphère à 5% de CO 2 Lecture : Les Haemophilus V dépendants se développent autour de la strie de staphylocoques, alors que sur le reste de la boîte, on n observe pas de culture. Il peut s agir de Haemophilus influenzae ou de Haemophilus parainfluenzae. Un recoupement avec les résultats de la mise en évidence de l exigence en facteur X et ou V permet le diagnostic différentiel entre Haemophilus influenzae et Haemophilus parainfluenzae. I Mise en évidence de l exigence en facteur X (hémine) et en facteur V (NAD) Le procédé sur milieu gélosé consiste à identifier la souche après repiquage sur quatre milieux. - GSC polyvitex contenant de l hémine et du NAD - Gélose au chocolat contenant de l hémine - Gélose trypticase soja + polyvitex contenant du NAD - Gélose trypticase soja : sans facteur Les géloses ont été incubées sous CO 2 à 37 C sauf la gélose trypticase soja qui est incubée sans CO 2 à 37 C

19 Au bout de 24 à 48 heures heures d incubation on devra lire que : - Matériels et Méthodes - o o Haemophilus influenzae ne pousse que sur GSC polyvitex seulement. Haemophilus parainfluenzae pousse sur GSC polyvitex et sur trypticase soja polyvitex. I Microméthode d identification API NH (Neisseria- Haemophilus) Cette méthode sera utilisée pour obtenir des résultats plus fiables. Ainsi les galeries API NH seront ensemencées avec une suspension bactérienne dans de l eau physiologique à 4 Mac Farland. Les réactions produites pendant la période d incubation (2heures) se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l addition de réactifs. La lecture de ces réactions est faite à l aide du tableau de lecture API NH et l identification a été obtenue à l aide du tableau d identification I Moraxella catarrhalis I Examen macroscopique des colonies Celui-ci montre des colonies lisses, parfois rugueuses légèrement aplaties et d allure muqueuse. I Examen microscopique des colonies Celui-ci se fera après coloration de Gram. L examen montrera des cocci à Gram négatif, à face adjacente aplatie, avec tendance à résister à la décoloration. I Test à la catalase Moraxella catarrhalis est catalase positive

20 I Test à la cytochrome oxydase Moraxella catarrhalis est oxydase positive I Microméthode d identification La microgalerie API NH sera utilisée. (Voir Haemophilus influenzae). I Les Staphylocoques I Examen macroscopique des colonies Celui-ci montre des colonies volumineuses, lisses, de couleur blanche avec un pigment jaune doré car elles fermentent le mannitol pour Staphylococcus aureus et des colonies pareilles mais sans pigment pour certaines autres espèces de staphylocoques. I Examen microscopique des colonies Celui-ci se fera après coloration de Gram et montrera des cocci à Gram positif groupés en amas ou en courtes chaînettes

21 Colonies suspectes sur milieu de Chapman Cocci Gram+, en amas Catalase+ Cocci Gram+, en chaînette Catalase- Famille des micrococcacae Famille des streptococcacae Dnase Coagulase Thermonuclease Colonies jaune d or Colonies blanc porcelaine jaune claire rose POSITIF Staphylococcus aureus NEGATIF Autres Staphylococcus CSB Staph CSB Staph Figure 5 : Identification des staphylocoques I Test à la catalase Staphylococcus aureus est catalase positive. I Recherche de la coagulase libre Principe : La production de la coagulase permet de différencier les souches de Staphylococcus aureus des autres espèces de staphylocoques et des Micrococcus. Ce test est réalisé pour les cocci Gram + et catalase

22 Mode opératoire : - Mélanger dans un tube à hémolyse 0,5 ml de plasma de lapin et 0,5 ml d une suspension de germes - Laisser incuber à 37 C pendant 24 heures - Lire 24 heures après en inclinant le tube Lecture : Les souches de Staphylococcus aureus provoquent la coagulation du plasma entre une demi-heure et une heure. I MicroCSB Staphylocoques Principe : C est une microméthode d identification des staphylocoques. Il s agit d une méthode miniaturisée standardisée permettant la mise en évidence d activités enzymatiques et de fermentations sucrées. Avec 15 tests biochimiques, elle permet de faire un diagnostic d espèce des staphylocoques coagulase négative. I Les Streptocoques I Examen microscopique Ce sont des cocci gram + disposés en chaînettes plus ou moins longues. I Isolement Le prélèvement est ensemencé sur GSO + Ac. Nalidixique. La boîte de pétri est incubée à 37 C pendant 24 h dans une atmosphère à 5 % de CO 2. Après examen macroscopique de la culture on note les caractères de l hémolyse et l aspect des colonies

23 Les β hémolytiques : présomption de streptocoques A, B, C, D, F, G, L Les streptocoques A, C, G donnent des colonies transparentes, en dômes, d un diamètre de 0,5 mm environ les streptocoques B et D donnent des colonies bombées, opaques de 1 à 2 mm de diamètre les colonies des streptocoques du groupe F et certaines souches de S.mutans ont la taille d une tête d épingle Les non hémolytiques Les α hémolytiques I Test à la catalase Les streptocoques sont catalase négative. I Distinction entre streptocoque et entérocoque La distinction se fait par ensemencement du milieu Bile-Esculine-Azide (BEA) et Bouillon hypersalé (BHS). Milieu BEA Principe : (Voir Streptococcus pneumoniae) Lecture : Les colonies de Streptococcus sont petites et translucides avec un halo très net. Seules les Listeria peuvent donner des colonies assez semblables. Exceptionnellement, d autres espèces comme les Staphylococcus peuvent se développer mais leur aspect est très différent. Les streptocoques BEA+ sont des streptocoques du groupe D Exceptionnellement on peut avoir les S. mutans. Les streptocoques BEA sont des streptocoques non groupables

24 Milieu BHS Principe : Ce milieu sert essentiellement à la confirmation et à la différenciation des streptocoques BEA+. Lecture : - Les «entérocoques vrais» se développent en 24-48h. - Les non-entérocoques sont incapables de pousser. I Groupage par Slidex Streptokit Principe : Il consiste à mettre en évidence après extraction enzymatique des antigènes polysaccharidiques (Polyoside C) de la paroi des streptocoques par agglutination de particules de latex sensibilisées par des immunoglobulines de lapin spécifiques de groupe. Il s agit de faire un groupage pour la recherche du type de streptocoques β-hémolytiques et lorsque l esculine n est pas hydrolysée. Mode opératoire : - Recueillir une anse de culture - Émulsionner dans 0,4 ml d enzyme - Incuber à 37 C pendant 15 min - Distinguer le latex dans les cupules - Ajouter l extrait, une goutte par cupule - Mélanger en étalant - Balancer et lire au bout d une minute

25 Lecture : On recherche la présence d agglutination au niveau des cupules. - Matériels et Méthodes - I MicroCSB Streptocoques (Voir Streptococcus pneumoniae) I Les Entérobactéries I Examen microscopique Ce sont des bacilles à Gram négatif plus ou moins courts, étroits, immobiles ou mobiles par une ciliature péritriche. I Isolement L ensemencement se fait sur milieu Mac Conkey et CLED ; l incubation se fait pendant 24 heures à 37 C. Sur Mac Conkey on note : o Des bactéries lactose-positive violet foncé Colonies convexes muqueuses ayant tendance à confluer, fait penser aux Klebsiella Colonies dont le centre est gris marron par transparence mais sans éclat métallique. Enterobacter o Des bactéries lactose-négative grisâtres Colonies grisâtres, avec des pellicules autour des colonies : font penser aux Proteus Sur milieu CLED on note : Des colonies très muqueuses (Klebsiella) Des colonies bleues translucides (Proteus)

26 I Identification par le test à l oxydase Les entérobactéries sont oxydase négative. I Galerie classique des entérobactéries C est une mini galerie composée de : milieu Mannitol-mobilité C est une gélose molle conditionnée en tubes et qui permet d étudier la fermentation du mannitol et la mobilité des germes. Elle est ensemencée par piqûre centrale jusqu au fond des tubes à l aide d une anse de platine. La fermentation du mannitol se matérialise par un virage du milieu au jaune. Les bacilles mobiles diffusent à partir de la ligne d ensemencement, créant un trouble du milieu alors que les bacilles immobiles poussent uniquement le long de la strie d ensemencement. milieu Kliger-Hajna C est une gélose molle conditionnée en tubes et qui permet d étudier la fermentation du mannitol et la mobilité des germes. Elle est ensemencée par piqûre centrale jusqu au fond des tubes à l aide d une anse de platine. La fermentation du mannitol se matérialise par un virage du milieu au jaune. Les bacilles mobiles diffusent à partir de la ligne d ensemencement, créant un trouble du milieu alors que les bacilles immobiles poussent uniquement le long de la strie d ensemencement

27 milieu Urée-Indole C est un milieu liquide au niveau duquel on recherche trois caractères : La production d uréase qui se matérialise par un changement de la coloration du jaune au rose, du fait de l alcalinisation du milieu ; La présence d indole qui se matérialise par un anneau rouge, après addition du réactif de Kovacs. La présence de TDA qui se matérialise par un changement de la coloration du jaune au rouge, après addition du perchlorure de fer (FeCl 3 ). milieu Citrate de Simmons Ce milieu coulé en tubes est utilisé pour l étude de l utilisation du citrate comme seule source de carbone par les germes. Il contient un indicateur de ph qui est le bleu de bromothymol, ce qui confère au milieu une coloration verte à l état acide. Les germes qui utilisent le citrate comme seule source de carbone entraînent une alcalinisation du milieu, d où le virage du vert au bleu. Elle permet l identification des Entérobactéries les plus fréquemment rencontrées. I MicroCSB Entérobactéries Principe : Il s agit d une méthode miniaturisée permettant la mise en œuvre d un nombre de tests supérieurs à celui d une galerie classique. En effet elle comporte 20 cupules permettant de réaliser 22 tests biochimiques et de faire un diagnostic de genre ou d espèce de la plupart des

28 entérobactéries. Cette méthode est basée sur la mise en évidence d activités enzymatiques ou d assimilation de substrats carbonés. I Les bacilles à Gram négatif non Entérobactéries I Isolement Celui-ci est fait sur la gélose Mac Conkey. L incubation se fait à l étuve à 37 C pendant 24 heures. I Identification I Examen macroscopique Les Pseudomonas donnent des colonies lactose négative, «œuf sur le plat» avec des pigments (bleu-vert pour Pseudomonas aeruginosa) et possèdent une odeur caractéristique (acacia ou seringa). Flavobacterium : produit des pigments allant du jaune pâle au jaune orangé. Les colonies d Acinetobacter sont lactoses négatives, lisses à bordures nettes. I Examen microscopique La ciliature polaire de type monotriche est caractéristique de pseudomonas aeruginosa. La ciliature péritriche de type dégénérée est caractéristique des Alcaligenes. Les Acinetobacter sont toujours immobiles. La coloration de Gram nous montre des bacilles à Gram négatif. I Test à la catalase Les bacilles à Gram négatif non entérobactéries sont, en général, catalase positive telles que Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter

29 I Test à l oxydase Pseudomonas aeruginosa donne une coloration positive 20 à 30 secondes après le test par contre quand il s agit d Acinetobacter, le test est négatif I Les méthodes classiques d identification (Voir les Entérobactéries) Le milieu Mannitol-Mobilité Le milieu Kliger-Hajna Le milieu Urée-Indole Le milieu Citrate de Simmons I Identification par la microméthode CSB Principe : Il s agit d une méthode miniaturisée permettant la mise en évidence d activités enzymatiques, de la fermentation des sucres et de la croissance en milieu hostile. La galerie Micro CSB bacilles à Gram négatif non Entérobactéries permet de réaliser 17 tests biochimiques et de faire les diagnostics d espèces de la plupart des bacilles à Gram négatif non Entérobactéries. I.2.6. Étude de la sensibilité aux antibiotiques Elle a été basée sur la recherche des diamètres d inhibition et la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI). Deux méthodes seront utilisées : la dilution en milieu gélosé Epsilometer-test (E-test)

30 I Détermination des diamètres d inhibition : Antibiogramme standard Principe : L antibiogramme standard utilise la technique de la diffusion en milieu gélosé. Il permet d apprécier la modification de la croissance d une souche bactérienne en présence de l antibiotique testé. I Contrôle de qualité des disques d antibiotiques et antibiogramme des différents germes Tableau III : Disques testés pour chaque souche de référence S. pneumoniae ATCC S. aureus ATCC H. influenzae ATCC E. coli ATCC Penicilline G Oxacilline Amoxicilline/ Ac.clavulanique Cefuroxime Cefaclor Cefotaxime Cefpodoxime Ceftriaxone Chloramphenicol Azithromycine Clarithromycine Erythromycine Clindamycine Tetracycline Amoxicilline Cefepime Cefixime Tetracycline Spiramycine Telithromycine Pristinamycine Vancomycine Teicoplanine Levofloxacine Ampicilline Azithromycine Clarithromycine Co-trimoxazole Tetracycline Chloramphenicol Amoxicilline/ Acide clavulanique

31 Mode opératoire : Préparation de l inoculum Celui-ci est préparé en réalisant une suspension d une ou de deux colonies obtenues à partir d une culture jeune (15 à 24 heures) pour Streptococcus pyogenes et Moraxella catarrhalis. Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae ont été testées en même temps que les souches de contrôle de qualité. Le premier jour, les souches de H. influenzae isolées et H. influenzae ATCC et ATCC ont été repiquées sur gélose au chocolat et incubées à 37 C sous 5% de CO 2 pendant 20 à 24 heures. Les souches de contrôle Staphylococcus aureus ATCC et Escherischia coli ATCC ont été repiquées sur MH agar et incubées à C en air ambiant pendant 18 à 24 heures. Les souches de Streptococcus pneumoniae ainsi que la souche de contrôle ATCC ont été repiquées sur gélose au sang agar et incubées à 5% de CO 2 pendant 16 à 18 heures. La suspension est calibrée à l échelle 0,5 de la gamme Mac Farland. Ensemencement et application des disques Il a été fait par écouvillonnage. Les géloses utilisées ont été choisies en fonction des exigences des espèces à tester : gélose au sang agar pour Streptococcus pneumoniae, Gélose au sang de mouton pour Streptococcus pyogenes, GSC polyvitex pour Moraxella catarrhalis et gélose HTM pour Haemophilus influenzae. Les boîtes ont été incubées à 37 C sous 5% de CO 2 pendant 18 à 24 heures; 20 à 24 heures pour S. pneumoniae et 16 à 18 heures pour H. influenzae. Les disques d antibiotiques ont été appliqués à la surface de la gélose à l aide d une pince en appuyant légèrement. Pour chaque germe différents antibiotiques ont été testés. (Tableau IV et V)

32 Tableau IV : Antibiotiques testés pour les germes exigeants - Matériels et Méthodes - Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Oxacilline Penicilline G Amox/Ac.clav. Amox/Ac.clav. Penicilline G Amoxicilline Ampicilline Ampicilline Amox/Ac.clav. Cefotaxime Cefepime Cefepime Céfépime Cefixime Cefotaxime Cefotaxime Cefotaxime Cefpodoxime Cefixime Cefixime Cefixime Ceftriaxone Cefpodoxime Cefpodoxime Cefpodoxime Azithromycine Ceftriaxone Ceftriaxone Ceftriaxone Erythromycine Azithromycine Azithromycine Erythromycine Spiramycine Pristinamycine Pristinamycine Azithromycine Clindamycine Clarithromycine Clarithromycine Spiramycine Pristinamycine Levofloxacine Levofloxacine Clarithromycine Levofloxacine Chloramphenicol Chloramphenicol Clindamycine Chloramphenicol Tetracycline Tetracycline Pristinamycine Telithromycine Co-trimoxazole Co-trimoxazole Levofloxacine Teicoplanine Chloramphenicol Vancomycine Teicoplanine Tetracycline Telithromycine Tetracycline Co-trimoxazole Tableau V : Antibiotiques testés pour les germes non exigeants Staphylocoques Streptocoques Entero Non fermentaires bactéries Oxacilline Penicilline G Ampicilline Ticarcilline Penicilline G Amoxicilline Amox/Ac.clav Cefepime Amox/Ac.clav Amox/Ac.clav Ticarcilline Ceftazidime Cefepime Cefepime Cefepime Aztreonam Amikacine Chloramphenicol Ceftazidime Amikacine Kanamycine Amikacine Ceftriaxone Gentamicine Chloramphenicol Gentamicine Amikacine Kanamycine Erythromycine Kanamycine Gentamicine Doxycycline Spiramycine Erythromycine Kanamycine Polymixine B Pristinamycine Pristinamycine Chloramphenicol Ciprofloxacine Doxycycline Doxycycline Doxycycline Rifampicine Ciprofloxacine Polymixine B Vancomycine Rifampicine Ciprofloxacine Ciprofloxacine

33 Lecture et interprétation : Les diamètres d inhibition ont été mesurés à l aide d une règle à coulisse, puis comparés aux valeurs critiques de l antibiotique correspondant. Le germe est dit sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant (R) suivant le diamètre d inhibition mesuré

34 Tableau VI : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour les Staphylocoques selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R Β-lactamines Oxacilline Penicilline G Amox/Ac.clav Cefepime Aminosides Amikacine Kanamycine Phénicolés Chloramphenicol Macrolides Erythromycine Spiramycine Streptogramines Pristinamycine Cyclines Doxycycline Rifamycines Rifampicine Glycopeptides Vancomycine Fluoroquinolones Ciprofloxacine 5 µg µg µg µg µg UI µg UI µg µg UI µg µg µg

35 Tableau VII : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour les Streptocoques selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R Β-lactamines Penicilline G Amoxicilline Amox/Ac.clav Cefepime Phénicolés Chloramphenicol Aminosides Amikacine Gentamicine Kanamycine Macrolides Erythromycine Streptogramines Pristinamycine Cyclines Doxycycline Fluoroquinolones Ciprofloxacine Rifamycines Rifampicine 10 µg µg µg µg µg µg µg UI UI µg UI µg µg

36 Tableau VIII : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour les Entérobactéries selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R Β-lactamines Amoxicilline Amox/Ac.clav Ticarcilline Cefepime Ceftazidime Ceftriaxone Aminosides Amikacine Gentamicine Kanamycine Phénicolés Chloramphenicol Cyclines Doxycycline Polymixines Polymixine B Fluoroquinolones Ciprofloxacine 25 µg µg µg µg µg µg µg µg UI µg UI µg µg

37 Tableau IX : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour les bacilles non fermentaires selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R Β-lactamines Ticarcilline Céfépime Ceftriaxone Ceftazidime Aztreonam Aminosides Amikacine Gentamicine Kanamycine Cyclines Doxycycline Polymixines Polymixine B Fluoroquinolones Ciprofloxacine 75 µg µg µg µg µg µg µg UI UI µg µg

38 Tableau X : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour Streptococcus pneumoniae selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R B-Lactamines Oxacilline Penicilline G Amox/Ac.clav Cefepime Cefotaxime Cefixime Cefpodoxime Ceftriaxone Macrolides Erythromycine Azithromycine Spiramycine Clarithromycine Lincosamines Clindamycine Streptogramines Pristinamycine Fluoroquinolones Levofloxacine Phénicolés Chloramphenicol Glycopeptides Teicoplanine Kétolides Telithromycine 1 µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg

39 Suite Tableau X [49] Tétracycline Tétracycline Glycopeptides Co-trimoxazole 30 µg µg Tableau XI : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour Streptococcus pyogenes selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R B-Lactamines Penicilline G Amoxicilline Cefotaxime Cefixime Cefpodoxime Ceftriaxone Macrolides Azithromycine Erythromycine Spiramycine Lincosamines Clindamycine Streptogramines Pristinamycine Fluoroquinolones Levofloxacine Phénicolés Chloramphenicol Kétolides Telithromycine 10 µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg

40 Suite Tableau XI [49] Glycopeptides Teicoplanine Vancomycine Tetracyclines Tetracycline 30 µg µg µg Tableau XII : Critères d interprétation des diamètres d inhibition proposés pour Haemophilus influenzae selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R B-Lactamines Ampicilline Amox/Ac.clav Cefotaxime Cefixime Cefpodoxime Ceftriaxone Céfépime Macrolides Azithromycine Clarithromycine Streptogramines Pristinamycine Fluoroquinolones Levofloxacine Phénicolés Chloramphenicol Tétracyclines Tetracycline 10 µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg

41 Suite Tableau XII [49] Sulfamides Co-trimoxazole µg Tableau XIII: Critères d interprétation des diamètres d inhibition pour Moraxella catarrhalis selon les normes NCCLS/CLSI [49] Antibiotiques Charge du disque Diamètres en mm S I R Β-Lactamines Amox/Ac.clav Ampicilline Cefepime Cefotaxime Cefixime Cefpodoxime Ceftriaxone Macrolides Azithromycine Clarithromycine Streptogramines Pristinamycine Fluoroquinolones Levofloxacine Phénicolés Chloramphenicol Tétracyclines Tetracycline Sulfamides Co-trimoxazole µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg µg

42 I Détection de la production de bêta-lactamase (méthode à la cefinase) Principe : Elle est basée sur la mise en évidence de l enzyme grâce à son pouvoir d hydrolyser le cycle bêta-lactame des bêta-lactamines. La détection se fera grâce à une céphalosporine chromogène : la nitrocéfine, jaune au départ qui vire au rouge si le cycle est ouvert. Technique : - Déposer un disque de nitrocéfine sur une lame porte objet. - Humidifier le disque avec de l eau physiologique - Prélever plusieurs colonies et les déposer sur le disque Résultats : S il se développe une coloration rouge, la souche est productrice de bêtalactamase. Cette méthode est sensible et permet d écarter le traitement par bêtalactamine pour les souches productrices de bêta-lactamase. I Détermination de la CMI par E-Test (Epsilometer-Test) Principe : Il est basé sur la détermination de la CMI en utilisant des bandelettes imprégnées d un gradient exponentiel continu de l antibiotique à tester. Le E-test associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide

43 Le système E-test consiste en une bande en plastique non poreuse calibrée par un gradient pré établi de concentration d antibiotiques couvrant 15 dilutions pour déterminer la CMI en µg/ml d une souche testée en milieu gélosé. Le gradient couvre une rangée de concentration de 0,016 à 256 µg/ml ou 0,002 à 32 µg/ml. Les bandelettes sont appliquées à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec un inoculum de la souche à étudier. Après incubation on pourra lire la CMI. I Contrôle de qualité des E-Test et détermination de la CMI des différents germes Tableau XIV : E-test testés pour chaque souche de référence S. pneumoniae ATCC (gélose au sang agar) S. aureus ATCC (gélose MH agar) H. influenzae ATCC (gélose HTM) H. influenzae ATCC (gélose HTM) E. coli ATCC (gélose MH agar) Penicilline G Amoxicilline Amoxicilline/ Ac.clavulanique Cefuroxime Cefaclor Cefotaxime Cefpodoxime Ceftriaxone Azithromycine Clarithromycine Erythromycine Levofloxacine Ofloxacine Oxacilline Cefixime Teicoplanine Ampicilline Amoxicilline/ Ac.clavulanique Ceftriaxone Azithromycine Clarithromycine Ofloxacine Cefuroxime Cefaclor Amoxicilline/ Acide clavulanique

44 Réalisation de la technique E-test : Préparation de l inoculum Celui-ci est préparé en réalisant une suspension de colonies viables à partir d une culture pure pour Streptococcus pyogenes et Moraxella catarrhalis. Pour H.influenzae et S.pneumoniae, voir antibiogramme standard par méthode des disques. La suspension est calibrée à l échelle 0,5 Mac Farland. Ensemencement Le E-test se fait de préférence dans des boîtes de Pétri de 150 mm de diamètre ce qui permet de déposer un maximum de six bandes. Les géloses utilisées ont été choisies en fonction des exigences de chaque germe. Après 15 minutes, à partir de l inoculum les géloses au sang agar pour S. pneumoniae, MH agar pour S. aureus et E. coli sont ensemencées. De même que la gélose HTM agar pour H. influenzae. Les géloses GSO de mouton pour S. pyogenes et GSC + polyvitex pour Moraxella catarrhalis sont également ensemencées. L ensemencement se fera par écouvillonnage ; imbiber un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne et essorer sur le rebord du tube. Passer l écouvillon sur toute la surface de la gélose par simple rotation de 120 C

45 Tableau XV : Recommandations du NCCLS/CLSI pour la réalisation des E-test Germes S. pneumoniae S. pyogenes H. influenzae M. catarrhalis Milieux Gélose au sang Gélose MH agar Gélose HTM agar Gélose MH agar Mac Farland 0,5 0,5 0,5 0,5 Incubation Temps h h h h C Atmosphère 5% CO2 5% CO2 5% CO2 5% CO2 Application des bandes E-test - Sortir le paquet de bandelettes E-test du freezer et le laisser quelques minutes à la température ambiante (pour permettre l évaporation de l humidité). - Éviter de toucher les zones chargées d antibiotiques. - Prélever bandelette par bandelette à l aide de l applicateur et les déposer à la surface de la gélose en évitant de déplacer les bandes car l antibiotique diffuse dans le milieu en quelques secondes

46 - Incuber les cultures à 37 C sous une atmosphère de 5% de CO 2 pendant 20 à 24 heures. Mais en air ambiant lorsque l on veut tester les macrolides sur S. pneumoniae et dans le cas de E. coli et S. aureus pour tous les antibiotiques. Lecture et interprétation Après incubation, l inhibition de la croissance s est traduite par une ellipse d inhibition dont les points d intersection avec la bandelette déterminent la CMI. Une échelle de lecture imprimée sur la bandelette a permis une interprétation rapide. La lecture n a pas posé de problème pour les zones d inhibition nette et symétrique. Néanmoins une asymétrie des points d intersection de l ellipse avec la bandelette a conduit à lire la CMI au niveau le plus élevé. Une zone de décrochage à la zone de lecture a imposé de lire la CMI en extrapolant la courbe de l ellipse après lecture. L interprétation a été faite en s aidant des valeurs fournies par la NCCLS qui sont des valeurs critiques qui délimitent chaque antibiotique

47 Tableau XVI : Valeurs critiques des antibiotiques utilisés en E-test selon les normes NCCLS/CLSI [49] Germes Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis S R S R S R S R CMI en µg/ml Antibiotiques Penicilline G Oxacilline Ampicilline Amoxicilline 2 8 Amoxicilline/Acide 2\1 clavulanique 8\4 4\2 8\ Cefotaxime Cefixime Cefuroxime Cefaclor Ceftriaxone Cefpodoxime Erythromycine Azithromycine Clarithromycine Levofloxacine Ofloxacine Chloramphenicol Teicoplanine Stockage des bandes E-test : Les paquets d'e-test sont stockés au freezer, à -20 C. Après ouverture d'un paquet, les bandes inutilisées doivent être gardées dans des tubes de stockage hermétique contenant un dessiccateur et placées à -20 C. Il faut toujours : - s'assurer que le dessiccateur est bleu avant l'utilisation de la bande. - Marquer les tubes de stockage avec une étiquette indiquant la date de péremption, le numéro de lot et le code de l'antibiotique

48 - Ne stocker que le même type d'antibiotique par tube. I Critères d interprétation Calcul des CMI 50 et CMI 90 C est la détermination de la médiane par la méthode d extrapolation linéaire. Les CMI 50 et les CMI 90 sont données par la formule suivante : X = A - B C - B x (Z Y) + Y Si X = CMI 50 A = moitié des colonies inhibées B = effectifs cumulés immédiatement inférieurs à A C = effectifs cumulés immédiatement supérieurs à A B < A < C Y = CMI de B Z = CMI de C Si X = CMI 90 A = 90% des souches inhibées B = effectifs cumulés immédiatement inférieurs à A C = effectifs cumulés immédiatement supérieurs à A B < A < C Y = CMI de B Z = CMI de C

49 I.2.7. Contrôle de qualité des tests de sensibilité Nous avons eu à utiliser les normes NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory) qui permettent d obtenir des souches de contrôle de source sûre ATCC (American Type Culture Collection) et d entretenir correctement les souches de contrôle de qualité par une conservation selon deux méthodes : En stock culture pour une utilisation en continu des souches. A -70 C dans des cryotubes avec des billes, ce qui permet un stockage de longue durée durant laquelle la souche est stable. Ces normes permettent aussi d utiliser dans toutes les séries de détermination de la sensibilité des souches de référence ATCC. Ces souches ont été testées en parallèle comme contrôle de qualité afin de valider le test. Les souches de référence ont été pour : Streptococcus pyogenes : ATCC Enterococcus faecalis Streptococcus pneumoniae : ATCC Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae et Moraxella catarrhalis : ATCC Haemophilus influenzae De plus il a été effectué un contrôle de qualité à plusieurs niveaux : vérification de la date de péremption des produits et réactifs utilisés un stockage correct des milieux de culture, des souches, des disques une manipulation correcte en respectant le protocole vérification des normes de culture (profondeur de la gélose 4 à 5 mm, respect des exigences nutritives des souches bactériennes et de la capacité de croissance supportée par les différents milieux)