Radiobiologie des électrons Auger utilisés en radioimmunothérapie
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- Danièle Martin
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1 Radiobiologie des électrons Auger utilisés en radioimmunothérapie Bérengère PIRON Thèse dirigé par le Dr. Jean-Pierre Pouget (IRSN) Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier/ INSERM U896 (Dr. André Pèlegrin) INSERM U892 (Dr. Manuel Bardiès) LARD 17 Octobre 2008
2 Traitement du cancer 2/32 Survie/ Chirurgie Immunothérapie Cellule tumorale Noyau Curiethérapie Radiothérapie Chimiothérapie RadioImmunoThérapie ()
3 RadioImmunoThérapie? 3/32 Ciblage d un antigène associé au tumeur avec un anticorps monoclonal radiomarqué Survie/ Trois paramètres Antigène associé à la tumeur monoclonal (mab) Tumour cell Radioisotope Particules (β,γ ) Energie Demi-vie TEL
4 RadioImmunoThérapie 4/32 Survie/ En clinique Deux spécialités de pour le traitement des lymphomes B nonhodgkiniens (approuvation par la FDA): Zevalin : anti-cd20 + Yttrium 90 (émetteur béta) Bexxar : anti-cd20 + Iode 131 (émetteur béta) Notre projet Traitement des tumeurs solides de petite taile (cancer du sein, colorectal ) Radiorésistance Augmentation de l activité injectée Myélotoxicité Utilisation d un radionucléide avec un fort TEL
5 Quel type de radionuclide? 5/ I, 111 In 213 Bi, 225 Ac 90 Y, 131 I Auger e- alpha Beta 2-10 mm Noyau 4-12 µm 8-15 µm
6 ? 6/ N M L K Energie :10 ev- 1 kev Parcours : nm
7 : particules de haut-tel 7/32 Survie/ Single lesion High-LET Auger irradiation TEL : 4-26 KeV/µm Multiply DNA damage sites Low-LET beta irradiation TEL : 0.2 KeV/µm Ionisations/Excitations
8 Survie/ Choix de l anticorps internalisant vs non-internalisant mab En, deux localisations finales: Cytoplasme : anticorps internalisant Membrane: anticorps non-internalisant 8/32 Nucleus Noyau Cellule tumorale
9 Survie/ En, deux localisations finales: Cytoplasme : anticorps internalisant Membrane: anticorps non-internalisant Plusieurs études ont montré une forte toxicité des particules de haut-tel lorque l émitteur est à proximité de l ADN Une localisation cytoplasmique de l Ac serait donc plus toxique Objectif du projet: Choix de l anticorps internalisant vs non-internalisant mab Comparer la cytotoxicité des anticorps internalisant et non-internalisant lorsqu ils sont marqués à l Iode 125, émetteur Auger 8/32
10 9/32 Survie/ : L anticorps internalisant radiomarqué est-il plus toxique que l anticorps non-internalisant?
11 10/32 Survie/ Lignée cellulaire de carcinome colique: HCT116 marqué à l Iode 125 : internalisant: anti-her1 (EGFR) non-internalisant: anti-cea Activités croissantes de 0 à 4 MBq/mL
12 11/32 J0 J1 PBS J3 Survie/ Ensemencement des cellules radiomarqués J2-J3-J4-J7 : Comptage cellulaire et mesure de l activité incorporée J12 : Test de survie clonogénique Rinçage Détection gamma
13 Survie = f(activités volumiques) 12/32 Survie/ % survie Activités (MBq/mL) internalisant mab-i125 non-internalisant mab-i125 irrelevant mab I125 BUT Pour réellement comparer les 2 modèles (internalisant et noninternalisant) Un référentiel commun indépendant de : La densité antigénique La dose moyenne d irradiation au L immunoréactivité des anticorps noyau
14 La dose moyenne d irradiation au noyau D? 13/32 Survie/ Comparaison entre différente association anticorps/radionuclide Utilisation du Medical Internal Radiation (MIRD) à l échelle cellulaire D = ~ Arh S (N Cy) (N CS) Activité incorporée par la cellules Défini expérimentalement Quantité d énergie délivrée au noyau à chaque désintégration Determiné par simulation numérique
15 Activité incorporée par cellule 14/32 Survie/ Temps (jour) internalisant-i125 Aire sous la courbe Temps (jour) noninternalisant-i125 A ~
16 15/32 Survie/ Self dose Cross dose Volume dose S(n<--CS) S(n<--Cy) S(n<--CS) S(n<--Cy) S(n<--Vol) (Gy/Bq,s) (Gy/Bq,s) (Gy/Bq,s) (Gy/Bq,s) (Gy/Bq,s) HCT E E E E E-06 S(n<--Cy) : irradiation cytoplasmique S(n<--CS) : irradiation membranaire S(n<--Vol) : irradiation du volume
17 moyenne d irradiation au noyau 16/32 Survie/ Pour l irradiation cytoplasmique : D=A(Cy)*S(n<--Cy,self dose)+a(cy)*3*s(n<--cy, cross dose)+a(vol)*s(n<--vol) Pour l irradiation membranaire : D=A(CS)*S(n<--CS,self dose) + A(CS)*3*S(n<--CS, cross dose)+ A(vol)*S(n<--Vol) Dans les 2 cas, prise en compte de 2 divisions cellulaires pendant le temps de la manip
18 Survie vs dose d irradiation au noyau 17/ internalisant mab-i125 non-internalisant mab-i125 Survie/ % survie (Gy) Corrélation des effets biologiques avec la dose d irradiation au noyau Toxicité plus importante avec l anticorps non-internalisant qu avec l anticorps internalisant marqué à l iode 125 La membrane cellulaire peut-elle être une cible appropriée des électrons Auger dans le cadre de la?
19 18/32 Survie/ : Quels sont les mécanismes impliqués dans la sensibilité membranaire? Quelles sont les protéines activées en réponse à cette irradiation très spécifique?
20 IR Schéma général SMase 19/32 Survie/ Sphingomyelin ATM/ATR p53 p21? Arrêt du cycle Réparation de l ADN? p38 APOPTOSE SURVIE
21 Survie/ IR Schéma général I- Lésions de l ADN Microélectrophorèse sur gel Test des micronoyaux 20/32
22 Lésions de l ADN 21/32 Cellules incluses dans gel d agarose Microélectrophorèse sur gel lame de verre Survie/ Noyau Lyse Sans traitement -Electrophorèse (0,6 V/cm, 1h ) -Coloration à l IP -Analyse sous microscope de fluorescence Après irradiation Calcul du TAIL MOMENT = Tail lenght Tête Tail
23 Survie/ Tail moment Tail moment (A) (B) 0, ,12 3 (Gy) 0,48 7 0,96 estimée (Gy) 10 1,92 Lésions de l ADN (A) Contrôle en haut DDD en RTE (B) Traitement internalisant- 125 I (C) Traitement non-internalisant- 125 I Tail moment (C) 0,00 0,01 0,03 0,08 estimée (Gy) 0,10 22/32 (Contrôle négatif : tail moment 3 pour 0,02 Gy)
24 Lésions de l ADN 23/32 Survie/ 0,3 Test des micronoyaux Les micronoyaux sont des entités nucléaires indépendantes du noyau principal, présentes au sein du cytoplasme. Ils proviennent de la perte de fragments chromosomiques. Blocage de la cytodiérèse 24h avant l observation avec la cytochalasin B Réalisation à différents temps d incubation (24h, 48h et 72h) Micronoyaux par cellule binuclée 0,25 0,25 0,2 0,15 0,1 0, internalisant-i125 0,2 0,15 0,1 0,05 0 en Gray 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 noninternalisant-i125
25 Lésions de l ADN 24/32 Survie/ Au final, dans le cas de l irradiation membranaire : En comparaison avec l anticorps cytoplasmique, le tail moment est important par rapport à la dose délivrée au noyau De plus, pour les très faibles doses délivrées, on observe un nombre de micronoyaux relativement important Lésions à l ADN engendrées par l atteinte des particules gamma Mais un différentiel avec l anticorps internalisant peut-être lié à l irradiation de la membrane Certaines protéines ou molécules engendreraient des effets à l ADN (radicaux libres ou autres)? D autres protéines limiteraient le mécanisme de réparation homologue?
26 Survie/ IR Schéma général II- Activation des protéines Test de survie clonogénique sur HCT116 p53 +/+ et HCT116-KO p53 -/- Western blotting : activation de p53 et p21 après ATM/ATR p53 traitement? p21 Arrêt du cycle Réparation de l ADN APOPTOSE SURVIE 25/32
27 P53-p21 26/32 Internalising I125-mAb p53 Survie/ % mort cellulaire (Gy) p21 à 48h % mort cellulaire Non-internalising I125-mAb Pas de différence de mort en fonction du statut p53 p53 est activé à 24h (Gy) p21 est activé à 48h
28 Survie/ IR Schéma général SMase Sphingomyelin p38 III- La voie du céramide Dosage du céramide total par HPLC Inhibiteurs de la voie du céramide 27/32
29 La voie du céramide 28/32 Survie/ Dosage du céramide total : en collaboration avec le Laboratoire de Radiologie Cellulaire de l université de Lyon 1 Cinétique sur 3 lignées cellulaires avec les 2 types de traitement En cours d évaluation
30 Les inhibiteurs de la voie du céramide 29/32 Synthèse de novo Synthèse par hydrolyse de SM
31 30/32 Survie/ 1- Toxicité plus importante d un traitement ciblant la membrane dans les conditions d une Auger 2- Plusieurs voies possibles pour expliquer l effet différentiel entre le ciblage membranaire et cytoplasmique des électrons Auger: Effet à l ADN du à l activation de protéines ou à l effet indirect des radicaux libres? Activation de p53 dans les 2 types de traitements Mais pas de différence de réponse selon le statut p53 : l apoptose induite par l irradiation Auger n est pas p53 dépendante! Activation de p21 seulement après le traitement membranaire!
32 31/32 Survie/ De manière générale : confirmer l apoptose induite par les électrons Auger et évaluer la participation des radicaux libres (ROS) I-Lésions à l ADN : Confirmer les résultats par test de comètes et micronoyaux Evaluer la phosphorylation de l histone H2AX après les 2 types de traitement II-Activation des protéines: Observer par WB la phosphorylation de p53 par les protéines activées par les lésions de l ADN (ATM) par les protéines activées par la membrane : p38 Observer l accumulation et la phosphorylation de p38 par le céramide I-La voie du céramide : Dosage du céramide total puis membranaire (HPLC, FACS) Test de l activité de la Smase Test avec différents inhibiteurs de la voie du céramide
33 Remerciements: 32/32 U896 Montpellier (A.Pèlegrin): Jean-Pierre Pouget Samir Boutaleb Lore Santoro Véronique Garambois Nathalie Kersual Monique Pèlegrin U892 Nantes: Nicolas Chouin Manuel Bardiès INM Montpellier : Jean-Marc Brondello
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