Cécile DALARD DESS EGPR

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1 Cécile DALARD DESS EGPR

2 RÉSUMÉ 3 1. INTRODUCTION 2 A. PRÉSENTATION DU VIRUS HIV ET DE LA PROTÉASE HIV 2 B. CARACTÉRISTIQUES DE LA PROTÉASE HIV 2 2. MISE EN ÉVIDENCE DU RÔLE DE LA PROTÉASE HIV 2 A. MATURATION DES POLYPROTÉINES VIRALE GAG ET GAG-POL 2 I. MATURATION DE GAG 2 II. MATURATION DE POL 4 B. MORPHOLOGIE DES VIRIONS 4 C. POUVOIRS INFECTIEUX 6 3. LA PROTÉASE HIV, UNE CIBLE THÉRAPEUTIQUE 8 A. LES INHIBITEURS DU SITE ACTIF DE LA PROTÉASE 8 B. PERSPECTIVES 10 C. LES INHIBITEURS DE LA DIMÉRISATION 10 CONCLUSION 12 RÉFÉRENCES 13 2

3 Résumé Le virus HIV a été caractérisé dans les années 1980 et encore aucun traitement ne s est avéré totalement efficace. Même si il est actuellement possible d augmenter de façon très significative la durée de vie des malades, aucune rémission totale n a encore été observée. Plusieurs mécanismes clefs indispensables à la réplication du virus ont été identifiés, dont la protéase HIV qui permet la maturation des protéines virales. Les inhibiteurs de protéases sont utilisés en thérapie dès 1997 mais rapidement des phénomènes de résistances aux traitements sont apparus, la protéase étant capable de rapide variations de sa séquence en acides aminés. Cependant, la résolution de la structure de l enzyme par cristallographie et l identification des acides aminés impliqués dans la résistance aux drogues permet le dessin de nouvelles générations d inhibiteurs plus spécifiques et moins sensible aux mutations de la protéase virale. Mots clefs : HIV-1, aspartyl-protéase, inhibiteurs, maturation, GAG-POL 3

4 FIG 1 : expression des gènes HIV Les gènes sont transcrits sous forme d un seul ARNm qui sera plus ou moins épissé pour donner les différentes protéines HIV. Les gènes GAG, POL et ENV sont traduits sont forme de précurseurs ou polyprotéines qui seront clivées en leurs différentes forme matures soit par les protéases cellulaires (ENV) soit par la protéase virale. FIG 2 : structure de la protéase HIV sous sa forme dimérique déduite de la structure cristalline A : Les monomères sont représentés en bleu et rouge, ASP 25 est le résidu catalytique. Les boules grises et bleues représentent les sphères de van der Walls. B : La zone de dimérisation est constituée du Cterm et Nterm de chaque monomère et forme des feuillets bêta anti parallèle. En vert représentation du flap zone flexible qui permet l entré du substrat dans la poche catalytique. En jaune et rouge sont représentés les régions qui forment des épingles à cheveux. 1

5 1. Introduction A. Présentation du virus HIV et de la protéase HIV Le virus HIV appartient à la famille des rétrovirus, après infection, l ARN viral est reverse transcrit et s intègre au génome de la cellule infectée. Le génome (figure 1) code pour 9 protéines (1), soit 2 protéines régulatrices TAT et REV, 4 protéines accessoires (Vpu, Vpr, Vif, and Nef) et pour 3 protéines de structures très conservées chez les rétrovirus, qui sont gag, pol et env. Ces dernières sont traduites sous forme de polyprotéines ou protéines de fusion et seront ensuite clivées par une protéase en leur unité fonctionnelle. La polyprotéine ENV une fois clivée par les protéases cellulaires libère les protéines de l enveloppe gp 120 et gp 160. La protéine de fusion GAG (appelé aussi p55) donne après maturation les protéines de la matrice (p17), de la capside (p24), de la nucléocapside (p9) et p6 (2). Le gène pol est lui traduit en fusion avec GAG pour donner le précurseur GAG-POL (p160). Cet évènement est produit par un motif structural de l ARN au niveau de la région codant pour p6 et lorsque les ribosomes arrivent à ce motif, ils continuent la traduction jusqu'à l ORF de POL (environ 5% des cas)(3). Le précurseur POL libère, une fois clivé, la protéase virale, la reverse transcriptase, les RNases et les intégrases (4). La maturation de GAG et POL se fait de façon tardive dans le virion nouvellement formé, dans un premier temps la protéase s auto libère puis clive ensuite les deux polyprotéines avant d être inactivée par les antiprotéases cellulaires (5). B. Caractéristiques de la protéase HIV La protéase HIV appartient à la famille très conservée des aspartyl-protéases, dont le résidu catalytique est un acide aspartique (résidu 25) (6). Elle est composée de 99 acides aminés est n est active que sous sa forme homodimérique (7). La constante de dissociation du dimère (kd) est inférieure à 5 nm (8), une fois formé il est donc très stable. L enzyme est composée de plusieurs régions structurales (figure 2) et fonctionnelles : une de dimérisation, une permettant l entée du substrat et une catalytique constituée des ASP 25 de chaque monomère (figure 2). Les 4 premiers 2

6 FIGURE 3 : processus de clivage par la protéase HIV Détails du processus de clivage peptidique entre un résidus phényle et proline par la protéase HIV. Attaque nucléophile d une molécule d eau sur le carbonyle entre les résidus phényle et proline et clivage de la liaison peptidique. Entre crochet : l état transitionnel. FIGURE 4 : schémas des protéines virale GAG et POL En couleurs sont indiqués les régions reconnues par les anticorps utilisés lors du western blot [A77003] µm O,1 0,33 1,0 3,0 FIGURE 5 : Maturation du précurseur protéique GAG en présence d inhibiteur de protease Les cellules sont infectées par le virus puis cultivées pendant 4 jours en présence de différentes concentrations en inhibiteur de la protéase (A77003, en bas les différentes concentrations). Les virions produits sont ensuite récupérés et leur contenu protéique est analysé en Western blot. Les pistes en rouge sont révélées avec un anticorps dirigé contre p17, en bleu avec un anticorps dirigé contre p24 et en vert contre p6. 1

7 acides aminés Nterm et les 5 derniers Cterm de chaque monomère forment deux feuillets β anti-parallèle responsables à eux seul de 75 % de l énergie de stabilisation du dimère (9). Les acides aminés 32 à 63 forment eux le Flap, région flexible qui permet l entrée du substrat dans la poche catalytique et qui forme une structure en épingle à cheveux (10). L enzyme est substrat-spécifique et coupe entre les phényles et les prolines ou entre les tyrosines et les prolines selon le processus décrit dans la figure 3. Une molécule d eau présente dans la poche catalytique permet l attaque nucléophile sur le substrat qui aboutira au clivage de la liaison peptidique. 2. Mise en évidence du rôle de la protéase HIV Plusieurs stratégies d inactivation de la protéase HIV ont été mise en œuvre pour définir son implication exacte dans les processus de maturation et de réplication du virus, par exemple par mutagenèse ou encore par l intermédiaire d un inhibiteur spécifique. A. Maturation des polyprotéines virale GAG et GAG-POL i. Maturation de GAG Afin d étudier l implication exacte de la protéase HIV dans le phénomène de maturation des protéines virales, l équipe de Kaplan (11) a cultivé pendant 4 jours des cellules (préalablement infectées) avec différentes concentrations en A77003 (12) (inhibiteur du site catalytique de la protéase virale). Le surnageant de culture est prélevé et le contenu protéique des virus néo-synthétisés est analysé en western blot. A l aide de différents anticorps dirigés contre les protéines p17 (figure 4), en rouge), p24 (en bleu), et p6 (en vert), les auteurs ont cherché à voir l effet de l inactivation de la protéase par l inhibiteur A77003 sur la maturation du précurseur protéique GAG. Les résultats sont représentés figure 5, on constate qu en absence de A77003 seules les formes matures p17 et p24 sont présente (ligne 1 et 2) et que plus la concentration en inhibiteur augmente plus la quantité de forme mature diminue au 2

8 FIGURE 6 : Effet de l inhibition de la protéase HIV sur la maturation du précurseur protéique POL Les cellules sont infectées par le virus puis cultivées pendant 4 jours en présence de différentes concentrations en inhibiteur de la protéase (A77003), 1 (sans inhibiteur), 2 (0,1 µm), 3 (0,33 µm), 4 (1,0 µm) et 5 (3 µm). Les virions produits sont ensuite récupérés et leur contenu protéique est analysé en Western blot et révélé avec un anticorps monoclonal dirigé contre la reverse transcriptase (p66, p51 formes matures) et ses formes immatures. [A77003] 0,33µM 1,0 µm 2,0 µm FIGURE 7 : Effet de l inactivation de la protéase HIV sur la morphologie des virions Des cellules préalablement infectées par le virus sont cultivées en présences de différentes concentration en inhibiteur A Les cellules sont cultivées pendant 5 jours puis le surnagent est observé en microscopie électronique (A), les différentes morphologies observées en fonction de la concentration en inhibiteur sont quantifiées (B), entre parenthèse pourcentage total de chaque forme. 3

9 profit de formes non maturés. Pour la protéine p6, on observe la présence de forme non mature même en absence d inhibiteur (ligne 3) et plus la concentration en A77003 augmente, plus leurs quantités augmentent (ligne 6, 9, 12, 15). ii. Maturation de POL L équipe de kaplan a aussi cherché à voir si la présence de l inhibiteur de la protéase HIV (A77003) avait un effet sur la maturation du précurseur POL (qui comprend les unités protéiques : protéase, reverse transcriptase, RNAse et intégrase). Pour cela, ils ont procédé de la même manière que pour le précurseur GAG, sauf qu ils ont utilisé un anticorps pour le western qui reconnaît les formes mature et les précurseurs de la reverse transcriptase. La reverse transcriptase est un hétérodimère (sous unité p66 et p51) et l anticorps monoclonal utilisé reconnaît les deux monomères. Les résultats obtenus sont comparables à ceux obtenus pour le précurseur GAG. En absence d inhibiteur ou à faible concentration (0,1µM) seules les formes matures p66 et p51 de la RT sont visible, puis, plus la concentration en A77003 augmente plus la proportion de forme non mature augmente (figure 6). Il semble donc qu en présence d inhibiteur (protéase HIV non fonctionnelle), les précurseurs GAG et POL ne soient pas maturés normalement. De plus, un changement dans la morphologie des virus néoformés est observé lorsque les précurseurs GAG et POL ne sont pas totalement maturés (11). B. Morphologie des virions Observé en microscopie électronique, le virus HIV présente une zone de forte densité optique en son centre (phénotype sauvage WT, figure 7). Il a été montré que l inactivation de la protéase avait des conséquences sur la morphologie des virions (11), lorsque on incube avec l inhibiteur A77003 des cellules infectées par le VIH on observe l apparition de trois autres types de morphologie de virions. Certains virions présentent une zone de densité excentrée et associée à la membrane virale, d autres ont une densité périphérique formant un C et la dernière morphologie observée est nommée open ring et décrit un cercle autour de la membrane (figure 7). Les expériences ont montré que plus la concentration en inhibiteur A77003 est importante, plus la morphologie observée est celle open ring ; en effet, en absence 4

10 FIGURE 8 : dimère protéase HIV Illustration des acides aminés du site catalytique qui ont été muté pour diminuer l activité catalytique (kcat) sans toucher à l affinité pour son substrat (Km). FIGURE 9 : activité catalytique et affinité des protéases HIV mutantes Le kcat (activité catalytique) et le Km (constante d affinité) sont calculé par l intermédiaire du peptide NH2-ATLNFPISPWCOOH qui mime le site de coupure naturel entre la protéase et la réverse transcriptase. 5

11 d inhibiteur seulement 2% des virions présentent ce phénotype contre 91% en présence de 3 µm de A (figure 7). Il semble donc que la protéase soit impliquée dans la morphologie des virions puisque son inactivation provoque l apparition de nouveaux phénotypes. C. Pouvoir infectieux Une autre conséquence de l inactivation de la protéase est la chute du pouvoir infectieux. Il a été montré (13) que lorsque la protéase n est plus fonctionnelle, les virions produits ne sont plus capables d infecter de nouvelles cellules. Les auteurs ont choisi des mutants de la protéase dont seule l activité catalytique est modifiée (site de reconnaissance du substrat intact), pour cela ils ont utilisé les mutants déjà identifiés comme présentant ces caractéristiques (issus d une mutagenèse aléatoire) (14) : 3 acides aminés appartenant à la région catalytique on été mutés (figure 8), T26S (sérine à la place de thréonine 26), A28S (sérine à la place de alanine 28) et le mutant D25N dont l acide aspartique n 25 (résidus catalytique) est remplacé par une asparagine. Chaque mutant porte en plus la mutation Q7K (glutamine remplacée par une lysine en position 7) qui permet de limiter l activité autoprotéolytique de la protéase (15). L activité catalytique (kcat) et le Km (constante d affinité pour le substrat) de chaque protéase mutante sont déterminés par l intermédiaire d un substrat qui possède le site de clivage naturel entre la protéase et la reverse transcriptase, les résultats sont retranscrits figure 9. Il est montré que la mutation Q7K ne diminue ni le kcat, ni le Km, le mutant T26S et A28S présentent eux une activité catalytique diminuée voire quasi nulle sans que l affinité ne soit modifiée. Quand au dernier mutant, D25N, il aucune activité catalytique et pas d affinité pour le substrat. La région codant pour la protéase est mutée puis est réinsérée dans HIV-gpt proviral vector (16) qui contient tout le génome HIV sauf qu à la place du gène ENV, un gène de sélection a été inséré. Des cellules COS-7 sont ensuite cotransfectées avec HIV proviral vector et le vecteur HXB2-env (16) qui code pour la protéine ENV. Après 48h, le surnagent de culture (qui contient les virions) est prélevé et purifié. La quantité de virions est estimée en fonction de la quantité de protéines p24 (issues du précurseur GAG) détectées par ELISA. Afin que même les polyprotéines non maturées soient prisent en compte (pour les virions issus d une protéase défectueuse), une protéase exogène est ajouté, tout GAG est donc maturé en p24, 6

12 A B FIG 10 : pouvoir infectieux de virions produit à partir de protéases mutés Les virions issus de cellules cotransfectées par HIV proviral vector (dans lequel la séquence de la protéase mutée a été réimplantée) et HIV GPT sont quantifiés. Une protéase exogène est ajoutée aux protéines issues des virions et la quantité de p24 est estimée par ELISA. Des cellules HeLa T4 sont ensuite incubées en présence des virions et leur pouvoir infectieux est déterminé selon le protocole de Chesebro et al (15). FIG 11 : Structures des principaux inhibiteurs de protéase utilisés en thérapie Ce sont des inhibiteurs du site actif qui miment la structure du substrat naturel mais qui possèdent un site non clivable. Ils restent donc bloqués dans la poche catalytique et empêchent la protéase de cliver les protéines virales. 7

13 p17, p9 et p6 (l anticorps utilisé ne reconnaît pas les précurseurs non maturé). Les virus sont ensuite mis en présence de cellules HeLA T4 (qui possède le gène codant pour le récepteur T4) et 48 heures post infection, les cellules sont centrifugées (pour se débarrasser des éventuels virus) puis le nombre de cellules infectées est estimé par l intermédiaire d un anticorps primaire spécifique de gp160 (protéine de l enveloppe virale) puis révélé par l intermédiaire d un anticorps secondaire couplé à la peroxydase (17). Il en découle que lorsque la protéase n est plus active (kcat très bas ou nul) comme c est le cas pour A28S et D25N, aucun virion produit n est infectieux. Pour le mutant T26S dont l activité catalytique est environ trois fois plus faible que la protéase sauvage, seulement un tiers des virions produits sont infectieux (figure 10). Il a donc été montré que la protéase HIV est impliquée dans la maturation des précurseurs GAG et GAG-POL, et que son inactivation permet d obtenir des particules virales non infectieuses. C est parce que cette protéine présente un rôle clef qu elle a été une des premières cibles thérapeutiques pour lutter contre le VIH (l inhibiteur de protéase saquinavir a été autorisé dès 1995) et est toujours d actualité avec un nouveau inhibiteur autorisé par la FDA l année dernière aux états unis : Atazanavir (18). 3. La protéase HIV, une cible thérapeutique Les premiers inhibiteurs de protéase ont démontré leur efficacité dès 1995 et sont utilisés en thérapie depuis A. Les inhibiteurs du site actif de la protéase Ce type d inhibiteur a été le premier à être caractérisé. Leurs structures sont basées sur celle du substrat naturel de la protéase, mais ils possèdent un site non clivable et restent donc bloqués dans la poche catalytique de l enzyme l empêchant de pouvoir cliver les protéines virales (19). Plusieurs inhibiteurs de ce type sont utilisés en thérapie (figure 11). Ces inhibiteurs sont spécifiques de la protéase virale, en effet les sites de clivage (Phe-Pro et Tyr-Pro) sont différents de ceux des protéases cellulaires, il n y a donc pas de risque de réactions croisées. 8

14 Figure 12 : Région impliquée dans la dimérisation de la protéase virale A : structure du dimère, encadré en rouge les deus feuillets β antiparallèle impliquant le Cterminal et le Nterminal de chaque monomère. Structure responsable de 75% de l énergie de stabilisation du dimère. B : agrandissement des deux feuillets β les flèches verte et violette représentent les monomères et le sens indiqué est du Nterm vers le Cterm. FIGURE 13 : séquence de l inhibiteur de la dimérisation de la protéase HIV Les 6 résidus du haut sont identiques au C terminal et les 4 résidus du bas sont identiques au N terminal du monomère. FIGURE 14 : principe de l inhibition de la dimérisation de la protéase HIV Un inhibiteur qui possède les extrémités identiques au monomère est synthétisé et le phényle qui normalement, une fois l enzyme dimérisée, est à 4 A de la cystéine 95 est remplacé par une cystéine modifiée (rendue plus électrophile) pour qu il y ai génération d un pont disulfure. 9

15 Cependant l action de ces inhibiteurs est vite apparu non totalement satisfaisante, en effet la protéase étant hyper variable (20), un phénomène de résistance au traitement peut apparaître (21). Dans ces cas là, on assiste à une diminution de l affinité de la protéase pour les inhibiteurs sans que l affinité pour le substrat naturel ne soit modifiée de façon remarquable (22). Une stratégie employée pour limiter ce phénomène est de faire des traitements croisés avec d une part des inhibiteurs de protéases mais aussi avec des inhibiteurs de reverse transcriptase. Il a été montré que l utilisation de ce type de traitement limite très fortement l apparition de résistances (23). B. Perspectives La résolution de la structure de la protéase par cristallographie peu avant les années 90 (24) permet l arrivée de nouvelles générations d inhibiteurs dont la spécificité a pu être amélioré (prise en compte des liaisons faibles). Un grand nombre de protéases mutées ont été isolée et les acides aminés hypervariable ont été identifiés (25) ce qui permet le design par modélisation moléculaire d inhibiteurs stabilisés par des acides aminés plus conservés. Des nouveaux inhibiteurs qui sont actifs même avec les protéases HIV mutés ont été mis au point ; Atazanavir (26), vient d être accepté aux états unis et deux autres, Tripanavir (27) et Tmc 114 (28) sont actuellement en essais clinique. La résolution de la structure de la protéase virale permet aussi d envisager de nouveaux types d inhibiteurs comme par exemple, des inhibiteurs complémentaires d une région du monomère indispensable à la dimérisation de la protéase. C. Les inhibiteurs de la dimérisation Une autre stratégie d inactivation est de bloquer la dimérisation de l enzyme et donc l activité protéasique qui n est présente que chez le dimère. La région visée est le feuillet β anti-parallèle formé par les Nterm et Cterm de chaque monomère qui a lui seul est responsable de 75% de l énergie de stabilisation du dimère (figure 12) (29). Cette région étant très importante pour la dimérisation de l enzyme, elle est très conservée et pour l instant aucune mutation n a été observée ; ce qui fait de cette région une bonne cible pour l inhibiteur. L inhibiteur développé par l équipe de Zutshi (30) (figure 13) a en plus la possibilité de former un pont di-sulfure avec la cystéine 95 de la protéase ce qui rend le 10

16 complexe protéase inhibiteur très stable (figure 14). L inhibiteur est constitué de 23 acides aminés dont 6 sont identiques au Cterm du monomère et 5 au Nterm impliqués tout les deux dans la dimérisation, ils sont reliés entre eux par 12 acides aminés. Le phényle de l inhibiteur correspondant au phényle 99 de la protéase est remplacé par une cystéine qui est ensuite modifiée par traitement chimique pour la rendre plus électrophile et ainsi réagir plus facilement avec la cystéine 95 de la protéase (distance de 4 A entre les deux, (31)). Pour cela, de l acide 5-thio, 2- nitrobenzoic est attaché (réaction d Ellman s) au niveau du thiol de la cystéine de l inhibiteur (figure 13). Des expériences in vitro ont démontré l efficacité de cet inhibiteur avec un IC50 de 3,7 µm et une vitesse d inhibition de 0,012 min-1. Plusieurs types d inhibiteurs de dimérisation sont à l étude actuellement (32,33), ils ont toujours pour cible le feuillet β antiparallèle et sont dérivés du Nterminal et Cterminal de la protease. Ils sont différents au niveau du linker qui relie les deux parties. Ces inhibiteurs sont des inhibiteurs compétitifs qui bloquent l assemblage du dimère, il est donc important de définir quel linker permet la meilleure affinité pour le feuillet β. De plus, le mécanisme de folding et de dimérisation de la protease HIV étant encore mal connu, il est difficile de prévoir l efficacité de tels inhibiteurs in vivo. Deux théories s affrontent, l une affirme que le folding du monomère et la dimérisation sont simultanés (9), dans ce cas il semble difficile d inhiber le monomère puisque il n est présent que sous forme non foldé (or l inhibiteur est inactif sur l enzyme non foldé). L autre théorie avancée serait que le folding des monomères se ferait par association avec des monomères déjà foldés (34) et dans ce cas les inhibiteurs pourraient être efficaces contre les monoméres foldés. Pour ces raisons les inhibiteurs de la dimérisation ne sont encore qu en phase d étude. 11

17 Conclusion Les inhibiteurs du site actif de protéase du VIH sont les seuls à avoir actuellement un usage clinique. En raison de ses similitudes structurales et fonctionnelles, la protéase HIV a rapidement été identifiée comme un membre de la famille des aspartyl-protéases et comme étant une enzyme clef pour la réplication du virus. En effet, il a été montré que la protéase est responsable de la maturation des précurseurs GAG et POL et que cette maturation est essentielle pour obtenir des virions potentiellement infectieux. La protéase HIV se montrant donc indispensable dans la réplication du virus, elle constitue une excellente cible de thérapie. Les inhibiteurs du site catalytique ont déjà démontré leurs efficacités dès la fin des années 1990 et le problème des résistances observées due aux mutations de l enzyme semble maintenant facilement résolvable par le design d inhibiteurs plus stable par modélisation moléculaire. En effet, les techniques de modélisation moléculaire permettent de prévoir comment vont se positionner les inhibiteurs dans la poche catalytique et ainsi de les modifiée de telle façon à ce qu ils soient plus spécifiques et stabilisés (liaisons faibles) par le maximum d acides aminés pour lesquels aucune mutation n a été observée. Bien que encore au stade expérimental, l inhibition de la dimérisation de la protéase semble une stratégie très prometteuse une fois le voile levé sur le mécanisme du folding et de la dimérisation. En effet la formation de complexe inhibiteur-monomère protéase extrêmement stable se révèle très efficace in vitro, il reste maintenant à démontrer son efficacité in vivo. Il semble donc que la protéase virale soit toujours une cible thérapeutique de choix. L intérêt qu elle a succité dès le début fait qu elle est aujourd hui une des enzymes les mieux étudiées dans le monde ce qui permet la mise en œuvre de systèmes d inhibitions hautement efficaces et très spécifiques. 12

18 Références 1. Gallo R, et al. HIV/HTLV gene nomenclature. Nature 1988 ; 333 : Gottlinger et al. Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86: Parkin NT et al. Human immunodeficiency virus type 1 gag-pol frameshifting is dependent on mrna secondary structure:demonstration by expression in vivo. J Virol 1992;66: Jacks T et al. Characterisation of ribosomalframeshifting in HIV-1 Gag-Pol expression. Nature 1988;331: Dunn B et al. Retroviral protéases. Genome biology 2002; 3: Katoh I et al. Inhibition of retroviral protease activity by an aspartyl proteinase inhibitor. Nature 1986;329: Wlodawer A et al. Conserved folding in retroviral protease:crystal structure of a synthetic HIV-1 protease. Science 1989;245: Louis J et al. Revisiting monomeric HIV-1 protease. J Biol Chem 2003;278: Todd M J et al. the structural stability of the HIV-1 protease. J Mol Bio 1998;283: Ishima R et al. Flap opening and dimer-interface flexibility in the free and inhibitorbound HIV protease, and their implication for function. Structure Fold Des 1999; 7: Kaplan A et al. Partial inhibition of the human immunodeficiency virus type1 protease results in aberrant virus assembly and the formation of noninfectiuos particles. J virol 1993;67: Jaskolski M et al. Structure at 2 A resolution of chemically synthesized HIV-1 protease complex with a hydroxyethylene-based inhibitor. Biochemistry 1991;30: Rosé J R et al. Definig the level of human immunodeficiency virus type 1 protease activity required for HIV particle maturation and infectivity. J Virol 1995;69: Loeb D D et al. Mutational analysis of HIV-1 protease suggests functional homology with aspartic proteinase. J Virol 1989;63: Rosé J R et al. Regulation of the autoproteolysis of HIV-1 and HIV-2 with engeneered amino acid substitution. J Biol Chem 1993;268: Page K et al. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J Virol 1990; 64: Chesebro B et al. Development of a sensitive quantitative focal assay for human immunodeficiency virus infectivity. J Virol 1988;62: Havlir D V et al. Atazanavir: new options for treatment of HIV infection. Review of anti infective agents 2004; 38: Wlodawer A et al. Structure-based inhibitors of HIV-1 protease. Annu Rev Biochem 1993; 62 : Shafer, R.W et al. Identification of biased amino acid substitution patterns in human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with protease inhibitors. J. Virol 1999; 73:

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