Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments

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1 Licence pro QSR2A TOXICOLOGIE Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction 1. Les mycotoxines 2. Les substances antimicrobiennes 3. Les pesticides 4. Les composés N-nitrosés 5. Les métaux lourds

2 Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction L insécurité alimentaire : risques microbiologique / chimique Nature et origine des contaminants chimiques : - Synthétisés par l organisme vivant consommé - Synthétisés par des micro-organismes contaminants - Apportés volontairement : - Contaminants environnementaux

3 Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction : paramètres des études toxicologiques

4 Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction : établissement des normes La Commission du Codex Alimentarius, créée en 1963 par la FAO et l'oms, met au point des normes alimentaires, des lignes directrices et des codes d usages internationaux et harmonisés visant à protéger la santé des consommateurs et à assurer des pratiques loyales dans le commerce des aliments. Elle encourage aussi la coordination de tous les travaux relatifs aux normes alimentaires entrepris par des organisations gouvernementales et non gouvernementales.

5 Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction : les LMR Les limites maximales de résidus (LMR) sont les niveaux supérieurs de concentration de résidus de pesticides autorisés légalement dans ou sur les denrées alimentaires et les aliments pour animaux. Elles sont fondées sur les bonnes pratiques agricoles et visent à garantir le niveau d exposition le plus faible possible pour les consommateurs. Le règlement (CE) n 396/2005 établit les LMR des pesticides autorisés dans les produits d origine végétale ou animale destinés à l alimentation humaine ou animale. Les limites maximales de résidus, qui représentent des seuils toxicologiques critiques, sont établis à la suite d une évaluation complète. L unité PRAPeR de l EFSA est chargée d évaluer les risques associés aux LMR, conformément à la législation. En 2007, l unité PRAPeR a aidé la Commission européenne à établir des LMR européennes temporaires, marquant un premier pas vers l harmonisation des LMR nationales. Les États membres sont tenus d effectuer des contrôles officiels sur les résidus de pesticides afin de respecter la réglementation relative aux limites maximales de résidus.

6 Méthodes de détection des contaminants chimiques dans les aliments Introduction : exemples de méthodes d analyse

7 1.1. Généralités 1. Les mycotoxines Les mycotoxines sont des métabolites secondaires sécrétés par des moisissures appartenant principalement aux genres Elles sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après récolte.

8 1.1. Généralités 1. Les mycotoxines Le risque mycotoxicologique a existé dès la mise en place de productions agricoles organisées. L ergotisme est cité dans l Ancien Testament de la Bible. Certains tombeaux égyptiens ont également été suspectés de contenir de l ochratoxine A, responsable de la mort mystérieuse d archéologues. C est seulement en 1960 que les premières mycotoxicoses ont pu être mises en évidence en Grande-Bretagne où plus de dindes sont mortes de nécroses importantes du foie provoquées par une famille de molécules appelées aflatoxines. Depuis, de nombreuses mycotoxines ont été découvertes, le dernier grand groupe étant, en 1988, les fumonisines. En France, les pâturages peuvent être colonisés par les champignons du genre Claviceps responsable de l ergotisme, du genre Pythomyces produisant de la sporidesmine à l'origine de l eczéma facial, du genre Neotyphodium entraînant la formation de gangrène sèche et/ou de troubles nerveux, ou du genre Rhizoctonia capable de synthétiser de la slaframine à l'origine de sialorrhée chez les ruminants.

9 1.1. Généralités 1. Les mycotoxines Les mycotoxines sont élaborées par des champignons lors de quatre processus différents: En raison de la diversité de leurs effets toxiques et de leurs propriétés synergiques, les mycotoxines présentent un risque pour le consommateur d aliments contaminés. Le métabolisme des mycotoxines est complexe et comprend plusieurs voies de bioactivation et de détoxication régies par des mécanismes de biotransformation résultant de l action d enzymes de l hôte et de la flore microbienne présente dans le tube digestif. Une partie des toxines ou de leurs métabolites peut se fixer dans les tissus biologiques ; la majorité est éliminée par voie

10 1.1. Généralités 1. Les mycotoxines Des moisissures peuvent se développer sur les plantes: et produire des toxines qui pourront avoir des conséquences néfastes sur le consommateur de produits végétaux contaminés. A ce risque s'ajoute celui d'une présence éventuelle de résidus toxiques dans les produits animaux destinés à la consommation humaine, lait ou viande, lorsque les animaux reçoivent des aliments contaminés. La réduction des risques passe par:

11 1.2. Biosynthèse des mycotoxines Le métabolisme secondaire diffère du primaire par la nature aléatoire de son activation et par la diversité des composés formés et la spécificité des souches impliquées. Il n'est pas lié à la croissance cellulaire mais répond généralement à des signaux issus de l'environnement du champignon. Métabolisme primaire: Métabolisme secondaire: La contamination fongique des plantes et la synthèse de toxines dépendent de conditions environnementales:

12 1.2. Biosynthèse des mycotoxines Les fourrages et les céréales sont naturellement en contact avec des spores fongiques avant, pendant et après la récolte, durant le transport et le stockage. Les rongeurs, oiseaux, insectes interviennent dans le processus de contamination en provoquant des lésions physiques dans les tissus végétaux qui favorisent la pénétration des spores. La croissance fongique est régie par de nombreux paramètres physicochimiques: La principale moisissure rencontrée au champ appartient au genre Fusarium. Bien qu'elle soit surtout présente dans les céréales, on peut la rencontrer également dans les fourrages sur pied ou récoltés. Selon les espèces et l environnement, Fusarium spp peut produire:

13 1.3. Structure et classification des mycotoxines Six groupes de mycotoxines sont produits par Aspergillus, Penicillium et Fusarium. La structure chimique des mycotoxines est très diversifiée, ce qui explique leurs effets biologiques différents:

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15 1.4. Bioconversion des mycotoxines En fonction de l efficacité de l absorption gastro-intestinale et du métabolisme hépatique, les mycotoxines et leurs métabolites sont préférentiellement excrétés par les voies urinaire(mycotoxines hautement absorbées et métabolisées comme l AFB1) et fécale (toxines peu absorbées ou éliminées par voie biliaire). Les ruminants sont globalement plus résistants à la plupart des mycotoxines grâce au rôle détoxifiant de la population microbienne du rumen. Les principales toxines ingérées par les ruminants sont donc modifiées dans le tube digestif des ruminants avant d'être excrétées par la voie biliaire. Le ruminant est donc naturellement protégé, mais la présence de résidus toxiques dans les produits animaux que sont le lait et la viande, constitue un risque pour le consommateur. L épithélium intestinal, le foie et les reins sont le siège de biotransformations d un grand nombre de composés. Il s'agit de réactions de réduction, d oxydation, d hydrolyse et de conjugaison. Ces réactions diminuent la toxicité et augmentent la solubilité dans l eau des mycotoxines, ce qui facilite leur excrétion dans l'urine(et dans le lait).

16 Métabolisme de l aflatoxine B1 dans le foie (adapté de Swick 1984 et Neal 1998).

17 1.5. Effets des mycotoxines 1. Les mycotoxines Chez l animal, l effet cancérogène de cinq mycotoxines, aflatoxines (AFB1 et AFM1), ochratoxine A (OTA), moniliformine, sterigmatocystine a été prouvé. Chez l Homme, les aflatoxines et l OTA ont été classées comme cancérogènes avérées par le Centre International de Recherche contre le Cancer. La fumonisine B1 (FB1) est actuellement classée dans la catégorie des cancérogènes probables et pourrait entrer prochainement dans la classe des cancérogènes. Des données toxicologiques récentes sur la patuline classent cette dernière parmi les toxines à risque.

18 1.5. Effets des mycotoxines 1. Les mycotoxines Les aliments sont fréquemment contaminés par plusieurs moisissures capables de produire chacune plusieurs toxines. Or, des effets de synergie peuvent exister entre toxines. Ainsi, l acide fusarique accroît la toxicité des fumonisines(d Mello et Mc Donald 1997), et celle du DAS et du DON (Smith et al 1997). L'association de la ZEN et de l acide fusarique augmente de 2 à 5 fois leur passage mutuel dans le lait chez le rat (Porter et al 1998). Une interaction entre la FB1 et le DON induit un accroissement de la quantité de protéines dans le sang, alors que celle impliquant la FB1 et la T-2 conduit à une augmentation du taux de calcium (Kubena et al 1997a) ou du taux d hémoglobine et de l hématocrite(kubena et al 1995).

19 1.5. Effets des mycotoxines Une contamination aiguë par les aflatoxines provoque des signes importants de lésions du foie (Pier 1992). L aflatoxicose entraîne une accumulation d acides gras dans le foie, les reins et le coeur, et peut être à l'origine d'encéphalopathies et d'oedèmes (Pfhol-Leszkowicz 2000). Les aflatoxines agissent comme des intercalants ADN en créantdes liaisonsavec les basesguanines cequi entraîne la mortde la cellule ou sa transformation en tumeur maligne(riley 1998). Des ochratoxicoses ont été décelées chez l Homme et chez le porc. Elles ont rarement été observées chez les ruminants du fait de la capacité des microorganismes du rumen à hydrolyser l OTA. Les toxicoses aiguës se caractérisent selon Chu (1974) par des dommages rénaux, une anorexie accompagnée d'une perte de poids, des vomissements, une température rectale élevée, l apparition de conjonctivites, une déshydratation, un affaiblissement général et la mort de l'animal deux semaines après l administration de la toxine (Marquardt et Frohlich 1992). L OTA peut inhiber le métabolisme du glucose et de l insuline, ce qui entraîne l accumulation de glycogène dans le foie. L'OTA a des propriétés immunotoxiques et carcinogènes en diminuant le nombre de cellules 'Natural Killer' responsables de la destruction des cellules tumorales, ce qui contribue à augmenter sa capacité à induire des carcinomes rénaux et hépatiques(lusteretal1987).elleaégalementuneffetinhibiteursurleslymphocytesbett. Les effets de la ZEN sont dominés par des troubles de la reproduction et des modifications physiques des organes génitaux identiques à ceux de l oestradiol : oedèmes et hypertrophie des organes génitaux, diminution du taux de survie de l embryon chez les femelles en gestation, diminution des quantités de LH et de progestérone produites affectant la morphologie des tissus utérins, diminution de la production de lait, féminisation des jeunes mâles par diminution de la production de testostérone et infertilité. Les fumonisines provoquent des lésions profondes du foie, du tractus gastro-intestinal, du système nerveux et des poumons(riley 1998). La patuline est potentiellement carcinogène et mutagène. La patuline altère la perméabilité ionique et/ou la communication intracellulaire, engendrant un stress oxydatif et la mort cellulaire(riley 1998). Les trichothécènes provoquent une perte de poids, des vomissements, des dermatoses sévères et des hémorragies pouvant aller jusqu'à la mort de l'animal. Tout comme les aflatoxines, ils possèdent des propriétés immunosuppressives intervenant à la fois sur le système immunitaire des cellules et sur le nombre de macrophages, de lymphocytes et d'érythrocytes(riley 1998). La T-2 et la DON inhibent la synthèse protéique et entraînent la mort des cellules de différents organes.

20 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Les mycotoxines sont, en général, présentes à l état de traces dans les aliments(c est-à-dire en quantité inférieure au ppb, soit inférieure au µg/kg). Il existe toute une panoplie de méthodes fondées essentiellement sur le principe de la séparation chromatographique des molécules puis de leur détection par spectrophotométrie ou par fluorimétrie. Les méthodes physicochimiques comme la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie gazeuse (CPG) ou la chromatographie liquide haute performance(clhp) permettent la quantification des mycotoxines. Les techniques immuno-chimiques de type ELISA permettent soit une détection de type présence ou absence (résultat qualitatif), soit une détection semi-quantitative ou quantitative de la mycotoxine. Les techniques immunochimiques sont souvent qualifiées de rapides car de nombreux échantillonspeuventêtreanalysésàlafoisen3à4heures. Combinées à une étape préalable de purification par chromatographie d immunoaffinité, ces techniques ont pu être validées au niveau international. Ces principes d analyse sont actuellement retenues dans la plupart des méthodes officielles et font l objet de normes françaises (normes AFNOR), européennes(normes EN) ou internationales(normes ISO).

21 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Les aliments représentent une matrice complexe : des étapes de préparation des échantillons sont nécessaires: Souvent longues et manuelles, ces étapes doivent être optimisées pour chaque type de matrice. L analyse des mycotoxines étant une analyse de traces, on procède à une étape de purification puis de concentration de l extrait, par exemple par passage sur cartouches de silice greffée ou non (cas des aflatoxines, de la patuline), ou sur résines échangeuses d ions(cas des fumonisines).

22 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments

23 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Le développement de l immunopurification sur colonnes d immunoaffinité a considérablement amélioré la spécificité et les seuils de détection et de quantification des méthodes d analyse des mycotoxines. Le principe de cette technique d immunopurification repose sur l utilisation de l anticorps comme réactif d affinité. L anticorps antimycotoxine est tout d abord immobilisé sur un support qui a souvent l apparence d un gel remplissant une microcolonne, conditionné à l aide d un tampon.

24 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Colonnes d immunoaffinité:

25 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments La CCM: première technique employée Inconvénients: - - Avantages:

26 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Principe de la chromatographie: La séparation est fondée sur la distribution des solutés entre les deux phases non miscibles (stationnaire/mobile). Alors que la phase mobile tend à entraîner les espèces à séparer dans son mouvement, la phase stationnaire tend à les retarder. Il en résulte que les analytes ont, pour la plupart, des vitesses de déplacement différentes et inférieures à celle dela phasemobile,d où la notionde rétention et la possibilité de séparation.

27 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Principe de la chromatographie sur couche mince On dépose sur la phase fixe une petite quantité du mélange à séparer et on met cette phaseau contactdelaphase mobile. Laphase mobile migredebasenhaut,par capillarité, le long de la phase fixe en entraînant les constituants du mélange. C est le phénomène d élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser. Chaque constituant migre d une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l on appelle rapport frontal ou rétention frontale(rf): Rf= Chaque tache correspond à un constituant et on l identifie par comparaison du Rf avec un témoin (une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoires identiques).

28 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Chromatographie sur couche mince La phase mobile se déplace par capillarité (chromatographie planaire). L analyste exploite les distances parcourues par chaque espèce à temps de développement donné : quand le «front» de solvant a parcouru une distance fixée, on repère la position de chaque soluté, par révélation par un système adéquat et on détermine le rapport des vitesses de déplacement que l on identifie comme étant identique à celui des distances parcourues ; on étudie la distribution isochrone (c est-à-dire à temps de développement constant).

29 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments ExempledeCCM: Corn samples are ground and extracted. The extracts are then spotted onto a TLC plate. One TLC plate can be spotted with extracts from several corn samples. The TLC plate is developed, dipped into an aluminum chloride solution and heated. The mycotoxins are then visualized by viewing the plate under long-wave ultraviolet irradiation (black light). Mycotoxin standards are also available making it possible to visually estimate the quantity of the mycotoxins present. The corn sample illustrated below contains aflatoxin at approximately three times the standard.

30 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments La phase stationnaire peut être disposée dans une colonne et la phase mobile percole celle-ci à débit (ou pression) constant : c est la chromatographie sur colonne. L analyste exploite les différences de vitesses de déplacement des différentes espèces en déterminant le temps mis par chacune pour parcourir une longueur égale à celle de la colonne (les solutés sont injectés en mélange à une extrémité de la colonne et détectés à l autre) : on étudie la distribution isoplane des espèces(c est-à-dire à distance parcourue fixée). Dans la chromatographie en phase liquide (CPL) : la phase mobile est constituée d un solvant pur ou le plus souvent d un mélange plus ou moins complexe de solvants de grande pureté ; elle est introduite sur la colonne à débit constant par un système de pompage. La technique CLHP est la plus utilisée depuis une vingtaine d années. C est la méthode de choix pour l analyse des mycotoxines. Les méthodes par CLHP sont quantitatives et grâce à leur couplage à la détection par fluorescence, elles peuvent atteindre des limites de détection aussi basses que la dizaine de ng/kg. La LC-MS est de plus en plus utilisée pour effectuer des confirmations et des identifications de mycotoxines par identification des ions-fils et comparaison à des banques de données spectrales. Cette technique est très coûteuse par l achat de l appareil, sa maintenance et la nécessité d un personnel hautement spécialisé.

31 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CLHP

32 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CLHP

33 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CLHP: HPLC Analysis of Fusarium Mycotoxins

34 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CLHP : Chromatogram of a standard mixture showing the separation of 10 mycotoxins : aflatoxins B1, B2, G1 and G2, citrinin, cyclopiazonic acid, mycophenolic acid, ochratoxin A, penicillic acid, penitrem A

35 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CPG La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est réservée à l étude des mycotoxines qui peuvent être volatilisées. Elle convient plutôt à la classe des trichothécènes mais elles sont difficiles à calibrer et à valider. La phase mobile est un gaz, dit gaz vecteur, et les solutés sont introduits sur la colonne directement s il s agit d un échantillon gazeux ou après volatilisation dans la chambre d injection chauffée s il s agit d un échantillon liquide (éventuellement après dilution ou dissolution dans un solvant adéquat).

36 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments CPG GC MS/MS chromatogram of a naturally contaminated wheat semolina at 55.4μgkg 1 of DON showed in full scan mode (A), the mass spectrum of DON (B) and the characteristic transitions viewed in MRM mode (C)

37 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Méthodes immunochimiques utilisation d un anticorps spécifique dirigé contre la mycotoxine recherchée. fixé sur un support inerte (tubes ou puits de plaque de micro-titration en polystyrène, billes de verre, membrane) capture des molécules de mycotoxine éventuellement présentes dans le milieu réactionnel réaction de type antigène-anticorps ajout d un système enzymatique, en général couplé à un second anticorps(conjugué) transformation d un substrat chromogène en produit coloré densité de la coloration mesurée par photométrie proportionnelle ou inversement proportionnelle (suivant la configuration du test) à la quantité de mycotoxines contenues dans l échantillon.

38 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Méthodes immunochimiques Les trousses de dosage permettent une détermination quantitative de la teneur en mycotoxine par test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). En général, elles se composent d une plaque de microtitration en polystyrène de 96 puits au fond desquels sont fixés de façon covalente les anticorps. Ces trousses de dosage permettent l établissement d une gamme étalon. Malgré la nécessité d effectuer une extraction et une purification de la mycotoxine à partir des échantillons, ces tests se réalisent en 3-4 h avec une limite de dosage en général inférieure au ppb. Il existe de telles trousses de dosage pour l aflatoxine B1, l ochratoxine A, la zéaralénone, la toxine T-2, la déoxynivalénol et les fumonisines. Les techniques immunochimiques de dosage ou de dépistage sont en général commercialisées sous forme de kits ou trousses de dosage et s utilisent selon des protocoles d analyse d exécution simple sur un grand nombre d échantillons à la fois. Cependant, dans le cadre de l analyse des aliments, il convient de rester prudent devant l apparente facilité d utilisation de ces techniques car l interprétation des résultats n en est pas moins délicate. Les risques de réactions croisées sont inhérents à l utilisation d anticorps comme outil de détection : la reconnaissance d autres molécules de structure chimique proche, en particulier des métabolites de la molécule à doser, éventuellement présents dans le milieu réactionnel, provoque l apparition de faux positifs qui entraînent une surestimation des résultats. En outre, l extraction des mycotoxines nécessite des solvants(méthanol, acétonitrile, chloroforme...) et des traces de solvant dans l extrait analysé par test ELISA peuvent aussi être une cause de production de faux positifs.

39 1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments Décontamination des effluents Après analyse au laboratoire, il est nécessaire de décontaminer les extraits d échantillons contaminés et les restes de solutions étalons avant élimination, ainsi que la verrerie avant réutilisation. Pour cela, différentes méthodes de décontamination ou de dégradation des mycotoxines (en particulier aflatoxines) dans les rejets de laboratoires ont été étudiées par le Centre international de recherche sur le cancer. L une de ces méthodes utilise l hypochlorite de sodium en présence d acétone. Son champ d application comprend les solutions stocks d aflatoxines ou les solutions diluées en solvant organique ou en milieu aqueux, les échantillons biologiques, la verrerie, les piluliers, les plaques de CCM, les vêtements de laboratoire de protection. Il existe cependant une suspicion de toxicité des produits de dégradation qui a conduit à rechercher d autres procédés de décontamination. Ainsi, une méthode au permanganate de potassium en conditions alcalines qui convient à tout un ensemble de mycotoxines comme la patuline, l ochratoxine, la citrinine, la stérigmatocystine mais aussipourlesaflatoxinesbetgneproduitpasdedérivésmutagènes.ce procédédécontamineà plus de 99,9 % les solutions aqueuses ou organiques ou bien la forme solide des mycotoxines citées. Ce procédé a été validé pour la décontamination d une solution de patuline par une analyse collaborative. La dégradation des aflatoxines par le permanganate de potassium en milieu acide a également été mise au point mais son utilisation est maintenant déconseillée car ce réactif produit en milieu acidedesionsmn 2+ potentiellementmutagéniques.

40 1.7. Réglementation 1. Les mycotoxines