Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE. Jennifer JOLIVOT

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1 Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE «Les protéines impliquées dans la morphogenèse des chloroplastes.» Jennifer JOLIVOT Laboratoire d accueil : Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Végétale (LPCV) Directeur du laboratoire : Norbert ROLLAND Responsable du stage : Florence COURTOIS Licence Sciences et Technologie 2ème année Parcours Chimie Biologie Année Universitaire

2 SOMMAIRE Remerciements... 2 Présentation du LPCV... 3 Présentation du sujet de recherche... 4 I) Principes et protocoles des méthodes utilisées 1. Stérilisation des graines Semer des graines (en conditions stériles) Extraction protéique Western Blot Dosage protéique par la méthode BSA Extraction d'adn Dosage de l'adn PCR (Réaction de polymérisation en chaîne) Electrophorèse sur gel d'agarose : génotypage II) Résultats des manipulations 1. Analyse de phénotypes à la loupe Coloration au Bleu de Coomassie Coloration au Rouge Ponceau Dosage protéique par BSA Western Blot (WB) : chimioluminescence Profil d'électrophorèse génotypage de plantes grâce à une PCR Conclusion Annexes... 1

3 REMERCIEMENTS Je tiens tout d'abord à remercier Florence COURTOIS, mon maître de stage et professeur, de m'avoir permis de découvrir pendant un mois le monde de la Recherche. Je la remercie pour le temps qu'elle m'a consacré, la confiance qu'elle m'a accordée et pour ses conseils toujours très instructifs. Elle m'a permis de développer mon autonomie au sein d'un laboratoire, de découvrir la Recherche de l'intérieur et de répondre à toutes les questions que je me posais. Elle a su me mettre à l'aise avec l'équipe de travail, le laboratoire ainsi que le matériel scientifique ce qui a favorisé le bon déroulement de mon stage. Merci encore de m'avoir fait découvrir ce monde si intéressant qu'est la Recherche et plus particulièrement, celui de la physiologie végétale. Je remercie également Livia MERENDINO et Fabien CHEVALIER pour leurs explications, leur écoute et leur gentillesse tout au long du stage. Je remercie et salue toute l'équipe 7 du LPCV qui m'a accueilli bras ouverts et a contribué à rendre ce stage très agréable. Je remercie tout les chercheurs et techniciens du laboratoire que j'ai pu rencontré et avec qui j'ai discuté, d'avoir partagé un peu de leur expérience et profession avec moi. Enfin, je tiens à remercier l'université Joseph Fourier de Grenoble de m'avoir permis de réaliser ce stage dans le cadre des stages d'excellence. Cette opportunité a enrichit mes connaissances et ma pratique scientifique tout en clarifiant mes projets d'étude. 2

4 PRESENTATION DU LPCV J'ai effectué mon stage dans le Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Végétale (LPCV) qui se situe sur le site du CEA (Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives) localisé sur la Presqu'île de Grenoble et se présentant sous la forme d'un campus. Plan du CEA Le CEA est un acteur majeur de la recherche, du développement et de l'innovation. Ses grands domaines d'études sont : les énergies bas carbone (nucléaire et renouvelables), les technologies pour l information et les technologies pour la santé, les Très grandes infrastructures de recherche (TGIR), la défense et la sécurité globale. Le Laboratoire Physiologie Cellulaire et Végétale (LPCV) étudie la dynamique du fonctionnement de la cellule végétale. Ces recherches, menées aussi bien au niveau moléculaire que cellulaire, sont ensuite replacées dans le contexte de la plante entière au cours de son développement et soumise aux conditions fluctuantes. Elles ont pour but une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires, par exemple des voies métaboliques ou des processus de division et morphogenèse cellulaire. 3

5 PRESENTATION DU SUJET DE RECHERCHE Certaines protéines induisent l'activité photosynthétique; les protéines PHANG qui sont des ARN polymérases. On distingue deux types d'arn polymérases dans le plaste; la NEP (Nuclear Encoded Proteins) et la PEP (Plastidial Encoded Proteins). Elles sont issues de deux génomes distincts, la NEP est transcrite à partir du génome nucléaire et la PEP du génome plastidiale. La PEP est un complexe trans-membranaire qui reçoit des signaux du noyau et intervient dans la régulation de la transcription des chloroplastes. Ce complexe possède l'activité ARN polymérase majeure dans les chloroplastes matures. La PEP représente la cible prédominante de la régulation environnementale comme pour le contrôle de la transcription de chloroplastes induite par la lumière. Par Western Blot, des chercheurs ont découvert que le complexe PEP, est lié à dix sousunité protéiques non séquencées ; les PAP (PEP Associated Proteins). Pour chaque mutant déficient en une certaine protéine PAP, le phénotype de la plante est albinos, phénotype létal. Ces manipulations témoignent de l'importance de chacune de ces protéines pour la production de chloroplastes et donc pour la photosynthèse. Chaque PAP est reliée aux autres dans la structure et/ou dans le contexte de développement. Dans le laboratoire, nous utilisons la plante Arabidopsis Thaliana pour l'ensemble des recherches et la formation de mutants. Sa petite taille, son cycle de vie rapide de six semaines (de graines à graines), sa résistance et sa capacité à s'autoféconder sont des atouts pour son utilisation en recherche. Mon sujet d'étude est la protéine PAP 6 (ou FLN1=Fructokinase-like 1), Arabidopsis Thaliana codée par les gènes du noyau. PAP 6 est une protéine soluble de 52kDa. Elle est nécessaire pour la germination à la lumière après l'émergence des cotylédons. Elle possède un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes plastidiales et dans le développement des chloroplastes. Après comparaison de la structure de PAP 6 avec l'ensemble du génome chez Arabidopsis Thaliana, on a découvert qu'elle semble avoir un activité de fructokinase et plus particulièrement qu'elle s'autophosphorile. PAP 6 intéragit avec la thioredoxine z et contient deux cystéines nécessaires à cette intéraction. Reconnaissance par le chloroplaste. Partie clivée pour que PAP 6 entre dans le chloroplaste. Partie visqueuse, difficile à utiliser, encore inconnue. Partie active : catalytique. Rôle dans la phosphorilation. 4

6 I) PRINCIPES ET PROTOCOLES DES METHODES UTILISEES 1. Stérilisation des graines d'arabidopsis Thaliana Pour faire pousser des graines in vitro, il est nécessaire de stériliser celles-ci au préalable. En effet, le milieu gélosé (de type ATG) utilisé est sensible aux infections extérieures qui pourraient contaminer le milieu, réduire la croissance des plantules et fausser les résultats attendus. On procède donc à un protocole de stérilisation des graines en surface sous la hotte dans des conditions stériles : Mettre un cachet de 1,5g javel dans 40mL H2O stérile laisser dissoudre Prendre 10mL de cette solution + 40mL d'etoh 100% Pour environ 500μL de graines, prendre 10mL de ce mélange et l'ajouter aux graines dans un tube Falcon agiter lentement 4 à 5min Enlever la solution Rincer avec 50mL d'etoh 1 à 3 fois Laisser sécher sous la hotte 2. Semer des graines (en conditions stériles) Pour l'extraction de protéines ou d'arn, on met en culture sur des boîtes de Pétri des graines (mutantes ou non) dans différentes conditions. Il a été prouvé que les mutantes FLN1, par leurs propriétés physiologiques assimilent difficilement le carbone présent dans le CO2. Une autre source de carbone est nécessaire; nous utiliserons du sucre. Faire chauffer l'atg jusqu'à avoir un mélange liquide homogène Couler l'atg (contenant du sucre ou non) dans des boîtes de Pétri Attendre que l'atg se solidifie Semer les graines Fermer les boîtes (conditions stériles respectées) Mettre les boîtes dans un incubateur dans des conditions fixées J'ai réalisé 3 types de boîtes : - ATG + Sucre+ graines WT - ATG + graines WT - ATG + Sucre + graines FLN1 3. Extraction protéique Les mutants FLN1 sont caractérisés par l'absence de la protéine PAP6 et par un phénotype albinos. 5

7 Nous allons réaliser un Western Blot des protéines présentes chez FLN1 ainsi que celles chez le WT pour prouver que c'est l'absence de PAP6 qui induit la perte de l'activité photosynthétique. Au préalable, il nous faut extraire les protéines présentes dans les plantules. Les végétaux de différents phénotypes sont placés dans des tubes Eppendorf à l'aide d'une pince Broyage des plantules d'arabidopsis Thaliana dans du tampon d'extraction Tampon d'extraction : SDS + DTT + Glycérol Le SDS dénature les protéines en rompant les liaisons faibles. Le DDT est un agent réducteur qui va réduire les ponts disulfures. Le glycérol a pour rôle de donner du poids aux protéines pour qu'elles tombent au fond du tube. On adapte le volume de tampon selon la quantité de végétaux récupérés dans les boîtes de Pétri. 1er broyage : Tableau 1 Volumes de tampon pour les différents extraits placés dans des tubes Eppendorf. (Tubes) Phénotype (1) Mutant Thrx z (2) FLN1 (3) FLN1? (4) WT 4 Jours (5) WT 6 Jours Volume de Tampon 50μL 40μL 50μL 50μL 100μL Broyage des végétaux dans les tubes Eppendorf avec des pistons en écrasant les feuilles contre la paroi du tube afin de faire sortir le maximum de protéines. L'objectif étant d'avoir le meilleur rendement possible. Centrifugation à vitesse maximale des tubes Eppendorf : rpm pendant 5 minutes à 4 C. Récupération du surnageant contenant les protéines à l'aide des propipettes. 2er broyage : Ajout de tampon (cf les volumes du tableau 1), broyage et centrifugation les tubes (4) et (5). Les tubes contenant les extraits protéiques sont centrifugés une nouvelle fois et conservés au congélateur (T= -20 C). 4. Western Blot (WB) Réalisation d'un gel d'acrylamide Les gels sont des milieux poreux dans lesquels la taille des pores est voisine de celles des protéines. Ils agissent comme des tamis moléculaires et la migration dépend de la densité de charge mais aussi de la taille des molécules. Ainsi les gels de polyacrylamide permettent de séparer deux protéines de charge égale mais de taille différente. Il est possible de faire varier la porosité des gels pour 6

8 répondre à des problèmes spécifiques (voir Annexe 1). Nous utiliserons le protocole pour un gel 12,5%. Le gel se forme par une co-polymérisation d'acrylamide et de bisacrylamide. La réaction de polymérisation est une addition de groupements vinyl initiée par un système générant des radicaux libres : le TEMED et le persulfate d'ammonium (APS). Le TEMED accélère la formation de radicaux libres à partir du persulfate, qui lui catalyse la polymérisation. Préparation des différents tampons dans des tubes Falcon Tampon de séparation :4mL Tris 1,5 M (PH=8,8) + 6,7mL d'acrylamide (30%) + 5,3mL H2O + 0,016mL TEMED Tampon de concentration : 1,25mL de Tp Stackiuj + 0,75mL Acrylamide (30%) + 3mL H2O + 0,01mL TEMED Le tampon de séparation, qui a un PH=8,8>PHi de la majorité des protéines, donne une charge négative aux protéines et les dénature. Le tampon de concentration tasse les protéines et nous permet d'avoir des bandes sur notre gel. Préparation de la culotte qui a pour but d'éviter les fuites du gel. Culotte : 3mL de Tp de séparation + 40μL APS (10%) + 4μL TEMED Tp de séparation + 0,16mL APS (10%) Ajout Tp de séparation entre les deux plaques à l'aide d'une P1000 Ajout d'un mélange H2O/EtOH (50/50) Ce mélange permet de linéariser le gel et d'enlever les bulles. On enlève l'excès d'eau. Lorsque le gel est formé : Mise en place du peigne qui forme les futurs puits qui contiendront les protéines à séparer. Tp de concentration + 0,03mL APS (10%) Ajout du Tp de concentration par un des puits à l'aide d'une P1000 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide Les protéines sont des molécules chargées lorsqu'elles sont dans un milieu dont le PH est différent de leur point isoélectrique (Phi). Sous l'effet d'un champs électrique, elles vont du pôle négatif (cathode) vers le pôle positif (anode). Leur vitesse de migration dépend essentiellement de leur poids moléculaire. Ainsi, l'électrophorèse nous permet de séparer un extrait protéique en fonction de la taille des protéines dans des conditions dénaturantes avec des agents réducteurs ou non. Préparation de 200mL de Tampon Tampon de migration SDS PAGE: 20mL de Laemmli 10x_SDS + 1mL SDS (20%) + H2O 7

9 Le SDS-PAGE est un détergent qui rompt les liaisons non covalentes au sein des protéines et leur donne une charge négative ce qui nous permet de les séparer uniquement en fonction de leur taille. Chauffage des protéines dans un bain (T=95 C) pendant 5minutes afin de les dénaturer. Dilution des extraits afin de déposer un poids de 30-50μg de protéines dans les puits. Dépôt des extraits dilués ainsi que les marqueurs de taille dans chaque puits Ajout du tampon de migration dans l'enceinte Migration (120V) Electrotransfert Les protéines qui sont chargées négativement sont attirées par le pôle positif. Sous l'effet d'un champs électrique perpendiculaire, on transfert celles-ci du gel de polyacrylamide vers une membrane de nitrocellulose. Ce transfert permet de mettre en surface les protéines d'intérêt qui seront accessibles aux anti-corps. Préparation de 1L de Tampon Tampon de transfert WB : 100mL Laemmli 10x_SDS + 4mL SDS(20%) + 200mL EtOH + H2O Placer gel dans tampon de transfert. Réalisation du sandwich (cf Annexe 2). Chaque composant est au préalable placé dans du tampon de transfert. Mise en place dans l'enceinte : barreau magnétique et bac à glace (exergonique). Ajout du tampon de transfert. Transfert sous agitation pendant 75min (100V). Coloration au Bleu de Coomassie Ce colorant est un témoin de charge qui permet de visualiser les protéines sur le gel témoin d'électrophorèse (les différentes dilutions protéiques et le marqueur de taille). Lavage avec de l'éthanol après une incubation de 30minutes sous agitation. Coloration au Ponceau Après l'électrotransfert, on réalise un contrôle pour vérifier que nos protéines sont sur la membrane. Incubation de la membrane pendant 3minutes dans du Ponceau Lavage à l'eau Saturation des sites non spécifiques Cette étape permet de fixer les protéines sur la membrane et de la saturer. Préparation des solutions de lavage 8

10 500mL T-TBS : 50mL de TBS 10x + 5mL Tween 20 (100%) + H2O T-TBS lait : 400mL T-TBS + 5% lait écrémé (m=20g) Lavage de 5 min au T-TBS lait pour décolorer la membrane Trois lavages de 10 min au T-TBS lait pour saturer la membrane Immunorévélation Pour détecter la présence d'une protéine d'intérêt ou de vérifier l'efficacité d'un anti-corps, on incube la membrane de nitrocellulose en présence de l'anti-corps dirigé contre la protéine appelé anti-corps primaire (ACI). Dilution de AC1 dans du T-TBS lait Incubation de la membrane avec l'anticorps spécifique Quatre lavages de 10 minutes avec du T-TBS lait pour enlever l'excès d'ac1 On utilise ensuite un anti-corps secondaire (AC II) qui est couplé à un substrat (type HRP). AC II est un anti-corps anti anti-corps, il reconnaît notre anti-corps primaire. Ce substrat, par une réaction de chimioluminescence, nous permettra de visualiser notre protéine d'intérêt sur la membrane. Incubation de la membrane avec AC II pendant 45 minutes 4 lavages T-TBS lait + 1 lavage T-TBS de 10 minutes chacun Révélation et visualisation des bandes grâce au logiciel Image Lab 5. Dosage protéique par la méthode BSA BSA : Bovine Serum Albumine Pour le bon fonctionnement de l'électrophorèse, nous avons besoin d'environ 30-50μg de protéines. Pour estimer le volume à déposer dans les puits, on détermine la concentration de nos extraits protéiques grâce à des mesures d'absorbance d'une gamme étalon. Cette méthode utilise un réactif nommé le Working Reactif (WR) qui réagit avec les extraits, leur donne une teinte verte (selon la concentration) et permet de lire une absorbance pour λmax=562nm. Le dosage est impossible pour des réactions saturées (pour une A>2). Préparation de la gamme étalon sur une microplaque : Concentration (mg/ml) 0 Volume (μl) Masse (μg) 0,125 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 20μL de chaque concentration + 5μL d'h2o 0 2, Absorbance ( λmax=562nm) 0,2240 0,3778 0,5366 0,7954 1,0750 1,2750 1,6304 1,7474 9

11 Déposer différents volumes d'extraits à doser (dilués ou non) et compléter par de l'eau pour avoir un Vtotal=25μL dans chaque puits Préparation du Working Reactif (WR ratio 1:8) Ajouter 200μL de WR dans chaque puits Incuber la microplaque à 37 C pendant 30 minutes Mesure d'absorbance réalisation de la gamme étalon 6. Extraction d'adn Pour obtenir d'autres mutants FLN1, on a besoin de plantes hétérozygotes qui part autofécondation donneront ¼ de mutants. Pour connaître quelles plantes sont hétérozygotes, on les génotype. On réalise une extraction d'adn en vue de les génotyper. Prélever des feuilles sur différents plants que l'on nomme (Exemple : A, B, C, D...) Tampon d'extraction (100mL): 5mL EDTA 0,5M + 5mL NaCl 5M + 10mL Tris 0,2M + SDS + H2O Le Tris a pour but de stabiliser l'adn à un PH=8. Le NaCl va augmenter la force ionique et permet de décrocher les protéines (qui sont chargées) qui adhèrent à l'adn. L'EDTA piège les cations comme le magnésium. Le SDS, qui dans ce cas est fort, va exploser les cellule et permet ainsi la libération de l'adn. Ajout de 100μL de tampon d'extraction à 100mg de végétaux Broyage avec un piston Ajout de 100μL de tampon d'extraction et broyage Vortex pendant 10 secondes Centrifugation à rpm à température ambiante pendant 5 minutes Transfert du surnageant dans un tube contenant 100μL d'isopropanol Vortex pendant 10 secondes Centrifugation à rpm à T= 4 C pendant 5 minutes Élimination du surnageant et nettoyage du culot avec 150μL d'éthanol 70% Ajout de 50μL d'eau stérilisée. Mise en solution de l'adn par aspiration à la pipette Vortex pendant 10 secondes Centrifugation à rpm à température ambiante pendant 10 minutes Transfert du surnageant contenant l'adn dans un nouveau tube 10

12 7. Dosage de l'adn On dépose 1μL du surnageant dans une cuve adaptée et on y ajoute 100μL d'eau stérilisée. Mesure d'absorbance au spectromètre pour λmax=260nm (longueur d'onde caractéristique des acides nucléiques) qui nous indique directement la concentration suivant la dilution. 8. PCR (Réaction de polymérisation en chaîne) La PCR permet d'amplifier en un nombre très élevé de copies une séquence particulière d'adn ce qui facilite son étude et son exploitation. Cette méthode est basée sur le même principe de réplication que celui des cellules pour dupliquer l'adn. Dans notre cas, elle nous permettra d'amplifier l'expression du gène mutant FLN1 ou du sauvage WT, et on pourra ainsi génotyper nos plantes. Des séquences oligonucléotidiques complémentaires des extrémités 3' des deux brins du fragments d'adn à amplifier sont utilisées comme amorces pour l'adn polymérase. La PCR nécessite : de faibles quantités d'adn possédant la séquence cible à amplifier les deux amorces nucléotidiques complémentaires des séquences qui encadrent la cible à amplifier. L'hybridation des amorces sur les brins matrices est effectuée à une température bien précise qui permet l'«aniling». l'adn polymérase Taq qui va allonger les amorces dans le sens 5' 3' à Toptimal=72 C un mélange des quatres dntp (datp, dttp, dctp et dgtp) tampon 5x Une machine va procéder à des cycles d'amplification qui comprennent 4 étapes : cf Annexe 3 et 4 9. Electrophorèse sur gel d'agarose : génotypage Chauffage du gel d'agarose 1% au micro-onde. Ajout de Syber Safe dans l'agarose (intercalant d'adn). Gel d'agarose (1%) : 1g d'agarose + 100mL de TBE 0,5 Couler le gel et insérer le peigne. Attendre que le gel se solidifie. Placer 10μL de chaque tube de la PCR dans chaque puits Placer 5μL de marqueur de taille (Kb+) dans l'un des puits pour contrôler la PCR Migration dans du tampon TBE 0,5 pendant 17 minutes Les fragments d'adn spécifiques amplifiés migrent ensuite en fonction de la taille. On réalise à chaque fois deux puits pour chaque plante; un contenant les amorces spécifiques du gène FLN1 mutant et un autre qui amplifie le WT. Suivant les bandes que l'on obtient, notre plante est soit hétérozygote soit homozygote de phénotype sauvage. 11

13 II) RESULTATS DE MANIPULATIONS 1. Analyse de phénotypes à la loupe On utilise un microscope pour observer le phénotype de nos plantules âgés de quelques jours cultivés in vitro. On peut également réaliser des photographies. Il est ainsi possible de comparer le phénotype des Arabidopsis Thaliana sauvages (WT) et mutantes (couleur des feuilles, taille de la tige) et d'en déduire le rôle des protéines d'intérêt. On visualise la croissance de WT suivant le temps d'ensoleillement et de mise en culture. Soit FLN1 le gène responsable de la couleur des feuilles. FLN1 : allèle donnant la couleur verte fln1 : allèle donnant la couleur blanche Après un génotypage des Arabidopsis Thaliana, un croisement entre des plantes hétérozygotes (FLN1/fln1) a été réalisé. On observe une croissance qui obéit à la loi de Mendel : ¼ feuilles blanches albinos : (fln1/fln1) : homozygotes, mutants FLN1 ¾ feuilles vertes : - ½ (FLN1/fln1) : hétérozygotes -¼ (FLN1/FLN1) : homozygote, sauvage WT On constate que l'allèle fln1 qui donne la couleur blanche aux feuilles est récessif face à l'allèle FLN1. Cette allèle vient de la mutation FLN1. De plus, c'est un allèle léthal car on constate qu'un homozygote bloque sa croissance après la sortie des cotylédons (petites feuilles blanches visibles servant de source de réserves pour l'embryon) et la plante meurt par la suite. Croissance de plantules Arabidopsis Thaliana WT sur du milieu ATG (G=x100) Arabidopsis Thaliana WT 6 jours Arabidopsis Thaliana WT 4 jours 12

14 2. Coloration au Bleu de Coomassie Puits : 1 8μL Marqueur de taille 2 20μL Mutant FLN1 3 20μL WT J6 4 8μL Protéine isolée : PAP 6 Grâce à ce témoin on a pu voir que les protéines migrent bien sur notre gel. Sur le puits 4, on distingue la bande caractéristique de PAP 6 vers 50kDa. Sur le puit 3, on constate deux bandes larges vers 50kDa et 20kDa qui correspondent aux deux sous-unités de la Rubisco, gros complexe protéique. Par Western Blot, on pourra isoler PAP 6 de cet amas protéique. Sur le puit 2, on ne voit pas la bande caractéristique de PAP 6, ce qui est logique car il s'agit du mutant et car il ne possède pas la protéine. 3. Coloration au rouge Ponceau Cette coloration nous permet de contrôler que le transfert du Wertern Blot a bien marché. Comme on peut le voir, sur des extraits de plantes ou dans les chloroplastes, il y a toute sorte de protéines de taille très variée. On a choisit de distinguer les protéines «membranaires» (Mb) qui sont intermembranaires et pour lesquelles on utilise du détergent pour les décrocher ; et les protéines «solubles» (S) non retenues par la membrane. 4. Dosage au BSA Tableau 2 Mesure d'absorbance ( λmax=562nm) Phénotype Volume WT (S) 1/5 2 5 J6 (S) 1/ WT (Mb) 1/ J6 (Mb) 1/ d'extrait (μl) Absorbance 0,280 0,335 0,469 0,417 0,477 0,871 0,277 0,355 0,587 0,343 0,476 0,667 13

15 A l'aide de la gamme étalon on peut déterminer la concentration d'extraits protéiques. Après avoir déterminer la masse en μg dans chaque volume on réalise le calcul suivant : Pour un certain volume d'extrait : [Protéines] =Masse*1μL/Volume d'extrait En tenant compte du facteur de dilution (FD) : [WT (S)]=[WT (S) 1/5]*5 En faisant les moyennes on obtient finalement : [WT (S)]=3μg/μL [J6 (S)]=5,5μg/μL [WT(Mb)]=3,5μg/μL [J6 (Mb)]=6μg/μL 5. Western Blot (WB) : chimioluminescence AC I anti PAP6 : 1/5000 AC II lapin : 1/

16 Sur ce WB, on peut distinguer PAP 6 à ~ 50KDa sur la protéine isolée (PAP6) et dans les protéines solubles issues des chloroplastes isolées (chloroplaste (S)). Il n'y a aucune bande sur l'extrait protéique issue d'un extrait total de végétaux (J6). Ceci peut s'expliquer par le fait que PAP 6 est une protéine très minoritaire dans les végétaux et donc étant peu abondante, elle est cachée par d'autres protéines plus grosses qui empêche l'ac anti PAP 6 de la trouver. Conclusion : Notre anti-corps primaire reconnaît bien précisément la protéine PAP 6. Il est spécifique et nous permet de la localiser dans d'un extrait de chloroplastes. Cependant, dans un extrait total de végétaux l'anti-corps ne parvient pas à trouver PAP6. Ceci pose un problème car pour confirmer son absence dans les mutants FLN1, il faudrait analyser les protéines dans les chloroplastes or les mutants se distinguent des sauvages par l'absence de chloroplastes. (1) AC I PI (Pré Immun) FD 1/5000 (2) AC I PAP6 FD 1/15000 (1) : On utilise pour ce Western Blot de l'anti-corps pré immun de lapin, c'est à dire du sérum de lapin ne possédant pas d'anti-corps anti PAP 6. Sur la membrane, il n'y aucune bande correspondant à la protéine PAP6. (2) : On choisit de diluer l'anti-corps anti PAP 6 primaire avec un facteur dilution 1/ Sur le puit de la protéine PAP 6 isolée, on distingue bien la bande caractéristique de la protéine vers 50KDa. En revanche, il n'y a pas de bande sur les protéines des extraits J6 et WT. Ces manipulations nous ont permis de montrer que les lapins ayant reçu la protéine PAP6 dans leur organisme ont développé des anticorps spécifiquement dirigés contre cette protéine (AC I PAP6). Les anticorps du sérum des lapins non immunisés (ACI PI) ne reconnaissent pas la protéine PAP6. On ne distingue pas la bande caractéristique de PAP 6 dans les protéines des extraits végétaux WT et J6. 15

17 Conclusion : Notre anti-corps anti PAP 6 reconnaît spécifiquement la protéine pour une dilution de 1/ Nous pourrons utiliser cet anti-corps dans des manipulations futures pour localiser la protéine ou l'extraire d'un extrait total de protéines. 6. Profil d'électrophorèse génotypage de plantes grâce à une PCR Cycle : x35 Taq=72 C Taniling=54 C Amorces : 1) T-DNA : O PAP-386fw bande caractéristique du gène mutant FLN1 (~400bp) 2) Fragment contenant le gène PAP6 : PAP6-386fw + PAP+378rev bande caractéristique du gène sauvage WT (~ 800bp) Témoins : - WT : Bande sur le puits 2 ~ 800bp - FLN1 : Bande sur le puits 1 ~ 400bp Ces témoins montrent que nos amorces fonctionnent et amplifient respectivement des fragments de gènes spécifiques du mutant FLN1 ou du sauvage WT. A et C : Puits 1 bande caractéristique de FLN1 ~ 400 bp B et D : Aucune bande dans aucun des puits Il n'y aucune bande dans les puits 2, qui est caractéristique du gène sauvage WT. D'après ces résultats on pourrait penser que A et C sont homozygotes et possédent deux gènes FLN1. Cependant le phénotype est de type sauvage ce qui témoigne d'une hétérozygotie. Conclusion : Les amorces donnant le gène sauvage nécessite une plus grande quantité d'adn ce qui explique l'absence de bandes sur notre profil. De part le phénotype de nos plants, on déduit que celles qui possèdent une bande dans le puits 1 sont hétérozygotes, les autres homozygotes. A et C : hétérozygote (FLN1/fln1) B et D : homozygotes sauvage WT (FLN1/FLN1) 16

18 CONCLUSION Sur le projet PAP 6 Durant mon stage j'ai pu caractériser les anti-corps anti PAP6 par Western Blot en réalisant un extrait total de protéines de feuilles, des dosages par la méthode BCA, des séparations de polypeptides par électrophorèse SDS-PAGE, des transferts et immunodétectons. Cet anti-corps sera utilisé par la suite par mon maître de stage dans le cadre de ses recherches. La protéine PAP 6 de 52 KDa est soluble et on la distingue uniquement dans les protéines solubles de chloroplastes isolés. Une utilisation optimale de l'anti-corps anti PAP 6 se fait pour une dilution de 1/5000. J'ai réalisé le génotypage de plantes mutantes, de phénotype sauvage, par insertion d'un T-DNA. Les plantes hétérozygotes seront utilisées par la suite pour donner d'autres mutants homozygotes FLN1 (albinos), qui ne possèdent pas la protéine PAP6, afin de comprendre le rôle de cette protéine. Sur le stage Durant mon stage, j'ai eu la chance de manipuler en autonomie et d'utiliser des machines et outils scientifiques de précision. En plus d'améliorer ma technique au cours des expériences, ce stage m'a apporté de nombreuses précisions sur les protéines présentes chez les chloroplastes, leur caractérisation, les techniques de génotypage et en génétique. J'ai découvert une partie de la physiologie végétale grâce à des chercheurs et techniciens passionnés ; au niveau macroscopique, par l'observation du phénotype de plantules et au niveau moléculaire en analysant les protéines impliquées dans la morphogenèse des chloroplastes. Ce stage m'a plongé dans le monde de la Recherche, monde inconnu pour moi. Il m'a donné l'occasion de voir une utilité pratique et concrète des connaissances et manipulations que j'ai appris durant ma Licence. Je me suis familiarisée avec des techniques d'étude (dosage, Western Blot, génotypage) et j'ai acquis les bons gestes pour le bon déroulement des manipulations. Au cours du stage, on découvre l'interdépendance des matières vues à la fac. Ainsi, dans un laboratoire de physiologie végétale j'ai mêlé mes connaissances de biochimie, de génétique et de physiologie végétale. Sur les stages d'excellence Ce dispositif permet aux étudiants de découvrir le monde de la Recherche et le travail des enseignants chercheurs en dehors de l'université Joseph Fourier. J'ai consacré mes manipulations, recherches et documentations sur mon sujet d'étude comme le ferait un chercheur. Grâce à ces stages on peut découvrir des domaines variés de recherches comme la physiologie végétale, la biochimie ou les neurosciences afin de concrétiser des projets futurs. 17

19 Annexe 1 Marqueur de tailles suivant la porosité du gel d'acrylamide 18

20 Annexe 2 Sandwich pour l'électrotransfert 19

21 Annexe 3 Cycle d'amplification par PCR 20

22 Annexe 4 21

23 Annexe 5 Organigramme des équipes du LPCV Laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale Axes de recherche Compartimentation cellulaire et dynamique du métabolisme Equipe 1 Dynamique du protéome et régulation de la biogenèse et de Equipe 2 Biogenèse, dynamique et homéostasie des lipides membranaires. la physiologie du chloroplaste. Equipe 4 Réponse de la plante aux stress environnementaux et métaux lourds. Equipe 3 Dynamisme du métabolisme C1. Bases moléculaires de la morphogenèse Equipe 5 Physique du cytosquelette et de la morphogenèse Equipe 6 Régulateurs du développement de la fleur. Equipe 7 Expression du génome plastidial. Equipe 8 Biologie structurale integrée et développement des plantes 22