Extenson de la caractérsaton des proprétés mécanques d échantllons bologques par la technque d aspraton par mcroppette : Applcaton aux mleux sotropes Thomas Boudou a, Jacques Ohayon a, Catherne Pcart b & Phlppe Tracqu a a Laboratore TIMC-IMAG, Equpe DynaCell, CNRS UMR 555, Insttut de l Ingénere et de l Informaton de Santé, Faculté de Médecne de Grenoble, 38706 La Tronche cedex, France b Laboratore de Dynamque Moléculare des Interactons Membranares, CNRS UMR 5539, Unversté de Montpeller II, Pl. E. Batallon (Case 07), 34095 Montpeller cedex 5, France Web : http://www-tmc.mag.fr/dynacell Emal : Thomas.Boudou@mag.fr Résumé : L'aspraton par mcroppette est une technque fréquemment employée pour quantfer les proprétés mécanques d échantllons bologques. Le but de notre traval est d étendre les relatons exstantes entre hauteur asprée et module d'élastcté à l'étude d'échantllons bologques compressbles d épasseur fne, afn notamment de permettre la caractérsaton smultanée de leur compressblté et de leur rgdté. Nous avons établ une expresson non lnéare relant la hauteur de matère asprée, le module d Young, le coeffcent de Posson, et l épasseur de l échantllon. Sur la base de cette étude, nous avons développé un protocole expérmental orgnal assurant la quantfcaton smultanée du coeffcent de Posson et du module d Young d échantllons adhérents. Nous avons valdé avec succès cette méthode en caractérsant les proprétés mécanques de gels de polyacrylamde : la rgdté de ces polymères est en effet modulable en jouant sur le rapport des concentratons ntales en monomères et de ce fat ls sont fréquemment utlsés dans l'étude des nteractons mécanques cellules-substrat. Nous proposons c une relaton générale entre la rgdté des gels et ce rapport de concentratons. Abstract : The mcroppette aspraton experment remans a wdely used mcromanpulaton technque for quantfyng the mechancal propertes of bologcal samples. Ths work extends prevous formulatons between asprated length and elastc modul to the study of compressble thn bologcal samples, n order to characterze ther compressblty and ther rgdty. We thus defned a non lnear relatonshp between asprated length, Young s modulus, Posson s rato and sample thckness whch allowed us to develop an orgnal expermental protocol for smultaneous quantfcaton of the Posson s rato and Young s modulus of adherent samples. We then successfully valdated ths method by characterzng the mechancal propertes of polyacrylamde gels. Those polymers are frequently used for studyng the mechancal nteractons between cells and substrate because ther rgdty s easly tunable by varyng monomers concentraton rato. We proposed here a general relatonshp between gels rgdty and ths rato. Mots-clefs : Mcromanpulaton Elastcté lnéare - Gels sotropes Introducton L'aspraton par mcroppette est une technque expérmentale fréquemment employée pour quantfer les proprétés mécanques d échantllons bologques (Alexopoulos et al. (003); Aok et al. (997)). L nfluence des paramètres géométrques de la mcroppette (rayons nterne et externe) sur la déformaton de l échantllon étudé est actuellement ben connue, auss ben dans le cas de cellules en suspenson (Alexopoulos et al. (003); Theret et al. (988)) que dans celu de tssus mous (Aok et al. (997)). Les analyses théorques d Aok et al. (997) et d Alexopoulos et al. (003) ont about à des relatons analytques entre presson d aspraton et hauteur de matère asprée, permettant ans la quantfcaton du module d Young d échantllons bologques ncompressbles et non adhérents. Notre étude porte sur l extenson du domane d applcaton de la technque d aspraton par mcroppette afn de caractérser la rgdté et la compressblté d échantllons adhérents.
Nous avons en premer leu réalsé un modèle aux éléments fns smulant l expérence d aspraton par mcroppette, afn d étuder l nfluence de la compressblté et de l épasseur de l échantllon, adhérent ou non au substrat, sur sa réponse mécanque. Nous avons pu ans pu établr une expresson non lnéare relant la hauteur de matère asprée aux module d Young, coeffcent de Posson, épasseur de l échantllon, dmensons de la mcroppette, et presson d aspraton. Sur la base des résultats ssus de ce modèle mécanque, un protocole expérmental orgnal a été élaboré. Ce derner permet la quantfcaton smultanée du coeffcent de Posson et du module d Young d échantllons sotropes adhérents (Boudou et al. (006a)). Enfn, nous avons applqué et valdé avec succès cette méthode en caractérsant les proprétés mécanques de gels sotropes fns de polyacrylamde. Ces gels sont fréquemment utlsés dans l étude des comportements cellulares tels que la mgraton (Peyton et al. (005)), la dfférentaton (Flanagan et al. (00)) ou le développement des adhésons focales (Engler et al. (004), Colln et al. (006)). En effet, ls sont transparents, faclement reproductbles et leur rgdté vare en foncton du rapport des concentratons ntales en monomères acrylamde [Acry] et bsacrylamde [Bs]. Nous proposons c une relaton générale qu permet de quantfer la rgdté des gels en foncton de ce rapport acrylamde/bs-acrylamde (Boudou et al. (006b)). Cette relaton a été étable à partr de nos mesures et de données précédemment publées (Engler et al. (004), Flanagan et al. (00), Peyton et al. (005)). Nous avons ans smultanément quantfé le module d Young et le coeffcent de Posson de gels de polyacrylamde adhérents pour des compostons de gels dans les domanes suvants : 0.0% [Bs] 0.0% et 3% [Acry] 0%. Cette quantfcaton est possble sans hypothèse à pror sur le coeffcent de Posson, alors que présupposer la valeur de celu-c est nécessare dans d autres études pour obtenr le module d Young (Engler et al. (004), Flanagan et al. (00)). L'autre ntérêt de notre approche est d amélorer notre compréhenson de la réponse mécanque de ces polymères et de permettre la réalsaton de gels de polyacrylamde à module d Young contrôlé. Modélsaton de l expérence d aspraton par mcroppette. Modèle aux éléments fns L échantllon est représenté par un cylndre fn de rayon a et d épasseur h, la mcroppette par un cylndre creux de rayons nterne et externe R et R e, respectvement. Le problème étant axsymétrque, nous avons ramené notre étude à l analyse structurelle en deux dmensons d un échantllon sotrope, de module d Young E et de coeffcent de Posson ν, soums à une presson d aspraton P. L nterface ppette/échantllon est mallée avec des éléments de contact spécfques autorsant un glssement sans frcton de l échantllon. De plus, nous avons envsagé deux types de condtons aux lmtes pour la surface échantllon/substrat rgde: () aucun déplacement (cas d'un échantllon complètement adhérent au substrat) ou () glssement sans frcton (cas d'un échantllon non adhérent) (Fg. ). Les solutons du problème sont calculées numérquement avec le logcel Ansys (verson 0.0, Ansys Inc., Connonsburg, PA, USA). Etat des connassances Dans le cas d un mleu sotrope, ncompressble (ν = 0.5) et sem nfn (a et h tendent vers l nfn) soums à de pettes déformatons, Theret et al. (988) ont dérvé une relaton analytque entre la presson applquée P et la hauteur de matère asprée d : 3 P δ = Φ( η) () π E où δ est la hauteur de matère asprée normalsée par le rayon de la ppette (δ = d/r ) et Φ(η) le facteur de forme de la ppette, avec η = (R e R )/R. L équaton () a été largement utlsée pour estmer les modules d Young apparents E app d échantllons bologques. En effet, lorsque la foncton Φ(η) est connue, le module d élastcté apparent peut être drectement exprmé en
foncton de la hauteur de matère asprée mesurée, de la presson applquée et de la géométre de la ppette : 3 P E app = Φ( η) () π δ Theret et al. (988) ndquent que Φ(η).05 pour des valeurs réalstes de η comprses entre 0.4 et 0.6. En accord avec cette estmaton, nous avons trouvé que la valeur moyenne du facteur de forme Φ(η) état de.066 pour 0.4 η 0.6. Cette valeur sera utlsée dans le reste de cette étude. R e Mcroppette R P Glssement z r Axe de symétre Déplacements normaux nul (u r = 0) FIG. Modèle éléments fns de l expérence d aspraton par mcroppette. Le problème étant axsymétrque, seule une vue projetée du dem échantllon est présentée..3 Influences de l épasseur et des condtons d adhéson de l échantllon La fgure présente l nfluence de l épasseur de l échantllon sur la répartton spatale des déformatons effectves pour les deux condtons d adhéson modélsées : échantllon adhérent (Fg., colonne A) et non adhérent (Fg., colonne B). Les smulatons permettent de mettre en évdence l nfluence des condtons d adhéson lorsque l épasseur de l échantllon devent fable..4 Extenson de l expresson analytque Pour prendre en compte les dfférences entre un mleu ncompressble sem nfn et un échantllon compressble de dmensons fnes, nous avons reformulé l équaton () en y ntrodusant un coeffcent correcteur α dépendant de l épasseur normalsée ξ = h/r, du coeffcent de Posson ν et de la condton d adhérence : E = α ξ, ν E (3) ( ) app a Interface échantllon/substrat CL : Aucun déplacement (u r = u z = 0) CL : Glssement (u z 0) Nous avons ensute smulé envron 000 confguratons réalstes échantllon/mcroppette avec des paramètres comprs dans les ntervalles suvants : µm R 0µm, µm h 60µm, 0.4 η 0.6 et 0. ν 0.49. Le rapport a/r est constant et fxé à 30, afn d évter les effets de bord. Nous avons ans proposé l'expresson analytque de α suvante, qu permet un ajustement très satsfasant aux données smulées (r² > 0.99) : p( ν ) ξ α ( ν, ξ ) = H( ν ) p K (4) ( ν ) ( ν ) + ξ avec n = dans le cas d un échantllon adhérent, n = - dans celu d un échantllon non adhérent et où H(ν), K(ν) et p(ν) sont des fonctons polynomales dépendant de ν et de la condton n h 3
d adhéson. L équaton (4) ndque que le coeffcent α tend vers H(ν) s l échantllon est sem nfn (ξ ). S l échantllon est de plus ncompressble, α tend alors vers et l on retrouve l équaton (). Dans le cas d échantllons non adhérents, nous avons comparé nos résultats avec les solutons dérvées d Alexopoulos et al. (003) et les résultats numérques d Aok et al. (997). L écart observé reste nféreur à 5% pour les échantllons très fns (ξ 0.3) et tombe en dessous de 3% pour ξ 0.3. Notons enfn que l écart entre les modules d Young E et E app dépasse les 30% lorsque ξ. FIG. Cartographes des réparttons spatales des déformatons effectves dans des échantllons (E = kpa, ν = 0.3) soums à une presson d aspraton P = 0Pa par une ppette de rayon R = µm. Colonne A: échantllon adhérent, (h/r =, δ =.57.0 - ) et (h/r = 4, δ =.4.0 - ). Colonne B: échantllon non adhérent, (h/r =, δ = 4.0.0 - ) et (h/r = 4, δ =.54.0 - ). Les déplacements sont multplés par 0 pour amélorer leur lsblté. 3 Estmaton des proprétés mécanques d échantllons adhérents A partr de l expresson analytque du coeffcent correcteur α(ν,ξ), nous avons développé un protocole expérmental orgnal permettant la caractérsaton smultanée du module d Young E et du coeffcent de Posson ν d un échantllon adhérent. On réalse pour cela deux aspratons sur l échantllon d épasseur h à caractérser avec deux mcroppettes de rayons nternes R et R tels que ξ = h/ R < 0.8 (condtons fnes) et ξ = h/ R >.5 (condtons sem nfnes). Notons δ et δ les hauteurs de matère asprée assocées, et P et P les pressons applquées pour chaque aspraton. Le rapport R = α(ν,ξ )/α(ν,ξ ) peut alors être écrt en foncton des mesures expérmentales connues, tel que R = ( P δ )/( P δ ). Ce rapport est donc ndépendant du module d Young E et peut ans être exprmé comme une foncton du coeffcent de Posson ν et des paramètres connus ξ, ξ, P et P : R( ν, ξ, ξ ) p( ν ) p( ν ) ξ K( ν ) + ξ P δ = ( ν ) ξ = (5) p K( ν ) + ξ P δ La résoluton de cette équaton non lnéare dans l ntervalle 0 ν 0.5 permet ans de remonter au coeffcent de Posson ν. Il devent alors possble de calculer le module d Young E à partr de l équaton (3). 4 Valdaton et caractérsaton des gels de polyacrylamde Afn de valder cette étude, nous avons caractérsé les proprétés mécanques de gels de polyacrylamde. Ces polymères sont en effet régulèrement utlsés comme substrat cellulare, 4
car leur rgdté est modulable en foncton des concentratons ntales en monomères d acrylamde [Acry] et de bs-acrylamde [Bs]. Nous avons donc réalsé des gels adhérents sur des lamelles de verre suvant la méthode décrte par Pelham et al. (997). Nous avons caractérsé 36 gels de polyacrylamde contenant des concentratons d acrylamde de 5%, 8% et 0% et des concentratons de bs-acrylamde comprses entre 0.05% et 0.0%. L épasseur de ces gels vare entre.8µm et 4.µm. Les coeffcents de Posson mesurés restent très proches de 0.5, quelles que soent les concentratons [Acry] et [Bs], avec une valeur moyenne de ν = 0.480 ± 0.0. Ce résultat confrme expérmentalement les hypothèses de quas-ncompressblté postulées par Engler et al. (004) ans que par Peyton et al. (005). Les mesures d élastcté réalsées sur des gels avec 5%, 8% et 0% d acrylamde mettent en évdence l augmentaton lnéare du module d Young E en foncton de la concentraton de bs-acrylamde, dans le domane 0.05% [Bs] 0.0%. Par contre, l augmentaton du module d Young en foncton de la concentraton d acrylamde est non lnéare. Nous avons ensute comparé ces résultats avec des valeurs d élastcté obtenues par dfférentes méthodes. La fgure 3 permet de mettre en évdence la corrélaton forte entre nos résultats et ceux obtenus par Engler et al. (004), Flanagan et al. (00) et Peyton et al. (005). Ces mesures d élastcté nous ont perms de formuler une relaton analytque entre le module d Young E et les concentratons en acrylamde et bs-acrylamde: E([ Acry],[ Bs]) = β ([ Acry])[ Bs] (6) où β([acry]) est une foncton polynomale dépendant de [Acry]. La correspondance avec les résultats obtenus est très satsfasante (r² > 0.998). Notons toutefos que cette relaton n est valable que dans le domane 3% [Acry] 0% et 0.0% [Bs] 0.0%. FIG. 3 Comparason des modules d Young mesurés et rapportés de gels de polyacrylamde en foncton des concentratons d acrylamde et de bs-acrylamde: 3% d acrylamde, rhéomètre, ν = 0.5, Flanagan et al. (00). 5% d acrylamde, aspraton par mcroppette, étude actuelle. 5% d acrylamde, mcroscope à force atomque, ν = 0.45, Engler et al. (004). 8% d acrylamde, aspraton par mcroppette, étude actuelle. 8% d acrylamde, tests de tracton macroscopque, ν = 0.5, Peyton et al. (005). 0% d acrylamde, aspraton par mcroppette, étude actuelle. Les barres d erreur représentent la valeur moyenne ± écart type. 5 Conclusons La caractérsaton des proprétés mécanques de dfférents objet bologques (cellules, tssus,...) est un élément essentel pour l'étude de leur foncton. Nous proposons dans cette étude une méthode smple permettant de mesurer l élastcté d échantllons fns, adhérents ou non, grâce à la technque d aspraton par mcroppette. L ntroducton d un facteur correcteur α 5
dépendant de l épasseur normalsée et du coeffcent de Posson de l échantllon, nous a perms de développer un protocole expérmental orgnal de mesure des proprétés élastques et compressbles d échantllons adhérents. Celu-c nous a perms de quantfer précsément les proprétés mécanques de gels de polyacrylamde, polymères fréquemment utlsés pour étuder les comportements cellulares. Nous avons ans établ la quas-ncompressblté de ces gels et nous avons proposé un relaton mathématque non lnéare permettant le calcul du module d Young de gels de polymère en foncton de leurs concentratons en monomères acrylamde et bs-acrylamde. Pluseurs extensons de cette étude sont actuellement en cours, ncluant la prse en compte des grandes déformatons ans que l ansotrope du matérau, afn d amélorer spécfquement la caractérsaton des matéraux bologques. Références Alexopoulos, L.G., Hader, M.A., Val, T.P. & Gulak, F. 003 Alteratons n the mechancal propertes of the human chondrocyte percellular matrx wth osteoarthrts. J. Bomech. Eng. 5, 33-333. Aok, T., Ohash, T., Matsumoto, T. & Sato, M. 997 The ppette aspraton appled to the local stffness measurement of soft tssues. Ann. Bomed. Eng. 5, 58-587 Boudou, T., Ohayon, J., Arntz, Y., Fnet, G., Pcart, C. & Tracqu, P. 006a An extended modelng of the mcroppette aspraton experment for the characterzaton of the Young s modulus and Posson s rato of adherent thn bologcal samples: Numercal and expermental studes. J. Bomech. 39, 677 685. Boudou, T., Ohayon, J., Pcart, C. & Tracqu, P. 006b An extended relatonshp for the characterzaton of Young s modulus and Posson s rato of tunable polyacrylamde gels, J. Rheol. 43(6), 7-78. Colln, O., Tracqu, P., Stephanou, A., Usson, Y., Clement-Lacrox, J. & Planus, E. 006 Spatotemporal dynamcs of actn-rch adheson mcrodomans: nfluence of substrate flexblty, J. Cell. Sc. 9(9), 94-5 Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Grffn, M. & Dscher, D. 004 Substrate complance versus lgand densty n cell on gel responses. Bophys. J. 56, 67-68. Flanagan, L.A., Ju, Y., Marg, B., Osterfeld M. & Janmey, P.A. 00 Neurte branchng on deformable substrates, Dev. Neurosc. 3, 4-5 Pelham, R.J. & Wang, Y.L. 997 Cell locomoton and focal adhesons are regulated by substrate flexblty. Proc. Natl. Acad. Sc. 94(5), 366-65 Peyton, S.R. & Putnam, A.J. 005 Extracellular matrx rgdty governs smooth muscle cell motlty n a bphasc fashon. J. Cell. Physol. 04, 98-09. Theret, D.P., Levesque, M.J., Sato, M., Nerem, R.M. & Wheeler, L.T. 988 The applcaton of a homogeneous half-space model n the analyss of endothelal cell mcroppette measurements. J. Bomech. Eng. 0, 90-99. 6