Clonage de Vénus et transformation de E.Coli.

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1 Clonage de Vénus et transformation de E.Coli. Samueal Joseph, Romain Laverrière, Elias Laudato, Noé Mage Assisstants : Gisele Dewhurst, Charlotte Gehin, Miwa Umebayashi Résumé [1] L expérience consiste à cloner le gène Vénus, codant pour une protéine similaire à la green fluorescent protein (GFP), et de l introduire (et donc de l exprimer) par l intermédiaire d un plasmide dans une bactérie, E.Coli en l occurrence. Pour ce faire, une amplification du gène d intérêt par polymerase chain reaction (PCR) a été nécessaire. Puis, ce gène a été inséré dans le plasmide digéré auparavant par des enzymes de restriction (XhoI et BamHI). Une ligase a alors permis d y insérer le gène. Le plasmide a finalement été incorporé dans les bactéries E.Coli et une mise en culture dans un milieu riche en ampicilline a permis de sélectionner celles ayant incorporé le plasmide. Enfin, une électrophorèse a confirmé le clonage et la fluorescence résultant de l expression de Venus a permis de révéler sa présence par analyse aux UV. Introduction La Protéine fluorescente verte (nommé GFP) est une protéine qui a été découverte, pour la première fois, dans une méduse connu sous le nom de «Aequorea victoria» [2]. Cette protéine, comme son nom l indique, est capable d émettre une couleur verte lors d une excitation par Ultra- Violet. Le gène codant pour cette protéine, et ses variantes, est essentiel pour le marquage de différent gène étudié par fusion des deux gènes. Différentes protéines, qui ont des propriétés similaires à la GFP, peuvent émettre dans différentes couleurs tel que le bleu- vert (CFP), le bleu (BFP) ainsi que le jaune (YFP) qui a pour variantes la protéine «Venus». Durant ce travail pratique, la technique du clonage biologique moléculaire est utilisée. Elle permet d étudier une protéine voulue en la copiant en très grand nombre après «insertion» dans un vecteur. Le clonage du gène est précédé, durant l expérience, par la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette technique permet l amplification d un fragment d ADN ou d ARN. Le fragment voulu doit contenir une amorce spécifique pour que la copie soit possible. Le clonage est un moyen utiliser afin d obtenir le fragment d ADN «insérer» dans un plasmide. Cette technique, ainsi que d autres, vont être mises à profit lors de ce laboratoire afin de pouvoir vérifier si l insertion d un fragment d ADN dans un plasmide peut s exprimer. Page 1 sur 7

2 Résultats Amplification du gène venus La première étape étant d amplifier la quantité d insert «VENUS», le mélange suivant a été incubé dans les conditions adéquates pour la PCR : Echantillon d ADN (insert) : 10X buffer : 2.5 μl 5 μl 250 μm de dntp(oligonucleotides) : 5 μl 2 μm d amorce F1 : 4 μl 2 μm d amorce R1 : 4 μl Taq polymérase Eau 1 μl 28.5 μl Calculés à partir de la relation : Image 1 : PCR «Venus»!!"!#!$%!!"!#!$% =!!"#$%!!"#$%!!"!#!$% =!!"#$%!!"!#!$%!!"#$% Le processus terminé, nous obtenons le résultat ci- contre (image 1) : Cette photographie nous indique que le procédé s est bien déroulé. En effet, la taille de l échantillon amplifié se trouve entre 0.5 et 1 kb (approximativement 0.7 kb) correspondant parfaitement à la taille de l insert «VENUS» dont la taille est de 720 pb [3]. Digestion du vecteur et du produit de PCR La digestion du plasmide et de l insert «VENUS» s est effectuée grâce aux enzymes de restriction BamHI et XhoI. Celles- ci ont permis à partir des fragments d ADN purifiés d ouvrir le plasmide (circulaire) et de former les parties terminales cohésives qui permettront à posteriori l insertion de «VENUS» dans le plasmide (par ligation). Ainsi, la photographie ci- contre révèle premièrement la présence d insert (0.7kb), puis deuxièmement la présence du plasmide digéré linéaire d environs 5 kb. La pureté relative et la concentration correspondante de chaque échantillon sont calculées à partir de l absorbance d échantillons contenant plasmides et insert. Image 2 : produit de digestion plasmide & insert Page 2 sur 7

3 Pureté : Plasmide A 260 = A 280 = Ratio = A 260 / A 280 = 1.4 Insert A 260 = A 280 = Ratio = A 260 / A 280 = 3.3 Les valeurs de ratio admises pour qualifier les échantillons de purs étant comprises entre 1.8 et 2.2, on constate que nos échantillons ne sont pas purs. Concentration : d après la relation : Plasmide = 70ng/mL (A 260 x 50μg/mL) x 100 Insert = 50ng/mL Nous avons donc deux échantillons de respectivement 70 ng/ml de plasmide et 50ng/mL d insert. Ces valeurs connues, il nous est possible de prévoir la quantité nécessaire de chacune de ces espèces pour l étape de la ligation. Transformation Après l obtention de bactéries capables d évoluer dans un milieu restrictif et permettant donc après insertion de «VENUS» d obtenir une colonie spécifique de bactéries exprimant le gène cible, 21 ng (0.42 μl) d insert sont prélevés depuis notre stock de 50ng/mL. Ils sont mélangé alors à 0.71 μl de vecteur et complété à 10 μl avec de l eau. Ainsi nous obtenons une première boite nommée «I1». Une deuxième boite, nommée «C1», sans insert, est préparée (0.71 μl de vecteur complété à 10 μl par de l eau) et sert de contrôle. Les quantités nécessaires sont calculées à partir de la formule suivante :!"!"#$"%&!"!"#$%&!"!"#$"%&!"#$%!"#$%&'!"#$%&!"#$"%& =!"!"#$%& Page 3 sur 7

4 Ainsi après préparation des cultures bactériennes, nous obtenons les résultats suivants: Image 3 : Culture bactérienne personnelle Image 4 : Culture bactérienne assistants Le milieu de culture préparé par nos soins présente un meilleur résultat. En effet, la boite I1 a permis d obtenir une plus grande quantité de culture bactérienne utile (exprimant le gène cible) que la culture bactérienne I2 faite par les assistant. La suite du travail s est donc effectuée avec la population I1. Page 4 sur 7

5 Contrôle des positifs Parmi les cinq colonies introduites dans les milieux de culture IPTG+ et IPTG-, on observe que la colonie 2 exprime favorablement le gène souhaité : Image 5 : Colonies avec insert(1-5) et sans insert (6) dans un milieu contenant de l IPTG (à droite) ou non (à gauche). Contrôle du plasmide purifié Le résultat de la digestion du produit final (plasmide + insert) montre que les colonies 1, 2 et 4 présentent les mêmes caractéristiques, soit la fluorescence induite par «VENUS» (Image 6). On peut donc conclure que trois colonie sur cinq (la sixième étant de contrôle négatif) sont le résultat d une transformation du plasmide bactérien, traduit par l expression du gène inséré. Image 6 : colonies post- digestives Page 5 sur 7

6 Discussion Amplification du gène venus Le gène VENUS a effectivement été amplifier comme le démontre le gel d électrophorèse. En effet, une bande entre 0.5 et 1 kb est présente sur le gel et correspond au gène VENUS dont la taille est d environ 0.7 kb. Une seule bande est visible ce qui sous entend qu uniquement le gène VENUS a été amplifié. Le cycle de PCR a été répété 30 fois afin d atteindre un niveau d amplification suffisant pour la suite de l expérience. Digestion du vecteur et du produit de PCR Le vecteur est le plasmide pgex- 4T- 3 d une longueur de 4.9 kb [3] et est visible sur le gel d électrophorèse réalisé après la digestion à une position entre 4 et 5 kb. Avant la digestion, le plasmide ne forme pas une bande distincte du fait de sa non- linéarité. Ainsi, le fait de voire une bande unique et distincte pour le vecteur prouve que celui- ci a été digéré. Le produit de PCR forme une bande entre 0.5 et 1 kb, ce qui est tout à fait cohérant étant donné la taille du gène de 0.7 kb. Il n est pas possible d affirmer avec certitude que le produit de PCR a bien été digéré car la différence de masse entre celui- ci digéré ou non digéré est trop faible pour être distinctive sur le gel. Transformation Comme attendu, la plaque avec les bactéries transformée avec le vecteur contenant l insert (colonies «I») contient plus de colonies que la plaque contrôle (colonies «C»). Ceci est du au fait que les bactéries contrôle n exprime pas le vecteur car celui- ci n est pas refermé étant donné que ses extrémités ne sont pas cohésives. Le milieu d incubation contient de l ampicilline et le vecteur contient un gène de résistance à cet antibiotique. Les bactéries insert, dont le vecteur inséré a été ligué en présence du gène VENUS sont fermés et celui- ci est donc exprimé, permettant à la bactérie de survivre dans un milieu d ampicilline. Le fait que des bactéries puissent tout de même se développer dans les boites contrôle est certainement du au fait que la digestion des vecteurs ne se soit pas réalisée à 100 % et qu une partie de ceux- ci soit donc resté sous forme circulaire avant la transformation dans les bactéries. Le choix des souches pour la suite de l expérience s est porté sur les notre car le rapport entre le nombre de colonies insert en fonction du nombre de colonies contrôle a été jugé meilleur. Contrôle des positifs Selon l observation des plaques sous UV, des 5 colonies insert sélectionnées, uniquement la colonie 2 semble contenir le gène VENUS car celle- ci est fluorescente. Comme attendu, le contrôle (colonie 6) ne fluoresce pas et la protéine VENUS n est pas exprimée dans cette souche. Le gel d électrophorèse correspond à l hypothèse ci- dessus mais montre que le gène VENUS est également présent dans les colonies 1 et 4, en plus de la colonie 2 (bande distincte à 0.7 kb). Le fait que le gène soit présent dans le génome mais que le phénotype ne soit pas visible s explique par un disfonctionnement de la production de la protéine. Ceci peut- être du à une mutation ou un mauvais cadre de lecture engendré par exemple par une erreur dans la PCR. Les colonies 3 et 5 ne contienne pas le gène VENUS mais celles- ci ont tout de même pu se développer en présence d ampicilline. L explication est la même que pour le développement des Page 6 sur 7

7 bactéries contrôle (souche 6), à savoir le fait que la ligation n a pas été réalisée sur la totalité des plasmides et que certains ont été intégré dans les bactéries sans contenir le gène VENUS, circulaire et donc exprimable, conférant à la bactérie la résistance à l antibiotique. La colonie sélectionnée pour extraire les plasmide est la souche 2 étant donné que celle- ci est la seule contenant le gène VENUS exprimable en protéine VENUS. Contrôle du plasmide purifié L électrophorèse du plasmide purifié de la souche 2 est comparé au plasmide purifié de la souche contrôle avant et après digestion. Le plasmide de la souche 2 contient toujours le gène VENUS (bande à 0.7 kb) et le plasmide de la souche contrôle ne le contient pas. L électrophorèse des plasmides non- digéré montre comme attendu que celui contenant le gène VENUS est plus lourd que celui ne le contenant pas. Conclusion On peut affirmer que la transformation a bien eu lieu et donc que les manipulations se sont bien déroulées. De plus, aucunes impuretés n est a déplorer. «Nous attestons que dans ce texte toute affirmation qui n est pas le fruit de notre réflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d une autre source est en outre placé entre guillemets.» Samuel Joseph Elias Laudato Romain Laverrière Noé Mage Source [1] Thierry Soldati, TRAVAUX PRATIQUE DE BIOCHIMIE, Manipulation d ADN (2012) [2] actualites/actualite- as/wl/ /nobel- de- chimie la- lumiere- venue- des- mers/ [3] freiburg.de/toolbox/products.php?pl- 385 [4] Page 7 sur 7

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