Détection. Couplage parallèle de la nanohplc à l ICP-MS et à l ESI-MS. Bénéfices de cette approche pour l analyse de biomolécules
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- Raymonde Truchon
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1 TECHNIQUE INSTRUMENTALE Pierre GIUSTI, Dirk SCHAUMLÖFFEL, Ryszard LOBINSKI, Joanna SZPUNAR Couplage parallèle de la nanohplc à l ICP-MS et à l ESI-MS. Bénéfices de cette approche pour l analyse de biomolécules Détection RÉSUMÉ Les hétéroatomes tels que le soufre, le phosphore, le sélénium, l iode ou différents métaux sont souvent présents dans la structure des biomolécules. Leur détection par spectrométrie de masse élémentaire à source d ionisation induite par plasma haute fréquence (ICP-MS) après séparation chromatographique présente plusieurs avantages. Contrairement aux sources d ionisation de type electrospray, ce mode d ionisation est indépendant de la matrice, des composés coéluants avec les analytes et de leur structure moléculaire. L ICP-MS est par ailleurs un détecteur très sensible qui permet d atteindre des limites de détection de l ordre du femtogramme et se révèle spécifique de l isotope de l élément étudié. Ces caractéristiques font de l utilisation du couplage HPLC-ICP-MS une technique complémentaire de l approche classique d analyse des biomolécules et complexes métalliques par HPLC-ESI-MS/MS. Cette revue décrit deux dispositifs instrumentaux permettant le couplage de la nanohplc à l ICP-MS et détaille les informations complémentaires apportées par ce dernier pour la protéomique en général et la cartographie peptidique quantitative. MOTS-CLÉS NanoHPLC, ICP-MS, dilution isotopique, nébuliseurs, protéomique quantitative, métallomique NanoHPLC with parallel electrospray and inductively coupled plasma MS detection for biomolecules analysis. SUMMARY The inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS) is an element and isotope specifi c technique which provides detection limits at the femtogram level regardless of the molecular structure of the analyte and its coelution with matrix components and interfering compounds. These features make ICP-MS an ideal complementary detection technique to electrospray MS/MS in HPLC of metal complexes or biomolecules containing in their structure a heteroatom, such as, for example, sulphur, phosphorous, selenium or iodine. This article discusses two experimental setups for interfacing nanohplc to ICP-MS and highlights potential added value of ICP-MS for quantitative peptides mapping and proteins characterization. KEYWORDS NanoHPLC, ICP-MS, isotopic dilution, nebulizers, quantitative proteomics, metallomics. Equipe de Chimie Analytique Bio-inorganique - CNRS UMR av. pdt Angot Pau, France - Tél. : Fax : Joanna.Szpunar@univ-pau.fr 38 SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre 2006
2 Technique instrumentale Couplage parallèle de la nanohplc à l ICP-MS et à l ESI-MS. Bénéfices de cette approche pour l analyse de biomolécules I - Introduction La diminution des diamètres de colonne pour chromatographie liquide a été motivée par les avantages qu elle procure pour l analyse d échantillons d origine biologique. Il est courant de ne disposer que de quelques microgrammes d échantillons qui nécessitent d être analysés dans des volumes n excédant pas le microlitre. L illustration ultime concerne l étude des processus biologiques à l intérieur d une seule cellule (1). La nanohplc utilisant des colonnes HPLC de diamètre interne 75 μm, traversées par des débits compris entre 200 à 400 nl.min-1, couplée à l electrospray MS/MS constitue aujourd hui une technique de choix en protéomique. Elle permet des séparations à haute résolution de mélanges complexes de peptides contenus dans de très faibles volumes d échantillons (2). L efficacité de l ionisation par électronébulisation (electrospray) dépend de la structure moléculaire de l analyte et peut être gravement affectée par la matrice et ses sels. Le courant d ionisation total (TIC) obtenu lors d une analyse par nanohplc- ESI-MS provient majoritairement des composés s ionisant aisément alors que l information concernant les analytes minoritaires est souvent perdue. L ionisation d un composé en electrospray est directement liée à la pureté relative de ce dernier lorsqu il arrive à la source. Il existe donc un besoin évident de protocoles de purification efficaces à l échelle picomolaire et de méthodes analytiques permettant de contrôler l enrichissement et la pureté des analytes dans ces échantillons. Une approche pertinente d un point de vue analytique consiste à suivre les biomolécules d intérêt par l intermédiaire des hétéroatomes qu elles contiennent (S, P, Se ou un métal). L ICP-MS est pour cela un détecteur de choix grâce à sa sensibilité, sa spécificité, la gamme étendue dans laquelle sa réponse est linéaire et sa tolérance aux matrices chargées (3, 4). Malgré la perte de l information structurale lors de la détection par ICP-MS, cette technique offre de nombreux avantages en complément de la détection par electrospray. Cependant l extension de cette stratégie au domaine de l analyse de spéciation et à la protéomique hétéroatomique a été freinée jusqu ici par le manque d interfaces permettant le couplage de la nanoh- PLC à l ICP-MS. II - Couplage nanohplc-icp-ms avec débit d appoint Le principal défi à relever pour coupler la nano- HPLC à l ICP-MS provient de la différence de gamme de débit entre ceux utilisés en nanohplc (quelques centaines de nanolitres par minute) et les débits des systèmes classiques d introduction de liquide dans un ICP-MS (0.5-1 ml.min-1). Il existe un éventail important de micronébuliseurs commerciaux mais leur débit opérationnel optimal est compris entre 50 et 200 μl.min-1. Récemment une interface utilisant un micronébuliseur (DS5) fonctionnant pour des débits allant de 3 à 7 μl.min-1 a permis le couplage à l ICP-MS de l électrophorèse capillaire à l aide d un débit d appoint (5) et de la chromatographie liquide capillaire (6) à l ICP-MS. Ce micronébuliseur (DS5) a permis de réaliser le premier couplage nanohplc - ICP-MS en ajoutant un débit d appoint de plusieurs microlitres par minutes, augmentant ainsi artificiellement le débit de sortie de la nano-colonne. Le dispositif instrumental a déjà fait l objet d une description complète que le lecteur pourra retrouver dans la référence (7) et se trouve représenté au niveau de la figure 1. Le débit d appoint est bien supérieur au débit provenant de la colonne : 3,8 μl.min -1 contre 300 nl.min -1. Ce deuxième flux étant ajouté après REMERCIEMENTS Ces travaux ont été réalisés dans le cadre de l ACI NMAC n 67 du CNRS et du programme ToxNuc-e du CEA. Les auteurs tiennent aussi à remercier la région Aquitaine qui a permis l acquisition des instruments au travers des CPER 20.6 (OR- QUE) et 21.6 (IPREM) que la compagnie Agilent Technologies pour son soutien de la plate-forme ICP-MS. Figure 1 Dispositif instrumental du couplage nanohplc - ICP-MS avec dilution isotopique (ID) utilisant l interface à débit d appoint. SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre
3 TECHNIQUE INSTRUMENTALE Figure 2 Chromatogramme nanohplc - ICP ID-MS d un digestat tryptique de calmoduline séléniée - L identification des peptides a été réalisée par ESI-MS/MS. 1) HVSeMTNLGEK 2) ELGTVSeMR 3) LTDEEVDESeMIR 4) EDVDGDGQVNY EEFVQVSeMSeMAK 5) SLGQNPTEAELQDSeM NEVDADGGTDFPEFLNL SeMAR -1 pg(se).s D é bit massique en séléniu m la séparation, le risque est alors de perdre la haute résolution chromatographique amené par la nano- HPLC par dispersion des analytes lors du mélange des deux flux. Cette difficulté a été techniquement résolue en réalisant ce mélange juste avant l introduction dans le nébuliseur. Les connexions représentées schématiquement dans les agrandissements de la Figure 1 sont critiques car le moindre volume mort se traduit par une zone de recirculation dans laquelle les composés séparés sur la nano-colonne peuvent se remélanger. L ajout de ce débit d appoint dont la composition reste fixe présente l avantage de tamponner la phase mobile en solvant organique juste avant nébulisation. La stabilité du plasma s en trouve améliorée. Cette interface avec débit d appoint a été utilisée pour quantifier les sélénopeptides issus d une digestion tryptique de protéines contenus dans un volume d injection de seulement 11 nl. Chaque pic obtenu après séparation sur la nano-colonne phase inverse correspond à un peptide contenant au moins un atome de sélénium. Afin de les quantifier, il suffit d ajouter un isotope stable du sélénium ( 76 Se) dans le débit d appoint. La théorie de la dilution isotopique non spécifique démontre qu il est alors possible de déterminer la masse de sélénium contenue dans un pic chromatographique en mesurant les variations du ratio isotopique entre l isotope majoritaire ( 80 Se) et celui contenu dans le débit d appoint. L intensité obtenue par ICP-MS pour les deux isotopes est transformée en un débit massique de sélénium par unité de temps, dont l intégration des pics donne directement la masse de sélénium qu ils contiennent (figure 2). Cette expérience permet par ailleurs d estimer le rendement de digestion de la trypsine car les deux derniers pics présentés sur la Figure 2 correspondent à la protéine non digérée ainsi qu aux fragments partiellement digérés (7). L identification des sélénopeptides est réalisée dans un deuxième temps en utilisant le même système séparatif, mais avec une détection par ESI-MS/MS Temps (min) l'échantillon en masse de 76% du Se grâce à l interface nanospray. Cette technique permet au sens le plus large de quantifier des composés inconnus (ou sans standards disponibles) à condition qu ils contiennent un hétéroatome possédant au moins deux isotopes. Cependant, ce couplage reste relativement complexe à mettre en œuvre et il nécessite l utilisation de deux pompes HPLC indépendantes. III- Couplage nanohplc-icp-ms direct Figure 3 Nébuliseur de nano-débits développé pour réaliser le couplage direct nanohplc - ICP-MS. A) Vue schématique avec agrandissements : (1) Extrémité de sortie de la nano-colonne (capillaire en silice fondue de diamètre externe 280 μm et interne 20 μm.); (2) Connexion sans volume mort entre la nano-colonne et l aiguille de nébulisation (diamètre 300μm - longueur 600μm); (3) Aiguille creuse en silice fondue (4) Orifice en saphir industriel. B) Photographie de l interface complète (Nanonébuliseur et chambre de nébulisation) C) Photographie de l orifice du Nanonébuliseur. Le Nanonébuliseur nds200 récemment développé au laboratoire et présenté Figure 3 permet de nébuliser de façon stable et continue des débits compris entre 50 et 450 nl.min -1 (8). Il devient alors possible d introduire sans dilution des volumes inférieurs à la dizaine de nl, par la technique dite d injection dans le flux continu (flow injection) et surtout l effluent chromatographique provenant d une nanohplc dans un ICP-MS. Le Nanonébuliseur fonctionne aussi pour des débits supérieurs, la limite étant néanmoins atteinte pour un débit de quelques microlitres par minute. Ce nébuliseur est dit de type microconcentrique, c est-à-dire que l effluent liquide est introduit au centre du flux d argon. C est par ailleurs un nébuliseur «à consommation totale» dans le sens où 40 SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre 2006
4 Technique instrumentale Couplage parallèle de la nanohplc à l ICP-MS et à l ESI-MS. Bénéfices de cette approche pour l analyse de biomolécules A B Cartouchedepréconcentration C18 PepMap m D.I x 5 mm Nano-colonne C18 PepMap m D.I. x 150 mm Figure 4 Dispositif instrumental utilisé en protéomique hétéroatomique représentant les couplages nanohplc avec étape de préconcentration intégrée suivie des détections parallèles par ICP-MS et electrospray MS/MS. Pompe nanodébits Pompe seringue Port d injection Nanonébuliseur Torche ICP Aiguille nanospray la totalité de l aérosol est introduite dans le plasma après expansion et vaporisation dans une chambre de nébulisation à volume réduit (3cm 3 ). L aiguille de nébulisation est en silice fondue et ses dimensions sont les suivantes : diamètre externe 150 μm, diamètre interne 20 μm, diamètre de l orifice 10 μm. Cette aiguille est du même type que celle utilisée en nanospray. Les derniers millimètres de l aiguille sont dépourvus du revêtement protecteur en polyamide généralement utilisé pour protéger la silice. Les agrandissements montrent la connexion sans volume mort entre le capillaire de sortie de nano-colonne et l aiguille de nébulisation ainsi que l orifice en saphir industriel mesurant 254 μm de diamètre à travers lequel l aiguille de nébulisation est introduit. L aiguille doit être positionnée au centre du flux d Argon et sa position au travers de l orifice peut être optimisée afin d obtenir un spray stable. IV - Couplage parallèle nanohplc avec détection élémentaire par ICP- MS et moléculaire par ESI-MS/MS La Figure 4 représente le montage expérimental utilisé lors des couplages parallèles nanohplc - ICP-MS et nanohplc - ESI-MS/MS. Ce montage est constitué d une nano-pompe HPLC capable de délivrer un gradient eau-acétonitrile avec un débit stable de 300 nl.min -1 utilisé pour la nano-colonne HPLC phase inverse (C18 PepMap100, 75 μm diamètre interne x 150 mm, 3 μm, 100 Angströms). L échantillon est introduit par l intermédiaire d une vanne six voies enfermant un volume de 1 μl. Les analytes d intérêt de l échantillon sont ensuite préconcentrés sur une cartouche (C18 PepMap μm diamètre interne x 5 mm, 5 μm, 100 Angströms) à l aide d une pompe seringue. Le capillaire de sortie de la nano-colonne est alors connecté dans un premier temps au Nanonébuliseur puis à l aiguille nanospray. Pour l exemple d application décrit ci-dessous, l ICP-MS utilisé pour détecter le sélénium est équipé d une cellule de collision (Agilent 7500ce) et un spectromètre de masse moléculaire de type Q-TOF MS (QS- TAR, Applied Biosystems/MDS SCIEX) équipé d une source d ionisation nanospray a été utilisé. L étude des protéines séléniées exprimées par les levures lorsqu elles sont cultivées sur un milieu enrichi en sélénium inorganique constitue un exemple d application dont les résultats sont présentés sur la Figure 5. Après extraction aqueuse de ces levures séléniées, une étape de purification par exclusion stérique suivie d une digestion tryptique des fractions collectées ont été réalisées (9). L analyse du digestat par nanohplc - ICP-MS (figure 5a) montre la présence de plusieurs peptides contenant du sélénium, indique leur temps de rétention et permet de connaître leur quantité. Il est à noter que la limite de détection est de l ordre de 50 fg de sélénium et que cette dernière est indépendante des composés de la matrice co-éluants avec les analytes d intérêt. En cherchant le massif isotopique typique du sélénium dans les spectres SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre
5 TECHNIQUE INSTRUMENTALE Figure 5 a) Chromatogramme nanohplc - ICP-MS d un digestat tryptique de protéines séléniées collectées après exclusion stérique d un extrait aqueux de levures séléniées ; b) Courant d ionisation total nanohplc - ESI-MS obtenu lors de l analyse du même échantillon avec en encart le spectre de masse enregistré à t=11,2 min dans lequel apparaît un massif isotopique sélénié ; c,d,e) Chromatogrammes reconstruits des ions séléniées les plus abondants détectés lors de l acquisition nanohplc - ESI-MS. Les encarts rendent compte du massif isotopique typique des composés séléniés marqués d un astérisque. Les séquences peptidiques de ces sélénopeptides sont reportées dans le tableau I. 42 SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre 2006
6 Technique instrumentale Couplage parallèle de la nanohplc à l ICP-MS et à l ESI-MS. Bénéfices de cette approche pour l analyse de biomolécules Pic n Séquence peptidique TYENSeMK SNMSeMNK SNSeMMNK SNSeMSeMNK 1SeM (ERDDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 2SeM (ERDDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 3SeM (ERDDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 4SeM (ERDDMNMDMGMGHDQSEGGMK) ERDDSeMNSeMDSeMGSeMGHDQSEGGSeMK 1SeM (DDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 2SeM (DDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 3SeM (DDMNMDMGMGHDQSEGGMK) 4SeM (DDMNMDMGMGHDQSEGGMK) DDSeMNSeMDSeMGSeMGHDQSEGGSeMK Masse (M+H) + théorique/ expérimental / / / / / / / / / / / / / / M, ppm 3 DYSeMGAAK / HSP12 4 T HQQENLQSSeMR / YMZ Protéine SIP18 Tableau I Identification des sélénopeptides de la figure 4 et des protéines desquelles ils sont issus après digestion tryptique. de masse acquis par electrospray (figure 5b) aux temps de rétention indiqués par ICP, il est possible de connaître la masse molaire du peptide sélénié. L absence de massifs séléniés prouve que ces composés n arrivent pas suffisamment purifiés à la source electrospray et qu au moins une étape de purification supplémentaire est requise. Lorsqu un tel massif est retrouvé il est possible de reconstruire un chromatogramme représentant l élution de ce composé de la colonne comme montré dans les Figures 5c,d,e pour tous les composés séléniés détectés par ICP-MS. L identification est ensuite complétée par spectrométrie de masse en tandem et les protéines sont identifiées après interrogation de banques de données protéiques. Le Tableau I résume les résultats obtenus dans cette étude et l identification de protéines séléniées utilisées dans la fabrication de compléments. et qu une étape de purification supplémentaire est alors nécessaire. Les domaines d applications de cette approche et de ces outils analytiques englobent la protéomique à marqueurs hétéroatomiques ainsi que la métallo-métabolomique. La détection par ICP-MS du soufre présent dans presque toutes les protéines en raison de la présence dans celles-ci des acides aminés méthionine et cystéine permettra d étendre cette technique à la protéomique en général. V Perspectives et conclusion Ce nouveau nébuliseur de nanodébits permet d effectuer un couplage direct et robuste entre la NanoHPLC et l ICP-MS. L ICP-MS étant un détecteur massique, il permet d obtenir des données quantitatives sur les composés d intérêt. Ce mode de détection élémentaire très sensible et indépendant de la pureté relative des analytes dans l échantillon permet en outre de les suivre au cours des étapes d extraction et de purification sur des échantillons de très faible volume. La détection par ICP-MS indique les temps de rétention auxquels un composé contenant un hétéroatome sort de la nano-colonne. Il suffit alors de chercher dans le spectre de masse enregistré lors de l acquisition electrospray un massif isotopique contenant un hétéroatome pour l identifier. L absence d un tel massif isotopique indique qu une suppression de l ionisation par electrospray des analytes a eu lieu BIBLIOGRAPHIE (1) S. NILSSON et T. LAURELL, Anal. Bioanal. Chem., 2004, 378, (2) Y. SHEN, N. TOLIC, C. MASSELON, L. PASA-TOLIC, D. G. CAMP 2nd, M. S. LIPTON, G. A. ANDERSON et R. D. SMITH, Anal. Bioanal. Chem., 2004, 378, (3) J. SZPUNAR, Analyst, 2005, 130, (4) M. WIND et W. D. LEHMANN, J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, (5) D. SCHAUMLÖFFEL et A. PRANGE, Fresenius J. Anal. Chem., 1999, 364, (6) D. SCHAUMLÖFFEL, J. RUIZ ENCINAR et R. LOBINSKI, Anal. Chem., 2003, 75, (7) P. GIUSTI, D. SCHAUMLÖFFEL, J. RUIZ ENCINAR et J. SZPUNAR, J. Anal. At. Spectrom., 2005, 20, (8) P. GIUSTI, R. LOBINSKI, J. SZPUNAR et D. SCHAUMLÖFFEL, Anal. Chem., 2006, 78, (9) P. GIUSTI, D. SCHAUMLÖFFEL, H. PREUD HOMME, J. SZPUNAR et R. LOBINSKI, J. Anal. At. Spectrom., 2006, 21, SPECTRA ANALYSE n 251 Septembre - Octobre
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