Journées Recherche & Industrie Biogaz méthanisation - 4 février session 3 SESSION 3 THÈME : LA MÉTHANISATION EN VOIE SÈCHE.

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1 Journées Recherche & Industrie Biogaz méthanisation - 4 février session 3 SESSION 3 THÈME : LA MÉTHANISATION EN VOIE SÈCHE Laura André 1

2 La méthanisation en voie sèche Méthanisation en voie sèche : Valorisation des déchets avec une teneur en MS >15% (sous-produits agricoles, fraction organique des déchets municipaux ) 2

3 La méthanisation en voie sèche Méthanisation en voie sèche : Valorisation des déchets avec une teneur en MS >15% (sous-produits agricoles, fraction organique des déchets municipaux ) Origine Isman et Ducellier (1939) ont développé le concept de petites unités de méthanisation utilisant des sous-produits agricoles La société OWS (Organic Waste System) et le Professeur Verstraete ont développé le procédé Dranco pour le traitement des déchets municipaux dans les années 80 2

4 La méthanisation en voie sèche Différentes Technologies Procédés type continu (pistons vertical ou horizontal) Ex : Système Dranco Ex : Système Valorga Ex : Ineval Procédés type discontinu (sacs, couloirs, silos, containers, garages) Ex : Gaec du Bois Joly Ex : Méthajade Ex : ERigène 3

5 La méthanisation en voie sèche Méthanisation en voie sèche discontinue Avantages -Faible besoin en eau -Faible besoin en énergie -Réduction des coûts d entretien et techniques -Digestat stockable en tas et épandable Inconvénients -Mécanismes mal connus -Peu de retours d expérience -Faible quantité de données 4

6 La méthanisation en voie sèche Méthanisation en voie sèche discontinue Problématiques scientifiques -Hétérogénéité des substrats -Mécanismes de tassement et de compaction au cours du procédé -Répartition de la phase liquide -Répartition des populations microbiennes Objectifs -Compréhension scientifique des phénomènes -Optimisation de la production de biogaz et de la rentabilité des installations de méthanisation en voie sèche 5

7 Présentations orales André L. (ERigène) Degueurce A. (S 2 -watt) POSTERS Blanc F. (Arkolia) Pommier S. (CRITT) Dynamique des populations méthanogènes en réacteur pilote traitant du fumier bovin en voie sèche Optimiser la méthanisation par voie sèche discontinue par la recirculation du lixiviat Le procédé ARKOMETHA, voie sèche en continu multi-étapes SOLIDIA : plateforme dédiée à l étude des procédés de digestion anaérobie par percolation en voie sèche discontinue 6

8 Journées Recherche & Industrie Biogaz méthanisation - 4 février session 3 Dynamique des populations méthanogènes en réacteur pilote traitant du fumier bovin en voie sèche L. André, M. Ndiaye, M. Durante, S. Dou, E. Lamy, O. Lespinard, A. Pauss, T. Ribeiro 1

9 Introduction Problématique ERibox Procédés en voie sèche : peu décrits dans la littérature Suivi du procédé par caractérisations physico chimiques (ph, conductivité, FOS/TAC,..) Ne reflètent pas entièrement la réalité biologique 2

10 Introduction Problématique ERibox Comment caractériser et comprendre la diversité microbienne? Comment observer l impact de facteurs sur le développement des populations microbiennes et de leur activité pour optimiser le procédé? Procédés en voie sèche : peu décrits dans la littérature Suivi du procédé par caractérisations physico chimiques (ph, conductivité, FOS/TAC,..) Ne reflètent pas entièrement la réalité biologique 2

11 Introduction Problématique Techniques classiques de microbiologie par isolement Amann et al., 1998 Seulement 1 % -10 % des bactéries cultivables Biologie moléculaire Utilisation Outils moléculaires Relation entre la concentration de méthanogènes et la production de biogaz à partir de déchets municipaux et de boues de station d épuration (Traversi et al., 2012) Par le ciblage du gène mcra, une augmentation du nombre de méthanogènes hydrogénotrophes a été démontrée lors d enrichissement en H 2 /CO 2 (Morris et al., 2013) Amann, R., Lemmer, H., Wagner, M Monitoring the community structure of wastewater treatment plants: a comparison of old and new techniques. FEMS Microbiology Ecology 25, Morris R., Schauer-Grimenez A., Bhattad U., Kearney C., Struble C.A., Zitomer D. and Maki J.S Methyl coenzyme M reductase (mcra) gene abundance correlates with activity measurement of methanogenic H2/CO2-enriched anaerobic biomass. Microbial Biotechnology. 7 : Traversi D., Villa S., Lorenzi E., Degan R. and Gilli G Application of a real-time qpcr method to measure the methanogen concentration during anaerobic digestion as an indicator of biogas production capacity. Journal of Environnemental Management. 111 :

12 Introduction Problématique Techniques classiques de microbiologie par isolement Amann et al., 1998 Seulement1 % -10 % des bactéries cultivables Biologie moléculaire Utilisation Outils moléculaires Les outils de biologie moléculaire permettent l anticipation, le diagnostic, la compréhension des interactions entre espèces, l adaptation microbienne, la gestion des dysfonctionnements (Moletta-Denat et Cresson, 2013 ; Chouari et al., 2013) Amann, R., Lemmer, H., Wagner, M Monitoring the community structure of wastewater treatment plants: a comparison of old and new techniques. FEMS Microbiology Ecology 25, Chouari R., Guermazi S., Rivière D., Pelletier E, Weissenbach J., Le Paslier D. and Sghir A. Des outils moléculaires pour l optimisation du processus de méthanisation. Les journées Industrielles de la méthanisation décembre Université de technologie de Troyes : Moletta-Denat M. and Cresson R. Nouveaux outils de microbiologie au service des procédés de dépollution. Les journées Industrielles de la méthanisation décembre Université de technologie de Troyes :

13 Introduction Problématique Mettre au point la méthodologie de qpcr (quantitative real time Polymerase Chain Reaction) sur des déchets d origine agricole Application de cette méthodologie pour caractériser, comprendre et diagnostiquer le processus de digestion anaérobie en voie sèche 5

14 Méthodologie Echantillonnage des matrices (fumier bovin, inoculum) Extraction ADN : Actions chimique, thermique, mécanique Optimisation extraction : Modulation d étapes - Choc mécanique : vitesse, nombre - Ordre d application - Prises d échantillon - Lavage à l eau distillée Contrôle PCR classiques + Electrophorèses Vérification de la qualité ADN Vérification de la réaction d amplification et de la fiabilité des amorces Qualité et quantité ADN Dosage des acides nucléiques A 260 /A 280 A 260 /A 230 6

15 Méthodologie 5 3 Sybr Green libre Dénaturation 94 C Hybridation 55 C Elongation 55 C Sybr Green incorporé et activé Mesure de la fluorescence 7

16 Méthodologie qpcr via Sybr Green 1/Choix du gène cible ADNr 16S (gène localisé dans la sous unité ribosomale des procaryotes) code ARN 16S 2/Choix des amorces : vérification spécificité in silico : base de données ARB SYLVA 5 3 Sybr Green libre Dénaturation 94 C Hybridation 55 C 3/ Echantillons de référence 4/ Vérification spécificité amorces/echantillons de référence 5/Courbes standard de référence Sybr Green incorporé et activé Elongation 55 C Mesure de la fluorescence 7

17 Méthodologie Archeae Euryarcheota Methanobacteria Echantillons de Référence Methanobacteriales 1 Methanobacterium bryantii (DSM 863) 2 Methanobrevibacter arboriphilicus (DSM 1536) Methanomicrobiales Methanococcales Methanosarcinales 1 Methanomicrobium mobile (DSM 1539) 2 Methanoculleus bourgense (DSM 3045) 1 Methanococcus jannaschii (DSM 2661) 2 Methanococcus voltae (DSM 1537) Methanosaetaceae 1 Methanosaeta concilii (DSM 2139) 2 Methanosaeta thermophila (DSM6194) Hydrogénotrophes Methanosarcinaceae 1 Methanosarcina acetivorans (DSM 2834) (DSM 2139) 2 Methanosarcina barkeri (DSM 800) 3 Methanosarcina mazei (DSM 3647) Acétotrophes 8

18 Méthodologie Courbes de référence 10^(-0,340 Ct + 13,877) Nombre de copies / µl d ADN Nombre de copies / g d échantillon 9

19 Flux de biogaz (NmL/h) Méthodologie Digestion anaérobie en réacteur 60L Recirculation de la phase liquide Fumier bovin Production de gaz (AMPTS, Bioprocess control) Composition gaz (Multitect 540, Sewerin) 0 Temps (jours) 30 Prélèvement de la phase liquide dans la boucle de recirculation Prélèvement de la phase solide 10

20 Flux de biogaz (NmL/h) Résultats Allure du flux de production de biogaz : - Singulière par la présence de deux pics - Non expliquée - Non liée à une succession de produits de dégradation - BMP 500 ml infiniment mélangé : courbe identique 0 Temps (jours) 30 Observer une éventuelle corrélation entre la courbe typique du flux de production de biogaz en batch et la dynamique des populations méthanogènes 11

21 Log (C) Flux de biogaz (ml/h) t 1P 0 C 2P t 30 Résultats Temps (jours) t0 C 2P t30 Phase liquide Pas de corrélation observée 0 Total Methanogens MCC MMB MBT MSL 12

22 Log (C) Flux de biogaz (ml/h) Résultats t 0 1P C 2P t Temps (jours) 30 8 t P C 2P t30 Phase solide Pas de corrélation observée 0 Méthanogènes totaux MCC MMB MBT MSL 13

23 Conclusions- Perspectives Mise au point de la qpcr par Méthode SYBR GREEN sur des sous produits agricoles + : forte sensibilité, simple - : spécificité des amorces - : quantification des microorganismes morts et vivants Acquisition d une méthodologie pour le suivi du procédé en fonction de conditions de pilotage 14

24 Conclusions- Perspectives Mise au point de la qpcr par Méthode SYBR GREEN sur des sous produits agricoles + : forte sensibilité, simple - : spécificité des amorces - : quantification des microorganismes morts et vivants Acquisition d une méthodologie pour le suivi du procédé en fonction de conditions de pilotage Validation de cette méthodologie en cours par un laboratoire extérieur, ITE Narbonne Utilisation d un autre outil de biologie moléculaire : RT-PCR : transcription inverse d un ARN en un ADN complémentaire pour quantifier l activité des micro-organismes 14

25 Conclusions- Perspectives Outils de biologie moléculaire (PCR, qpcr, RT-PCR, ) Diagnostic, Prévention, Anticipation Meilleure connaissance des communautés microbiennes impliquées Gérer le procédé Eviter des dérives du procédé Optimiser le procédé et augmenter sa rentabilité 15

26 MERCI POUR VOTRE ATTENTION 16