EFFET DES POLLUANTS SUR LE POTENTIEL MICROBIEN DES SOLS :

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1 ORGANISME CONTRACTANT : I.N.R.A. LABORATOIRE : UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA-Université de Bourgogne 17 rue Sully, B.P , DIJON cedex EFFET DES POLLUANTS SUR LE POTENTIEL MICROBIEN DES SOLS : méthodes utilisables en routine pour l analyse de la taille, de la biodiversité et des activités microbiennes des sols. Responsables Scientifiques : R. Chaussod et G. Soulas SUBVENTION N du 10/08/2001 Année de remise du rapport final : 2005 Référence du Programme : GESSOL Référence de l appel à propositions : Appel à propositions Axe 1 : Qualité des sols, critères et méthodes d évaluation MINISTÈRE DE L ÉCOLOGIE ET DU DÉVELOPPEMENT DURABLE 1

2 Rapport final de contrat GESSOL Effet des polluants sur le potentiel microbien des sols : méthodes utilisables en routine pour l analyse de la taille, de la biodiversité et des activités microbiennes des sols. R. CHAUSSOD, D. CHENEBY, G. LAGUERRE, F. MARTIN-LAURENT, R. NOUAÏM, L. PHILIPPOT, L. RANJARD et G. SOULAS. Avec la participation de L. Cornet, L. Courde, A. Echairi, S. Hachair et D. Lejon UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA-Dijon / Université de Bourgogne 17 rue Sully, B.P , DIJON cedex Résumé : Pour pouvoir assurer une gestion durable des sols, il est nécessaire de disposer de méthodes d évaluation de leur qualité, notamment de leurs propriétés biologiques. Une préoccupation prioritaire concerne les effets de contaminants tels que des élémentstraces métalliques et des composés traces organiques (pesticides ou autres), liés à des pratiques agricoles. Pour pouvoir apprécier ces effets sur le fonctionnement microbien des sols dans une perspective «opérationnelle», nous avons effectué des travaux dans trois domaines complémentaires : - Développement méthodologique. Des méthodes microbiologiques quantitatives et qualitatives ont été développées en vue d une utilisation en routine pour juger de la qualité biologique des sols. Un effort particulier a porté sur les méthodes bio-moléculaires, notamment pour ce qui concerne l extraction de l ADN microbien directement à partir du sol et les mesures subséquentes : analyse de la structure des communautés (B-RISA et F-RISA), détection et quantification de gènes fonctionnels (atzc, nirk, nodc ). Les aspects liés à l échantillonnage ont également été abordés, pour s assurer d une cohérence à toutes les étapes, depuis les prélèvement de sol au champ jusqu aux mesures de laboratoire. La variabilité spatio-temporelle a été étudiée pour quelques indicateurs dans des conditions de champ. - Application à des situations de terrain. Diverses méthodes potentiellement utilisables comme indicateurs ont été appliquées à des situations de terrain représentant des situations contrastées : expérimentations agronomiques avec des traitements très contrastés en un même site, ou bien parcelles d enquête ou sols plus ou moins contaminés d une même région mais intégrant d autres source de variation. Ceci a permis de mettre en évidence l intérêt et les limites des méthodes disponibles. Les méthodes bio-moléculaires peuvent très utilement compléter les mesures quantitatives globales (type biomasse microbienne) en apportant des informations fines sur des populations ou des fonctions d intérêt agro-environnemental. Toutefois, l interprétation de ces données est parfois délicate. - Mise en place de référentiels d interprétation. La comparaison de traitements contrastés en un même lieu par une approche polyphasique est aujourd hui totalement opérationnelle. En revanche, la comparaison de données issues de parcelles plus ou moins éloignées, intégrant différentes sources de variation, s avère plus délicate. On peut en partie résoudre cette difficulté en mettant en place des référentiels régionaux stratifiés par type de sol et par système de culture. Un travail important d acquisition reste à accomplir en ce domaine. 2

3 Sommaire : Introduction 4 1 ère Partie : Méthodologie. 6 A) Microbiologie quantitative classique 6 1. Echantillonnage 6 2. Variabilité spatio-temporelle 8 B) Méthodes bio-moléculaires Optimisation du protocole d extraction d ADN du sol Taille minimum d un échantillon de sol pour analyse biomoléculaire Mesures quantitatives et qualitatives de gènes fonctionnels 14 2 ème Partie : Applications (études de cas) 15 1) Expérimentation viticole : variabilité spatiale et réponse des indicateurs. 15 2) Expérimentation de contamination mono-métallique (site «cuivre») 17 3) Etude des sols d une zone polluée ème partie : Référentiels 23 1) Référentiel sols viticoles de Champagne 23 2) Référentiel sols viticoles du Beaujolais 25 Conclusion perspectives 27 Page Annexes : 30 - liste des publications 30 - article 1 - article 2 - article 3 3

4 - Introduction : La gestion des ressources biologiques des sols est un élément essentiel de la durabilité des écosystèmes agricoles. Il est en particulier nécessaire de s assurer d une permanence fonctionnelle dans un environnement changeant et de sauvegarder une capacité d évolution permettant une adaptation à des pratiques agricoles en évolution (Holling, 1973 ; Robert et al., 2003). Des pollutions par accumulation d éléments-traces minéraux ou de composés traces organiques (pesticides ou autres) sont susceptibles d altérer ces fonctions. Au plan pratique, pour assurer la gestion des ressources biologiques, il est indispensable de disposer d indicateurs microbiologiques permettant d évaluer les effets des polluants (et de toute action anthropique en général) sur l abondance, la diversité et l activité des microorganismes des sols. Ces indicateurs doivent être pertinents, fiables et interprétables (Chaussod, 2002). Au plan de l écologie microbienne, divers aspects doivent être pris en compte (Eijsackers, 2001) : - la variabilité spatio-temporelle, - la diversité génotypique et phénotypique, du gène au niveau de l écosystème, - l adaptation microbienne aux changements environnementaux, y compris les effets d actions anthropiques. Au plan méthodologique, les conditions de mise en œuvre des mesures biologiques doivent être précisées au moins à un niveau «pré-normatif» si l on envisage une utilisation en routine. C est dans ce cadre que s est située notre contribution au programme GESSOL. Cette contribution a consisté en travaux d ordre méthodologique et d écologie microbienne appliquée à la notion de Qualité des Sols. Les recherches ont été résolument orientées vers «l opérationnel», depuis les mises au point méthodologiques jusqu aux utilisations pour suivre les impacts d origine anthropique tels que les effets de pratiques culturales, l utilisation de pesticides, la contamination par les éléments-traces métalliques ou les composés traces organiques. Les travaux ont porté sur trois points complémentaires : - Fiabilisation méthodologique. Il s agit de définir un ensemble de paramètres biologiques pertinents et de les fiabiliser en précisant leurs conditions d utilisation. C est le cas en particulier pour des méthodes moléculaires. - Application à des études de cas. Les paramètres retenus précédemment sont appliqués à des situations de terrain et à des dispositifs expérimentaux recevant des micropolluants organiques (pesticides) ou minéraux (éléments traces métalliques). Cette étape permet d en comparer les propriétés de sensibilité, de reproductibilité et de facilité de mise en œuvre. - Etablissement de référentiels. L interprétation des données biologiques doit pouvoir tenir compte des sources de variation : type de sol, système de culture, pratiques culturales (apport de matières organiques, de pesticides ou contaminants divers). 4

5 Les points évoqués ci-dessus ont été étudiés en s appuyant sur divers dispositifs : - des expérimentations agronomiques, avec des contaminations connues et maîtrisées, toutes choses étant égales par ailleurs. Ex : dispositif «Boues Ambarès» à Bordeaux. - des situations de terrain correspondant à des niveaux de contamination variables mais essentiellemenent mono-métallique (cuivre). Ex : parcelles viticoles en Bourgogne, en Champagne, en Beaujolais, etc. - des situations de terrain correspondant à des niveaux de contamination variables et polymétalliques. Ex : zone d épandage des eaux usées de la ville de Paris, à Pierrelaye. 5

6 1 ère partie : méthodologie A) Microbiologie quantitative classique Utilisation de méthodes biologiques classiques en routine. Des méthodes potentiellement utilisables en tant qu indicateur biologique ont été testées. Il s agit de méthodes validées ou en cours de développement. La Biomasse Microbienne, mesurée par la technique de fumigation-incubation a été retenue comme paramètre de base. Des mesures d activités globales (minéralisation de C et N) ou particulières (nitrification, dénitrification, dégradation de pesticides) ont été effectuées au cas par cas, sous une forme standardisée à partir de protocoles existants. Dans un objectif d utilisation en routine pour une utilisation appliquée à des préoccupations agro-environnementales, les travaux ont tout d abord porté sur l évaluation de la variabilité spatiale et spatio-temporelle, en vue de définir des stratégies d échantillonnage applicables à des parcelles expérimentales ou à des sites plus ou moins contaminés (voir aussi 2 ème partie de ce rapport), ainsi qu à l alimentation de référentiels d interprétation à partir de parcelles d enquête (voir 3 ème partie de ce rapport). 1 Echantillonnage L une des plus importantes difficultés liées à l utilisation des indicateurs biologiques est leur variabilité spatio-temporelle. La variabilité spatiale a été bien étudiée pour les caractéristiques «permanentes» des sols (propriétés physicochimiques, incluant le carbone organique total) ; elle est moins bien connue pour les caractéristiques biologiques (Parkin, 1993). La variabilité saisonnière a été également peu étudiée. Nos travaux ont porté sur 2 points : Prélèvement d un échantillon «représentatif» d une parcelle, au champ. Une stratégie d échantillonnage a été établie à partir de l évaluation de la variabilité spatiale au champ, d une part dans un contexte de grandes cultures (sol à plat, travaillé), d autre part dans un contexte viticole (sol en pente, non travaillé). Des travaux dans ce domaine ont été aussi menés en collaboration sur des sites relevant d autres projets du programme GESSOL. Il s agit en particulier du projet «Impact des pratiques agricoles et sylvicoles sur les variabilités spatiales et temporelles des constituants organiques du sol et de la biomasse microbienne ; aspects méthodologiques de la surveillance, identification de compartiments fonctionnels, modélisation et généralisation spatiale» (responsable D. Arrouays) et du projet «Impact de la récolte et de la régénération des peuplements sur la fertilité des sols forestiers» (responsable J. Ranger). La variabilité spatiale de la biomasse microbienne et d activités globales ont été comparées à la variabilité spatiale des 6

7 paramètres classiques de l analyse de sol (comme la teneur en matière organique totale par exemple). En parcelles de grandes cultures, pour une surface échantillonnée de l ordre de m2, avec 50 échantillons élémentaires, les valeurs des coefficients de variation sont les suivantes : Paramètre unité amplitude Moyenne Coeff. Variation Carbone organique total g C/kg 9,90 17,40 13,8 11,2 % Azote Kjeldahl g N/kg 1,25-1,90 1,60 8,2 % Teneur en eau % 14,1 19,0 16,7 6,2 % Extractible microbien mg C/kg 57,7 143,6 94,9 21,4 % N minéral mg N/kg 5,2 17,6 9,25 24,0 % N minéralisable mg N/kg 8,7 22,7 15,3 18,5 % Tableau 1 : coefficients de variation de différents paramètres physico-chimiques et biologiques dans une parcelle cultivée. L extractible microbien (E.C.) est le supplément de carbone extrait dans un échantillon de sol fumigé par rapport au même sol non fumigé (E.C. = Cf Ct). Le coefficient de variation sur ce paramètre est du même ordre de grandeur que d autres paramètres d intérêt agronomique. Il est un peu plus important que le C.V. sur C total ou N total car il est fonction de ces paramètres ainsi que d autres, dont la texture et la structure du sol, les fractions labiles de la matière organique (résidus de récolte, etc.). A noter que la variance analytique sur la mesure de biomasse microbienne est suffisamment faible (C.V. de l ordre de 2 %) pour permettre d analyser d autres sources de variation. A partir de ces mesures, on peut proposer que la stratégie d échantillonnage pour déterminer des paramètres biologiques dans une parcelle de surface inférieure ou égale à l hectare soit comparable à celle utilisée pour des prélèvements d échantillons en vue de l analyse de terre classique : Le protocole standard, basé sur un prélèvement de 12 à 16 échantillons élémentaires de sol sur une surface comprise entre 100 et m 2 permet d obtenir un échantillon moyen de quelques kilogrammes de terre, «représentatif» de la parcelle et sur lequel pourront être déterminées diverses grandeurs biologiques, comme la biomasse microbienne et ses activités. Lorsque la surface à échantillonner est plus grande (1.000 à m2), il est conseillé de prélever un minimum de 20 échantillons élémentaires. Au delà, nous recommandons de partager la surface à étudier en plusieurs zones a priori homogènes, qui donneront lieu chacune à un prélèvement moyen. 7

8 L échantillon de terre est rapporté au laboratoire, tamisé à 5-6 mm à l état frais et conservé à 4 C jusqu à utilisation. Le tamisage assure une homogénéisation de l échantillon de sol et permet des prises d essai «représentatives» pour les mesures biologiques quantitatives classiques. Les mesures de biomasse microbienne et d activités globales (minéralisation du carbone et de l azote) portent sur des échantillons de 20 à 40 grammes de sol, à raison de 3 ou 4 répétitions analytiques par mesure. Nous avons étudié des tailles d échantillon de 0,5g, 1g, 2g, 5g, 10g, 20g et 40g. Sous réserve d adapter le protocole expérimental, on obtient des résultats comparables (pour les valeurs moyennes) quelle que soit la taille de l échantillon, mais l incertitude associée (écart-type) augmente rapidement lorsque la prise d échantillon descend en dessous de 10 g. Les mesures de nitrification, dénitrification, dégradation de pesticides (etc.) portent sur des échantillons de 10 à 20 g de sol, avec 3 ou 4 répétitions analytiques. De même, des populations particulières (Rhizobiacées, champignons endomycorhiziens) sont déterminées sur des échantillons unitaires de 10 g de sol, avec 3 répétitions analytiques par traitement. Ces procédures assurent des résultats fiables, avec une variance analytique suffisamment faible (typiquement de l ordre de + 5% et toujours < 10 %), permettant de mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre traitements. 2. Variabilité spatio-temporelle. Des échantillons de sols ont été prélevés à différentes dates dans des parcelles de dispositifs expérimentaux de terrain. Il s agit des dispositifs d Epoisses et d Auvillars, formés de 3 traitements répétés 4 fois (4 blocs). La variabilité spatiale liée à l effet blocs et la variabilité temporelle (prélèvements à T0 puis après 1, 2, 4 et 12 mois) a été mesurée et rapprochée de la variabilité des paramètres physico-chimiques (dont l humidité du sol lors du prélèvement). Sous réserve d une humidité suffisante des sols (pas de stress hydrique), la biomasse microbienne s avère relativement stable. A titre d exemple, on donne dans le tableau 2 page suivante les résultats obtenus sur le site d Epoisses ; des résultats comparables ont été obtenus sur le site d Auvillars. Ce dispositif expérimental comprend 4 blocs (notés I à IV dans le tableau). Les valeurs du carbone extractible microbien (E.C.) sont données en mg C/kg de sol ; les chiffres correspondent à la moyenne + écart-type pour 3 répétitions analytiques. Pour chaque échantillon et chaque date, on donne également la teneur en eau pondérale (en %). Si l on se situe dans la perspective d une étude in situ des effets de traitements, il faut prendre en considération à la fois la variabilité spatiale et la variabilité temporelle. Cette dernière est liée aux variations des conditions pédoclimatiques, d origine naturelle ou anthropique. L ordre de grandeur du coefficient de variation (10 à 20 %), tel qu il apparaît dans le tableau 2 ci-dessous, donne une indication intéressante sur les différences qui peuvent être mises en évidence entre traitements 8

9 selon une approche classique (analyse de variance). Dans le cas de l étude des effets d une contamination, on peut également analyser les différences entre «témoin» et «traité», bloc par bloc (témoins adjacents). Paramètre To (05/01) T1 (06/01) T2 (07/01) T4 (09/01) T12 (05/02) E.C. Bloc I % H 2 O 25,2 20,4 21,6 20,1 20,4 E.C. Bloc II % H 2 O 25,4 20,7 20,8 21,0 19,0 E.C. Bloc III % H 2 O 25,3 20,0 21,3 19,0 19,3 E.C. Bloc IV % H 2 O 25,3 20,6 22,1 19,8 19,3 E.C. moyen Coeff. Variation 12 % 10 % 10 % 10 % 22 % Tableau 2 : variations spatio-temporelles de la biomasse microbienne (Extractible Microbien en mg C / kg, moyenne + écart-type) dans un dispositif agronomique. 9

10 B) Méthodes bio-moléculaires Les méthodes biomoléculaires sont basées sur l extraction de l ADN microbien à partir du sol, puis l utilisation de cet ADN pour apprécier divers aspects des populations microbiennes et de leurs potentialités. Ceci recouvre d une part des déterminations quantitatives ou qualitative liées aux fonctions agro-environnementales des sols (détection, quantification et recherche du polymorphisme de gènes de fonction), d autre part la description de la structure des communautés bactériennes ou fongiques par des méthodes plus globales telles que l ARISA ou la T-RFLP. Ces dernières méthodes sont appelées «empreintes moléculaires» (DNA fingerprints). La technique privilégiée ici a été l ARISA (automatic ribosomal intergenic spacer analysis). Elle consiste à analyser le polymorphisme de longueur de l espace intergénique de l ADNr 16S-23S chez les bactéries (B-ARISA) et 18S-26S chez les champignons (F-ARISA). Par ailleurs, une caractéristique de ces méthodes est qu elles sont adaptées à l utilisation de très faibles quantités d ADN. Ce qui peut être un avantage au plan microbiologique pur (en microbiologie médicale par exemple) peut s avérer un inconvénient en microbiologie des sols, en raison de l hétérogénéité du milieu sol qui nécessite de travailler sur des échantillons de taille suffisante pour qu ils soient aussi «représentatifs» que possible. Ceci est particulièrement important pour des applications agro-environnementales des méthodes biomoléculaires ; cet aspect d échantillonnage a donc donné lieu à une étude spécifique. L ensemble des travaux effectués dans le domaine biomoléculaire est présenté ci-dessous. Les publications issues de ces travaux sont données in extenso en annexe, en raison de leur importance pour ce compte-rendu d activité. 1) Optimisation du protocole d extraction de l ADN du sol. Un protocole d extraction directe de l ADN du sol a été développé au laboratoire (Martin-Laurent et al. 2001). Il permet d extraire de l ADN (0,2<[ADN]<1.0 µg ADN par gramme de sol) en quantité et d une qualité suffisante pour être amplifié par réaction de polymérisation en chaîne. Tableau 3 : rendement d extraction de l ADN des sols de Dijon, Couhins et Epoisses avec deux kits commerciaux (MoBio et Bio 101) et avec une méthode développée au laboratoire. 10

11 Cette méthode a été comparée à deux kits commerciaux (MoBio et Bio 101). L analyse des rendements d extraction d ADN de trois sols agricoles différents montre que la méthode développée au laboratoire présente le meilleur rendement (Tableau 3). La différence est particulièrement marquée dans les sols argileux (Dijon et Epoisses) où notre méthode extrait deux fois plus d ADN que les kits commerciaux. Notons aussi que les quantités d ADN extraites par notre méthode sont globalement en accord avec le niveau de la biomasse microbienne des 3 sols étudiés, ce qui n est pas le cas pour le kit MoBio par exemple. De plus, l analyse des empreintes génétiques RISA permettant l analyse du polymorphisme de longueur de l intergène 16S-23S de l opéron ribosomique bactérien, obtenues pour les différents sols étudiés, montre que les empreintes générées dépendent de la technique d extraction d ADN utilisée (Figure 1). Figure 1 : Empreintes RISA obtenues pour le sol de Couhins extrait par la méthode développée au laboratoire (pistes 1 à 3), le kit Bio 101 (pistes 4 à 7), et le kit MoBio (pistes 8 à 9). (issu de Martin- Laurent et al. 2001) Cette observation révèle que la technique d extraction ADN utilisée influence dans une certaine mesure l empreinte génétique générée. On montre ainsi que l analyse moléculaire permettant d estimer la structure génétique des communautés microbiennes telluriques est fonction de la méthode d extraction d ADN utilisée. L importance de ce «biais» méthodologique doit être souligné : il convient d apporter la plus grande attention à l étape initiale d extraction d ADN, car les résultats ultérieurs en dépendent. L enjeu est non seulement d extraire une quantité d ADN aussi grande que possible, mais aussi (et surtout) que cet ADN soit aussi représentatif que possible de l ADN des microorganismes vivants présents dans le sol. En outre, cet ADN doit être d une qualité suffisante pour donner lieu à amplification (qualité «PCR-isable»). Pour cela, l ADN doit être le moins possible altéré (pas cassé en fragments trop courts) et le moins possible contaminé par des produits organiques (acides fulviques et humiques par exemple) qui pourraient inhiber les enzymes de type taq-polymérase impliquées dans l amplification. 11

12 PC2 15.2% La méthode mise au point dans notre laboratoire (Martin-Laurent et al. 2001) a permis d analyser les empreintes génétiques RISA obtenues pour des échantillons de sol prélevés dans l essais «boues Ambarès» de Couhins, près de Bordeaux. Il s agit d une monoculture de maïs amendée depuis 20 ans avec différents type de matières organiques (boues résiduaires, fumier) par comparaison à un traitement recevant une fertilisation minérales. I U FM SS10 SS100 II SS FM SS100 PC1 45.3% U Figure 2. (I) Empreintes RISA obtenues à partir de sol prélevés sur une parcelle contrôle (U), sur une parcelle amendée avec du fumier (10t/ha/an), avec des boues de station d épuration à 10 t/ha/an (SS10) ou à 100t/ha/2 ans. (II) Analyse en composantes principales des empreintes RISA. Les résultats montrent que les pratiques culturales appliquées sur ce dispositif expérimental ont conduit à une modification de la structure génétique des communautés microbiennes (Figure 2). La structure des communautés microbiennes des sols amendés avec les boues de station d épuration est significativement différente de celles des parcelles témoin (fertilisation minérale) et des parcelles amendées par du fumier. La même analyse conduite avec l ADN extrait à l aide des kits commerciaux montre que les biais introduits par la méthode d extraction utilisée conduisent à estomper les différences dans la structure des communautés microbiennes, par comparaison avec la méthode d extraction développée dans notre laboratoire. Cette étude démontre que la méthode d extraction utilisée pour extraire directement les acides nucléiques du sol introduit aussi bien des biais quantitatifs que qualitatifs. On trouvera en annexe 1 l article complet dans lequel sont rapportés les résultats résumés ici. A l issue de notre étude, nous avons conclu que les microbiologistes gagneraient à utiliser une méthode standardisée d extraction et d analyse de l ADN du sol. Ainsi en 12

13 septembre 2004, nous avons proposé à l AFNOR (Association Française pour la Normalisation) de normaliser la technique d extraction de l ADN du sol. Cette proposition a été retenue par l AFNOR qui a poussé cette norme au niveau de l ISO (International Standardization Organization). F Martin-Laurent a été nommé expert français au sein de l AFNOR, chargé de présenter cette norme à l ISO. 2) Echantillonnage : définition de la taille minimum d un échantillon de sol pour analyses bio-moléculaires sur ADN extrait du sol. Selon notre protocole standard, l échantillon de terre provenant du champ est tamisé à l état frais à 5 mm pour homogénéisation. Le sol tamisé est conservé à 4 C pour analyses biologiques. L expérience a montré que pour des mesures biologiques quantitatives des échantillons de 10 à 40 g de sol donnaient des résultats satisfaisants. Or, pour ce qui concerne les méthodes biomoléculaires, la taille des échantillons de sol à traiter est beaucoup plus faible : de l ordre de 100 mg de sol pour les kits commerciaux tels que ceux étudiés ci-dessus soit 100 fois moins que pour les méthodes classiques, ce qui pose le problème de la représentativité d un tel échantillon. Des mesures ont donc été effectuées pour rechercher la taille minimale de l échantillon qui permette un résultat fiable et reproductible au niveau de la structure des populations bactériennes d une part, fongiques d autre part. Pour cela, l ADN du sol a été extrait sur des échantillons de 0,125g, 0,25g, 0,5g, 1g, 2g et 4g. Ce protocole a été appliqué à trois types de sol différents (sableux, limoneux, argileux). Les résultats montrent un effet de la taille de l échantillon sur le taux d extraction de l ADN en sol sableux et en sol limoneux, mais pas en sol argileux. Pour les bactéries, les empreintes moléculaires appréciées par la méthode ARISA sont les mêmes quelle que soit la taille de l échantillon. En revanche, pour les champignons, une certaine variabilité apparaît lorsque la taille de l échantillon est inférieure à 1g. On en conclut que pour obtenir des résultats fiables avec cette méthode, la taille d un échantillon de sol doit être au moins de 1 gramme (Ranjard et al., 2003). Or, jusqu ici, de nombreux laboratoires travaillaient sur des prises d essai beaucoup plus faibles. On trouvera en annexe 2 l article complet dans lequel sont rapportés les résultats résumés ici. Ces résultats sont d une grande importance au niveau méthodologique : si l extraction de l ADN à partir du sol semble aisée (surtout en utilisant les «kits» du commerce), l obtention de résultats fiables impose un minimum de précautions. Le choix d un échantillon de sol de taille suffisante pour être «représentatif» est la première de ces précautions. 13

14 3) Utilisation des méthodes bio-moléculaires pour des mesures quantitatives et qualitatives liées aux fonctions agro-environnementales des sols. Bien que la caractérisation des communautés microbiennes fonctionnelles soit une étape importante, permettant d évaluer leur structure et leur diversité, elle ne présente qu un intérêt limité en absence de données quantitatives permettant de déterminer la densité de ces communautés dans l environnement. Pour ce faire, nous avons développé des techniques de quantification des communautés fonctionnelles par PCR en temps réel, afin de déterminer la quantité d une séquence nucléotidique par gramme de sol en s affranchissant des biais introduits par la culture de microorganismes (Figure 3). Log nb de copies nirk y = x R 2 = Cycle seuil 10 8 nodc 10 8 atzc y = x y = x R 2 = R 2 = Cycle seuil Cycle seuil Figure 3 Courbe de calibration de PCR quantitative représentant le log du nombre de copies de séquences cibles en fonction du cycle seuil de détection de fluoresence SYBR Green pour les gènes de fonction microbiennes nirk (dissimilation de l azote), nodc (fixation de l azote atmosphérique) et atzc (dégradation de l atrazine). Comme le montrent les graphiques ci-dessus, nous sommes désormais capables d estimer la densité des communautés microbiennes minéralisant l atrazine par quantification des gènes atzc, ainsi que la densité des communautés dénitrifiantes (nitrate reductrices) par quantification des gènes nirk. La quantification des gènes nodc est également possible (voir figure) ; toutefois, bien que cette approche ait été développée pour quantifier les rhizobia, elle s est révélée le plus souvent inopérante en raison de la trop faible densité de rhizobia rencontrée dans le sol. Au plan strictement méthodologique, les méthodes bio-moléculaires sont donc potentiellement utilisables. Néanmoins, on se heurte encore à des problèmes de seuil de détection : en dessous d un niveau minimum des populations étudiées, les quantités d ADN correspondant aux gènes-cibles sont insuffisantes pour assurer l amplification par PCR. A cet égard, les méthodes microbiologiques classiques restent souvent plus sensibles que les méthodes moléculaires. 14

15 2 ème partie : Etude de cas L application de contaminations mono-métalliques à des systèmes expérimentaux bien contrôlés (microcosmes de sol) a permis de réduire les sources de variation et de mettre en évidence les effets des traitements sur les paramètres mesurés. Un ensemble de déterminations quantitatives (biomasse microbienne, activités) et qualitatives (empreintes moléculaires) s avère potentiellement utilisable. Les méthodes retenues ci-dessus, après optimisation et adaptation aux déterminations de routine, ont été appliquées à différentes situations pour évaluer les effets de différents traitements ou contaminations, dans un environnement marqué par une variabilité spatio-temporelle naturelle. 1) Expérimentation en milieu viticole : variabilité spatiale et réponse des indicateurs. Les résultats rapportés ici proviennent d une expérimentation viticole mise en place il y a une dizaine d années en sol d arène granitique du Beaujolais. Divers traitements d entretien des sols avaient été appliqués, à raison de 5 répétitions par traitement (essai en 5 blocs). Or, il s est avéré que le dispositif expérimental présentait une grande hétérogénéité en matière de ph, et que ce paramètre influençait fortement la biomasse microbienne, indépendamment des traitements appliqués (c.f. figure 4 cidessous). 200 Nuage de points avec régression Eclaté par : Parcelle Biomasse (mgc/kg) F M T ,5 5 5,5 6 6,5 7 ph (K2SO4) Biomasse (mgc/kg).2 = -182, ,516 * ph (K2SO4); R^2 =,947 Figure 4 : relation entre ph du sol et biomasse microbienne dans un dispositif agroviticole du Beaujolais. 15

16 Figure 5a : B-RISA sur les parcelles de l essai de Dardilly : La structure des communautés bactériennes varie avec le ph des parcelles. Figure 5b : F-RISA sur les parcelles de l essai de Dardilly : La structure des communautés fongiques varie avec le ph des parcelles. En conclusion, cet essai a montré que la structure des communautés microbiennes dans un même site était très variable, et que les variations liées au ph des parcelles masquaient totalement les effets des traitements. Les analyses en composantes principales sur les résultats (non présentées ici) ne montrent pas en effet de structuration liée aux traitements. 16

17 2) Etude des effets de contamination mono-métallique. 2.1) Enquête en sols viticoles de Bourgogne A la suite d une étude préliminaire (Quantin, 1997), nous avions observé dans un échantillonnage de 36 parcelles viticoles en Bourgogne que le niveau de la biomasse microbienne était très significativement affecté par des teneurs élevées en cuivre (> mg Cu/kg). Pour aller plus loin dans l analyse des effets biologiques, les approches bio-moléculaires de type «empreintes génétiques» sont de peu d utilité, en raison des multiples sources de variation qui peuvent les affecter, comme cela a été montré au point précédent. Nous avons toutefois cherché à mettre en évidence les effets du cuivre sur les populations de Rhizobium capables de noduler le trèfle souterrain (thèse de S. Hachair). Mais comme les niveaux de ces populations sont très bas, nous n avons pu utiliser la méthode d extraction directe de l ADN ; nous avons donc choisi la méthode classique de piégeage par la plante-hôte, pour déterminer l abondance et la diversité des populations concernées. Les résultats (Hachair, 2003) ont montré une tendance à la diminution des niveaux de Rhizobium pour les teneurs en cuivre élevées. L analyse de la diversité génotypique a été abordée par le polymorphisme de taille des fragments de restriction amplifiés de la région intergénique de l ADNr 16S-23S (types ITS). Dans les sols peu contaminés, un type ITS très majoritaire se dégage, formant 73 à 98 % des isolats. Dans les sols très contaminés en revanche, ce type ITS voit sa représentation diminuer, tandis que d autres types apparaissent ou voient leur fréquence augmenter. Il s en suit que la «diversité» calculée par les indices classiques augmente avec les teneurs en cuivre croissantes (voir figure 6 ci-dessous). D iversité (IGS) des Rhizobium nodulant le trèfle souterrain dans des sols viticoles de Bourgogne (Hachair et al., 2003) 1 83% 1 86% Cu = 59mg/kg Cu = 64mg/kg 1 98% 1 73% Cu = 102mg/kg Cu = 220mg/kg 1 26% Cu = 336mg/kg 17

18 Outre la diversité au niveau de l intergène 16S-23S (types ITS), les travaux ont porté également sur le polymorphisme des gènes impliqués dans la symbiose (Hachair, 2003). Il s agit des gènes nodc (l un des gènes impliqués dans la nodulation) et des gènes nifh (l un des gènes impliqués dans la fixation d azote). Il apparaît que le typage par ITS (chromosomique) et le typage par nodc (plasmidique) ne sont pas totalement indépendants, en raison d associations préférentielles. Enfin, l efficacité des souches pour la fixation d azote a été mesurée en serre, par inoculation de plants de trèfle souterrain poussant sur support minéral (Terragreen) irrigué par une solution nutritive sans azote. Les souches isolées des parcelles plus ou moins contaminées par le cuivre ont ainsi pu être classées selon leur efficacité à fixer l azote. Cette efficience peut donc elle-même être mise en relation avec les typages ci-dessus (notamment nodc et nifh). Les souches isolées des parcelles les plus contaminées apparaissent globalement moins efficientes que celles isolées des sols peu contaminés. Au niveau méthodologique, le gène de fonction nifh s est avéré être le meilleur marqueur de l efficience à fixer l azote. En raison des «associations préférentielles» entre types ITS et types symbiotiques, ceci peut être la conséquence indirecte des effets du cuivre sur la structure des populations de Rhizobium : les différences observées au niveau du génome se traduiraient par une diminution de l efficacité de la fixation biologique de l azote par les populations concernées. Toutefois, une souche isolée de l un des sols les plus contaminés se retrouve dans le lot de tête en matière d efficacité. Les résultats de ce travail montrent que le modèle «Rhizobium / trèfle souterrain» représente un modèle de choix en tant qu indicateur biologique de l impact du cuivre dans les sols (Chaussod et al., 2003). Ce modèle permet d aborder toutes les facettes d une fonction-clé : abondance des populations concernées, diversité génotypique (structure des communautés par typage ITS), diversité des gènes fonctionnels (polymorphisme des gènes nod et nif), résistance au cuivre et autres aspects de la diversité phénotypique 2.2) Expérimentation «cuivre» Après une expérimention de faisabilité conduite en 2001, une expérimentation a été mise en place en mai 2002 pour suivre, dans les conditions de champ, les effets d apports de cuivre (sous forme de bouillie bordelaise) à deux doses. Cette expérimentation a été appliquée à deux types de sol différents : un sol limoneux à Auvillars et un sol argilo-limoneux à Epoisses. Les mêmes paramètres que ci-dessus ont été mesurés, à différents temps : avant apport, juste après apport et après des temps croissants, pour évaluer non seulement les effets immédiats mais également les possibilités de retour à l état initial (résilience). Compte tenu de la variabilité spatiotemporelle naturelle, il s avère difficile de mettre en évidence des effets significatifs. Cela signifie que les effets des traitements appliqués ont été (à une exception près) inférieurs aux variations naturelles. Dans le seul cas où un effet avait été visible, cet effet s est estompé avec le temps. Pour l une des situations expérimentales (Epoisses), les apports de cuivre ont été renouvelées une deuxième puis une troisième année sur les mêmes parcelles. Les résultats montrent une adaptation des populations microbiennes et une permanence des fonctions malgré une évolution des communautés microbiennes. La fraction des bactéries résistantes au cuivre augmente rapidement. Cette expérimentation en toujours en cours (quatrième année de traitements en 2005) et se terminera en mai

19 3) Etude des sols d une zone polluée. Des échantillons de sol ont été prélevés dans des champs ayant reçu, depuis plus d un siècle, des épandages d eaux usées (plaine de Pierrelaye-Bessancourt). L ensemble des échantillons représente un large gradient de concentration en éléments-traces métalliques. Dans ce cas particulier, la contamination par des E.T.M. correspond à des apports organiques. Une bonne corrélation est observée entre teneurs en ETM, matière organique, phosphore, etc. L incidence est nette sur les populations microbiennes : Ref ech. Ct Zn Cu B.M. BM %Ct MVA N/10g Rhizob N/g. DBZ 9, , PC18 11, , VN 0106 VN , ,63 73 < 10 24, ,62 68 < 10 PC01 33, ,38 61 < 10 VN 0101 VN 2503 VN 2508 VN 2507 VN , ,46 61 <10 44, , , ,17 80 < 10 98, ,17 72 < 10 90, , Tableau 4 : relations entre la contamination des sols et les paramètres biologiques. 19

20 Les résultats montrent que la biomasse microbienne, lorsqu elle est exprimée en pourcentage du carbone total du sol, diminue fortement dans les situations les plus contaminées (Chaussod et al., 2001) : 2,5 BM %Ct 2 1,5 1 0, Zn (mg/kg) Figure 6 : relations entre la contamination des sols et la fraction «vivante» de la matière organique (biomasse microbienne en % de C total) BM %Ct 2,5 2 1,5 1 0, Cu (mg/kg) La structure génétique des populations est aussi affectée. Les populations de Rhizobium s effondrent dans les échantillons les plus contaminés, mais il est difficile de lier cette observation à la seule teneur en ETM. Les populations de champignons endomycorhiziens semblent beaucoup moins affectées ; la baisse quantitative peut être rapprochée des fortes teneurs en phosphore des sols les plus contaminés, et la diversité morphologique des spores n est pas profondément altérée (Echairi, 2003). Enfin, au plan des activités biologiques, toutes les fonctions d intérêt agronomiques que nous avons mesurées sont toujours assurées. La dégradation de l atrazine est même particulièrement rapide, avec une demi-vie de quelques jours seulement (contre 100 jours en sol naturel). En revanche, aucune relation n a été trouvée entre la diversité des gènes de fonction et les activités exprimées (Martin-Laurent et al., 2004) : L estimation de la minéralisation de l atrazine par mesure radiorespirométrique a montré que le sol de Pierrelaye ayant reçu des eaux usées était adapté à la biodégradation accélérée de l atrazine, 70% de la molécule apportée initialement étant dégradé en moins de 10 jours alors que la demi-vie de l atrazine est comprise entre quelques semaines et quelques mois (Figure 7 ci-dessous). 20

21 Figure 4. Cinétiques de minéralisation l atrazine marquée uniformément au 14 C sur le cycle s-trizinique obtenues dans les sols faiblement pollués (LP), modérément pollués (MP) et fortement pollués (FP) de la parcelle de Pierrelaye. De manière surprenante, la quantité d atrazine minéralisée n est pas fortement modifiée par les apports d eaux usées ; toutefois, on peut noter que la vitesse de minéralisation la plus importante est obtenue pour les sols les plus faiblement pollués (Tableau 5). Tableau 5 : Paramètres issus de la modélisation des cinétiques de minéralisation de l atrazine (a, % maximale de minéralisation; k, vitesse maximale; ti, abscisse du point d inflexion). La quantification des séquences atza, B et C codant les trois premières enzymes de la voie de dégradation de l atrazine montre que 10 4 copies de ces séquences sont détectées par gramme de sol dans les trois sols de la parcelle de Pierrelaye confirmant l adaptation de ce sol (Figure 8 ci-dessous). Figure 5. Quantification du nombre de séquences atza, B et C dans les sols faiblement pollués (LP), modérément pollués (MP) et fortement pollués (FP) de la parcelle de Pierrelaye. 21

22 De plus, la quantité de séquences atza, B et C détectés dans le sol faiblement pollué est supérieure à celle observée dans les sols moyennement et fortement pollués. Ce résultat est en accord avec les données issues des mesures d activité de minéralisation de l atrazine. Toutefois, des études complémentaires menées sur d autres sites expérimentaux montrent que le potentiel génétique dégradant n est pas toujours en accord avec l activité de minéralisation de l atrazine (Martin-Laurent et al. 2004). Ce résultat révèle, par conséquent, que la seule estimation de la densité des communautés microbiennes minéralisant l atrazine ne suffit pas estimer leur activité. Les résultats complets de cette expérimentation se trouvent dans l article 3 donné en annexe. 22

23 3 ème partie : Référentiels La compilation des données quantitatives et leur classement par type de sol et par système de culture ouvre la possibilité d interpréter les résultats d une mesure particulière à la lumière d un «référentiel» adapté. Cette démarche a été entreprise pour les sols viticoles, pour lesquels de nombreuses données étaient disponibles, suite à des mesures sur des dizaines de parcelles en Bourgogne, Champagne, Beaujolais, etc. On présente ci-dessous deux exemples de référentiels. 1) Référentiel «sols viticoles champenois». En 2000 et 2001, des prélèvements de sols ont été réalisés pour établir un référentiel de la qualité biologique des sols viticoles de Champagne. La synthèse intégrant ces résultats et ceux obtenus sur les essais «Viti 2000» depuis 1990 montre que : - les caractéristiques des sols (argile, azote organique, matières organiques) ont une forte influence sur les niveaux de biomasse microbienne. Les données confirment par ailleurs l effet dépressif du cuivre sur la biomasse microbienne (voir figure). - il existe une relation positive entre la biomasse microbienne et la minéralisation du carbone et de l azote ; le cuivre ne semble pas avoir d influence négative sur ces minéralisations. - plus la proportion de la fraction labile (en relation avec la fraction vivante) est faible, plus les micro-organismes ont une respiration spécifique élevée. - plus le rapport C/N du sol est élevé, plus la proportion de carbone labile, issu de l activité du carbone vivant, est faible Le tableau suivant récapitule les données utilisées pour cette synthèse : Nombre de données Biomasse microbienne Métabolites Cinétique CO2 Respiration spécifique N minéralisable Nitrification Essais * Référentiel** Tableau 6 : Nombre de données recueillies sur les différents réseaux d essai * Essais Viti2000, données recueillies depuis 1990 ** Référentiel : étude mise en place en 2000 et 2001 sur un réseau de parcelles choisies par le CIVC (parcelles d essai hors Viti 2000, types de sols particuliers ) On remarque (figure 9 page suivante) une bonne relation entre carbone organique et biomasse microbienne. Le cuivre semble jouer un effet seuil : les échantillons de sol dont les teneurs en cuivre EDTA sont supérieures à 40 ppm, présentent des biomasses microbiennes plus faibles, pour des teneurs en carbone organique équivalentes. 23

24 Le comportement des sols de l Aube présentant des teneurs en cuivre EDTA supérieures 40 ppm est similaires à celui des sols de la Marne avec des teneurs inférieures à 40 ppm. La nature même de ces sols (nature des argiles?) pourrait peutêtre expliquer l absence d effet dépressif du cuivre EDTA à ce seuil de 40 ppm. Figure 9 : Relations entre carbone organique, cuivre et biomasse microbienne (158 échantillons). Biom asse microbienne en m g/kg C u<40ppm C u>40ppm Cu>40ppm -Aube R 2 = 0.64 R 2 = Carbone organique en p.m ille Figure 10 : Relation entre argile et biomasse microbienne (134 échantillons). Biom asse microbienne en m g/kg C u<40ppm C u>40ppm Cu>40ppm -Aube R 2 = Argile en p.m ille 24

25 Sur la figure 10 page précédente, on observe une relation entre la teneur en argile et la biomasse microbienne, notamment pour des échantillons dont les teneurs en cuivre EDTA sont inférieurs à 40 ppm. Naturellement, plus les sols sont argileux, plus la biomasse microbienne est élevée. 2) Référentiel «sols viticoles du Beaujolais» Une enquête a été menée en 2002 et 2003 dans le vignoble du Beaujolais. Des échantillons de sol ont été prélevés dans 25 parcelles, chez 24 viticulteurs différents. Cet échantillonnage a été conçu à partir de différents réseaux (ViséO, Maturation, groupes lutte raisonnée), pour donner une image de la diversité des situations rencontrées dans le vignoble, notamment au plan pédologique. La série 1 (8 parcelles) est formée de sols bruns acides superficiels issus de gneiss, schiste (diorites), granite et tufs. La série 2 (4 parcelles) est formée de sols bruns acides moyennement profonds, issus des mêmes roches-mères que précédemment. La série 3 (4 parcelles) consiste en sols colluviaux acides profonds de bas de pente, à l aval des deux premières formations. La série 4 (6 parcelles) consiste en sols limono-sablo-argileux moyennement profonds et fréquemment hydromorphes. Enfin, la série 5 (3 parcelles) rassemble les sols bruns calcaires peu profonds sur calcaire dur. A cette diversité pédologique, se superpose une diversité de situations culturales : antériorité viticole, régime des apports organiques, etc. L'effectif de chaque série de sol a été déterminé en fonction de la représentativité de chaque sol en Beaujolais. Argile > 30% Aluminium Cuivre Figure 11 : Parcelles de l enquête Beaujolais - Analyses en composantes principales. Représentation des individus dans l espace des variables 25

26 Sur ces échantillons, les principales caractéristiques physico-chimiques et biologiques ont été déterminées. Les résultats montrent une relation entre les paramètres biologiques, les caractéristiques des sols et les situations culturales. Une analyse statistique descriptive et une analyse multivariée ont été effectuées sur l ensemble des résultats. Cette étude montre que si globalement on retrouve plus ou moins regroupés les échantillons correspondant à un même type de sol, des individus peuvent se distinguer en fonction de caractéristiques particulières. Ainsi, des teneurs particulièrement élevées en aluminium échangeable ou en cuivre se traduisent par des valeurs anormalement faibles de la biomasse microbienne. Dans les sols étudiés, la biomasse microbienne varie entre 30 et 455 mg C/kg de sol. Cela représente en moyenne 1,15% du carbone organique total, avec des variations très importantes (0,3 à 2,5%) selon les situations. D après l analyse statistique des résultats, la proportion "vivante" du carbone organique (MOV en % du carbone total) et la teneur du sol en cuivre extractible à l EDTA sont largement antagonistes. 26

27 Conclusion perspectives Un ensemble cohérent de mesures biologiques complémentaires a été mis au point et validé en conditions de terrain. Ces mesures apportent des informations au moins partielles sur l abondance, l activité et la diversité des micro-organismes du sol. Pour ce qui concerne les déterminations quantitatives (biomasse microbienne, activités), il s avère que l interprétation des résultats biologiques doit impérativement tenir compte du type de sol et du système de culture. Ceci passe par l utilisation de référentiels pour interpréter des données isolées. Bien entendu, lorsque les variations ne portent que sur les traitements appliqués, toutes choses étant égales par ailleurs, une simple comparaison des données apporte des informations utilisables. Les déterminations qualitatives (empreintes moléculaires) ne sont pour l instant utilisables que pour des comparaisons directes (ex : comparaison de traitements pour une même situation pédoclimatique). Les mesures de «biodiversité» sont pour l instant de peu d utilité pratique ; elles ne sont pas directement interprétables en termes de qualité des sols (Chaussod et al., 2002), même si il est admis qu une diversité importante est le meilleur gage d une potentialité de résilience et d évolution. L importance de la plante (culture) ne doit pas êtrte négligé (Johnson et al., 2003). Plutôt que des aspects de diversité génotypique, la diversité des aptitudes métaboliques serait une piste à développer pour des applications agronomiques. Des approches globales de la «diversité» (en fait, la structure des communautés microbiennes) ont été mises au point à partir du polymorphisme de l ADN extrait directement du sol. Il s agit principalement de la technique des empreintes moléculaires (Ranjard et al., 2001, 2003) spécifiques des bactéries (B- ARISA) et des champignons (F-ARISA), après optimisation de la procédure d extraction de l ADN (Martin-Laurent et al., 2001). Il s agit d une approche de la diversité populationnelle des communautés microbiennes appréhendées globalement, en s affranchissant de l isolement des microorganismes. Cette méthode est bien adaptée à la mise en évidence des effets de polluants sur les communautés microbiennes. La même approche peut être utilisée pour évaluer la diversité fonctionnelle, en s adressant à des gènes spécifiques, tels ceux impliqués dans la dégradation de l atrazine par exemple (Martin-Laurent et al., 2001, 2004), la dénitrification (travaux de Philippot et coll.), voire des gènes symbiotiques (travaux de Laguerre et coll.). Toutefois, pour aborder les relations entre la diversité et la fonctionnalité des populations microbiennes d intérêt agro-environnemental, les approches moléculaires ne peuvent pas encore être utilisées seules. Dans bien des cas, les approches de microbiologie classique restent très utiles. C est le cas en particulier pour les rhizobiacées (Laguerre et al., 2001; Hachair, 2003) ou les champignons endomycorhiziens (Echairi, 2003). Enfin, une approche similaire a permis d étudier les relations qui peuvent exister entre activité et diversité des microorganismes impliqués dans une fonction donnée, telle que par exemple la réduction en N 2 du gaz à effet de serre N 2 O (Cheneby et al., 2001). L étude des rhizobiacées reste le plus souvent tributaire de l isolement des populations nodulantes à partir des nodosités d une plante-hôte (Laguerre et al., 2001). Pour les champignons mycorhiziens, les dénombrements par tamisage humide, 27