Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs

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1 Chapitre 10 Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs Les cytokines sont impliquées dans la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives. Il est nécessaire de bien connaître leur physiologie avant d'entreprendre leur exploration. Ce sont des protéines ou des glycoprotéines essentiellement sécrétées, mais parfois membranaires, de faible masse moléculaire. Elles peuvent être monomériques, homodimériques (e.g. IL-5, IL-8, IL-10), hétérodimériques (e.g. IL-12), voire trimériques (e.g. TNF-α). Elles peuvent présenter des degrés divers de glycosylation conduisant parfois à une grande hétérogénéité moléculaire (e.g. IL-6 qui varie de 19 à 26 kda). La phase d'expression membranaire de certaines d'entre elles (e.g. IL-1, TNF-α) leur permet d'agir par contact direct intercellulaire. Les cytokines sont parfois produites sous forme de précurseurs (e.g. IL-1, IL-18) qui ne deviennent actifs biologiquement qu'après action d'une enzyme (e.g. caspase 1). D'autres (e.g. TGF-β) subissent des étapes de maturation extracellulaire, au cours desquelles leur fixation à des molécules de la matrice extracellulaire module leur état fonctionnel ou leur catabolisme. Enfin, les cytokines sont susceptibles d'être dégradées par des protéases, en particulier lors des processus inflammatoires. Les cytokines sont capables de stimuler ou d'inhiber la prolifération ou la survie cellulaire, d'orienter la différenciation cellulaire, plus spécialement celle des lymphocytes T (fig. 10.1), ou d'activer les fonctions ou les capacités migratoires de cellules cibles. Leur périmètre d'action est très variable. La majorité d'entre elles agissent dans le micro-environnement où elles sont produites, selon un mode dit paracrine (environnement direct) ou juxtacrine (cellule adjacente à la cellule productrice). L'action d'une cytokine sur la cellule qui la produit constitue l'autocrinie qui peut même aller jusqu'à l'intracrinie, en l'absence de sécrétion de la cytokine et en cas de fixation immédiate à son récepteur. À l'opposé, certaines cytokines ont des effets de type endocrine, c'est-àdire qu'elles agissent à distance de leur lieu de production. Les concentrations circulantes de cytokines sont dans la majorité des cas extrêmement faibles (< 5 pg/ml) et leur dosage dans le sang périphérique est peu informatif sur les productions locales. La production des cytokines est en règle générale dépendante de l'activation cellulaire, soit directement en réponse à un facteur déclenchant (e.g. activation par le récepteur d'antigène ou un ligand de Toll-like receptor ou TLR), soit secondairement en réponse à une autre cytokine. Les interactions entre cytokines modulent ces réponses via des effets synergiques ou, au contraire, antagonistes. Les cytokines pro-inflammatoires (e.g. IL-1, TNF-α, IL-6, chimiokines) se distinguent des cytokines immunorégulatrices parmi lesquelles on retrouve les interleukines, les interférons, le TGFβ et les cytokines de l'hématopoïèse ou facteurs de croissance (e.g. GM-CSF, IL-3, M-CSF). Les Méthodes en immunologie 2014 Elsevier Masson SAS. Tous droits reservés

2 180 Exemples d'applications Lymphocyte T naïf CCR7 + Fig Cytokines et lymphocytes T. IL-6+ TGF STAT1 T-bet STAT6 GATA3 STAT3 RORs IL-23 Foxp3 STAT3 Bcl6 Th1 IL-1R CXCR3 Th2 IL-17Rβ Th17 IL-23R CCR6 Treg CD4 + CD25 hi Tfh CXCR5 IFN TNF IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-17(A) IL-17F IL-21 IL-22 TGF IL-21 Immunité cellulaire Inflammation Lutte contre les pathogènes intracellulaires Immunité humorale Allergie Défense antiparasitaire Auto-immunité Lutte anti-infectieuse Immunosuppression Maturation des lymphocytes B Auto-immunité Opsonisation par anticorps

3 Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 181 cytokines ont, en fait, de multiples cibles et, par conséquent, des effets pléiotropes. Les propriétés biologiques sont, par ailleurs, souvent partagées par plusieurs cytokines et cette redondance limite les risques de défaillance. Enfin, certaines cytokines présentent des homologues se comportant comme des antagonistes spécifiques (e.g. IL-1ra, IL-36ra) qui entrent en compétition avec la cytokine correspondante en se liant au même récepteur, mais sans transduire de signal d'activation. Les chimiokines sont impliquées dans les phénomènes d'adressage pour le recrutement cellulaire lors de processus inflammatoires. Elles peuvent aussi intervenir dans la différenciation cellulaire. L'action des cytokines sur leurs cellules cibles se fait par fixation à des récepteurs constitués de deux ou trois sous-unités. Dans ces complexes multimériques, la chaîne α assure la spécificité de la fixation, tandis que la chaîne β est responsable de la transmission du signal. Cette dernière est souvent partagée par plusieurs cytokines (e.g. gp130 pour les cytokines de la famille de l'il-6). Pour la famille des récepteurs de l'il-2, une chaîne γ assure la signalisation. La fixation de la cytokine permet l'assemblage des sous-unités et l'organisation optimale des domaines participant à la transduction du signal. Les chimiokines se fixent sur des récepteurs particuliers, couplés aux protéines G et possédant sept domaines transmembranaires, capables de reconnaître plusieurs chimiokines. Des récepteurs solubles des cytokines sont générés par l'action de protéases libérant la partie extramembranaire des récepteurs cellulaires ou par épissage alternatif et sécrétion directe. Ces récepteurs solubles conservent la capacité de fixer leur ligand et possèdent ainsi une action inhibitrice sur l'activité biologique des cytokines (e.g. IL-1, TNF-α). Certains récepteurs solubles restent, à l'inverse, capables de déclencher un signal d'activation avec des cytokines membranaires (e.g. IL-6). Des protéines de liaison différentes des récepteurs peuvent également se fixer spécifiquement à certaines cytokines et les neutraliser (e.g. IL-18). Enfin, il faut tenir compte de multiples homologues tant des cytokines que de leurs récepteurs, exprimés par certains virus, qui concourent à leur pathogénicité et à leur échappement à la réponse immune (e.g. IL-10, TNF-α). Méthodologie Dosages de cytokines ou de leurs récepteurs solubles Les conditions de prélèvement et de conservation des échantillons biologiques sont très importantes pour le dosage des cytokines et doivent prendre en compte ce qui peut se passer après le prélèvement. Ainsi, une surestimation de la concentration in vivo peut résulter d'une production cellulaire liée à la présence d'endotoxines ou du relargage de cytokines intracytoplasmiques. À l'inverse, la liaison de cytokines à leurs récepteurs membranaires ou leur dégradation sous l'action de protéases ou de la température peuvent conduire à une sous-estimation. Le prélèvement de sang sur tube EDTA stérile permet d'éviter la production potentielle de cytokines par les cellules sanguines grâce au pouvoir chélateur de l'edta. L'héparine, souvent contaminée par des endotoxines, est à éviter. Des inhibiteurs de protéases (trasylol) ou de l'agrégation plaquettaire (indométacine) peuvent être ajoutés dans les tubes. Le plasma doit être décanté très rapidement pour éviter toute dégradation ou adsorption des cytokines. Pour les méthodes biologiques cellulaires 9, le sérum est utilisé, mais il doit être recueilli dans des conditions assurant l'absence d'endotoxines. Il est préférable de congeler les échantillons à très basse température ( 80 C) et sous forme d'aliquotes pour éviter les cycles de congélation/décongélation si plusieurs cytokines sont dosées sur un même prélèvement. À noter que pour certaines cytokines (e.g. TGF-β), un prétraitement peut être nécessaire. Les méthodes biologiques testant la fonction d'une cytokine vis-à-vis d'une lignée cellulaire ne gardent qu'une valeur historique (e.g. prolifération de thymocytes murins mesurant l'activité IL-1), notamment eu égard à la complexité des interactions et redondances des systèmes cytokiniques. 9 Des ions divalents sont nécessaires pour ces méthodes et le pouvoir chélateur de l'edta peut interférer.

4 182 Exemples d'applications 10 Les méthodes immunologiques ont, en revanche, toute leur valeur, car il est relativement aisé de produire des anticorps de grande spécificité dirigés contre des cytokines recombinantes, permettant de distinguer des cytokines ayant une même activité biologique (e.g. IL-1α et IL-1β). Les anticorps utilisés sont le plus souvent monoclonaux. Les méthodes commerciales les plus répandues pour le dosage des cytokines dans les milieux biologiques sont des ELISA sandwich. Les techniques multiplex utilisant la fluorescence ou la chimiluminescence, en microarray ou en cytométrie en flux, sont mieux adaptées aux dosages ponctuels et permettent la mesure simultanée de plusieurs cytokines afin d'obtenir un profil cytokinique (e.g. profil pro-inflammatoire, réponse Th1/ Th2/Th17), parfois même avec un système automatisé. Ceci peut être particulièrement intéressant pour des dosages réalisés dans le surnageant de cultures cellulaires, reflétant bien les réponses induites par les conditions expérimentales. La plupart des trousses commercialisées sont adaptées au dosage des cytokines dans le plasma ou le sérum et la méthodologie doit être validée, notamment par des tests de surcharge mesurant le rendement du dosage, lors de l'utilisation d'autres liquides biologiques. Pour le liquide synovial, qui peut présenter une forte viscosité, l'ajout de hyaluronidase est parfois nécessaire pour fluidifier l'échantillon. Enfin, du fait des faibles dilutions effectuées sur les échantillons à analyser, il faut être très vigilant sur les interférences classiques des immunodosages : hémolyse, anticorps hétérophiles, facteurs rhumatoïdes. Actuellement, apparaissent sur le marché des techniques (e.g. Erenna ou Simoa ) qui améliorent la limite de détection de manière considérable (gain de deux à trois logs de concentration). La standardisation des immunodosages de cytokines n'est pas encore acquise et il existe parfois de fortes discordances entre différentes trousses commerciales. Des préparations internationales de cytokines sont disponibles auprès du National Institute for Biological Standards and Control 10. Une autre source de discordances entre les résultats est liée aux différents modes d'expression pour une même cytokine (e.g. pg/ml, UI/mL, pm). Une approche quantitative du nombre de molécules de récepteurs de cytokine exprimées par cellule peut être réalisée en utilisant des billes de calibration de fluorescence en cytométrie en flux, mais la méthode de référence reste celle de Scatchard qui utilise des anticorps radiomarqués accédant à la mesure des constantes d'affinité. Détection in situ ou au niveau cellulaire Il est possible de mettre en évidence la présence de cytokines ou de leurs récepteurs dans les tissus par des techniques d'immunohistochimie ou d'immunofluorescence directe ou amplifiée. L'utilisation de coupes à la congélation pose peu de problèmes, mais pour les tissus fixés la fixation peut altérer les molécules à détecter et nécessite de sélectionner des réactifs capables de reconnaître ces épitopes modifiés. Ces méthodes permettent d'identifier qualitativement une concentration localisée au niveau de la cellule productrice. Les méthodes d'analyse d'image peuvent donner une idée semi-quantitative de l'intensité de la réponse cytokinique. L'utilisation de comarquages, voire de microscopie confocale, permet une approche affinée. La sécrétion des cytokines par les lymphocytes peut être mise en évidence après réactivation des cellules in vitro, de façon non spécifique (e.g. mitogène) ou spécifique (e.g. antigène). La détection intracellulaire en cytométrie en flux implique de bloquer le transport et la sécrétion de la cytokine d'intérêt (e.g. brefeldine A), puis de fixer et perméabiliser les cellules pour que l'anticorps ait accès au compartiment intracellulaire. Le développement des marquages multi-couleurs permet d'analyser simultanément de nombreux paramètres immunophénotypiques et/ou la production de plusieurs cytokines par la même cellule. Il est ainsi possible de mettre en évidence des lymphocytes spécifiques de type Th1, Th2 ou Th17, mais aussi de lymphocytes dits polyfonctionnels qui produisent plusieurs cytokines (e.g. IFN-γ/ IL-2 et TNF-α). Ces derniers sont notamment associés à une meilleure protection dans diverses

5 Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 183 pathologies infectieuses (e.g. tuberculose, Sida, hépatites). La détection par ELISpot, particulièrement développée pour l'interféron γ, permet de quantifier la fréquence des cellules répondeuses et peut être plus sensible que la détection intracellulaire. Étude des ARNm Alternativement à la détection des protéines, la production de cytokines peut être étudiée au niveau des ARNm, in vitro dans des cultures cellulaires ou ex vivo sur des biopsies, en prenant les précautions nécessaires pour assurer la stabilité des ARNm. Dans les tissus, la technique d'hybridation in situ par riboprobes détecte les cellules contenant des transcrits de cytokines à l'aide de traceurs enzymatiques ou fluorescents ou dans des suspensions cellulaires en cytométrie en flux. Une analyse plus large du transcriptome par RT- PCR après extraction des ARN peut donner une image plus globale. En tout état de cause, si l'analyse des ARNm permet une détection de différences rapidement induites par un stimulus, elle doit être pondérée par le fait que les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle peuvent ensuite modifier l'expression protéique. Étude de l'adn, polymorphismes Les gènes des cytokines et de leurs récepteurs sont concernés par des variations au niveau de l'adn, qui peuvent être limitées à un nucléotide dans les SNP (Single Nucleotide Polymorphism), ou s'associer à des modifications plus importantes (e.g. délétions, insertions, substitutions), voire des variations dans le nombre de copies des gènes (Copy Number Variation ou CNV). Recommandations de mise en œuvre La demi-vie des cytokines est très courte (habituellement inférieure à une heure) et leur production pulsatile conduit à des pics fugaces dans la circulation impliquant la réalisation de prélèvements rapprochés et multiples pour suivre ces variations rapides. Ceci est surtout applicable à la recherche expérimentale. La variabilité de production des cytokines chez des sujets normaux peut être élevée. Pour un individu donné, l'effet principal est celui des rythmes circadiens liés aux variations des corticostéroïdes et de la mélatonine. Les cytokines étant des substrats pour les protéases générées lors des processus inflammatoires, certains produits de dégradation sans activité biologique peuvent être détectés en immuno-analyse. Leur action locale paracrine, voire autocrine, est un élément essentiel à considérer dans l'exploration des cytokines. Aussi, le résultat normal du dosage d'une cytokine circulante ne permet pas d'exclure un foyer d'inflammation ou de stimulation immune locale. Les cytokines se lient fréquemment à des protéines plasmatiques (e.g. IL-6 et α2-macroglobuline), mais ces liaisons de faible affinité perturbent peu les dosages. À l'inverse, les récepteurs antagonistes interfèrent dans les effets fonctionnels et les dosages biologiques des cytokines. Des anticorps très spécifiques permettent, en revanche, de distinguer les cytokines de leurs homologues. La présence de récepteurs solubles représente une cause d'interférence dans les tests biologiques et certains immunodosages si l'anticorps utilisé reconnaît un épitope de la cytokine impliqué dans sa liaison à son récepteur. Il faut sélectionner des anticorps se fixant sur des sites indépendants des interactions cytokine/récepteur pour doser toutes les formes de la cytokine. De manière générale, l'influence de nombreux inhibiteurs disparaît après dilution d'un échantillon biologique fournissant des résultats paradoxaux (e.g. effet matrice). Les principaux facteurs pouvant influencer le dosage des cytokines sont résumés dans la figure Des auto-anticorps dirigés contre des cytokines (e.g. contre le TNF-α, l'il-6, l'il-1) apparaissent avec l'âge. Leur affinité peut atteindre des valeurs comparables à celles des anticorps utilisés dans les immunodosages (e.g M). Ces auto-anticorps peuvent constituer un élément diagnostique (e.g. anti-ifn-γ dans des syndromes d'immunodéficience acquise non virale) ou expliquant la physiopathologie (e.g. anti-il-17 ou IL-22 et candidoses cutanéomuqueuses dans les polyendocrinopathies auto-immunes).

6 184 Exemples d'applications Protéines de liaison (par ex. α2-macroglobuline) Auto-anticorps (par ex. anti-tnf-α, anti-il-6) CYTOKINE Demi-vie courte Rythmes circadiens Précurseurs Cytokines membranaires Polymères Glycosylation Produits de dégradation Compartimentalisation Antagonistes (par ex. IL1-RA, IL36-RA) Récepteurs solubles Antagonistes (par ex. TNF-α, IL-1) Agonistes (par ex.il-6) Récepteurs de cytokines Fig Éléments de la physiologie des cytokines et de leurs récepteurs à prendre en compte pour la réalisation de leurs dosages.

7 Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 185 Avantages/inconvénients Cytokines ou récepteurs solubles Dosage par ELISA Dosage multiplex Cytokines ou récepteurs cellulaires Immunohistochimie Cytométrie intracytoplasmique ELISpot Acides nucléiques ARN, riboprobes in situ ou intracytoplasmiques Avantages Méthode quantitative Grandes séries possibles Dosages ponctuels, petites séries ou grandes séries Mesure simultanée de plusieurs cytokines : profils cytokiniques sur de faibles quantités d'échantillon Automatisation possible Identification des cellules productrices dans les tissus Production individuelle Identification concomitante de l'immunophénotype des cellules productrices Caractérisation de signatures fonctionnelles Grande sensibilité Réponses spécifiques en fonction de la stimulation Mesure quantitative Grande sensibilité Réponses spécifiques en fonction de la stimulation Mesure quantitative Détection plus rapide de l'activation Analyse large du transcriptome Identification concomitante de l'immunophénotype des cellules productrices Inconvénients Une cytokine à la fois Mesure globale Attention aux formes dégradées et aux effets de matrice Dosage global Tests de surcharge nécessaires pour certains fluides biologiques Attention à l'effet matrice et aux interférences Difficulté de standardisation Épitopes altérés par la fixation Appréciation qualitative ou semi-quantitative Culture cellulaire et stimulation en présence de molécules bloquant la sécrétion Interprétation des résultats en clinique parfois difficile (stimulation à la PHA, par exemple) Culture cellulaire en système approprié Protection des ARN Pas forcément de correspondance protéique ADN Détection des polymorphismes Pas de relation systématique avec les capacités de réponse Exemples d'applications En recherche : l'exploration des cytokines et de leurs récepteurs revêt une importance majeure dans l'étude de très nombreux modèles expérimentaux, qu'il s'agisse de lignées cellulaires, de réponses immunitaires humaines ex vivo ou de modèles animaux. Comme indiqué dans ce chapitre, l'étude de ces protéines et de leur régulation fait appel à de nombreuses méthodes immunologiques. En clinique : en pratique clinique, la recherche d'une infection tuberculeuse latente est une recommandation de la Haute Autorité de Santé chez les patients chez qui est prescrite une biothérapie anti-tnf. Elle est recherchée par les tests IGRA 11. De nombreuses approches de biothérapies ciblant les cytokines dans le but de neutraliser leurs effets pathologiques se développent utilisant des anticorps monoclonaux ou protéines de fusion inhibitrices ou des analogues antagonistes. Pour leur mise en œuvre ou leur suivi, aucun dosage n'est nécessaire. Quant à l'étude des polymorphismes (voir chapitre 5), celui de l'il-28b a son indication 11 IGRA (interferon gamma release assay) par ELISpot (T-Spot TB ) ou dosage ELISA (Quantiféron ).

8 186 Exemples d'applications actuellement dans la mise en œuvre d'une bithérapie interféron ribaravine dans le traitement de l'hépatite C ; en recherche clinique, un orage cytokinique est caractéristique du choc septique, générant une immunosuppression secondaire potentiellement mortelle. L'exploration de l'inflammasome peut contribuer à une meilleure compréhension de maladies auto-inflammatoires liées à des mutations de récepteurs de cytokines (e.g. TNFRSF1A) ou à des déficits (IL-1ra ou IL-36ra), ainsi que de pathologies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde ou le lupus érythémateux. Cependant, ces explorations restent encore du domaine de la recherche et n'ont pas encore de retombées thérapeutiques.