MÉCANISME D APOPTOSE TOXICO-INDUITE

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1 14/10/2013 MÉCANISME D TOXICO-INDUITE PAR LES NP Dr. Karine Andréau Laboratoire des Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques Université Paris Diderot Paris7 Lundi 14 Octobre 2013 I. Introduction I. Modèle cellulaire Translocation towards CNS? Lymph Nodes? Immune/ Inflammatory cells? NPs Lungs Few reports on inflammatory effects of TiO2,, ZnO, CNTs Spleen? Extrapulmonary Translocation? GIT? Skin? Significance of size and composition? I. Les NP étudiées : TiO2 et TiO2 Anatase Cancer Therapy Photocatalysis Paints & self cleaning surface I. Les NP étudiées : TiO2 et 253 nm 400 nm Rubber Industry (tires, conveying belts, cables and bowls) Leather and Plastic Industry (an antistatic filler) Pigment (typography/lithography/typewriter ribbons/carbon papers/paintings/ varnishes/ printing inks) Rutile Cosmetics Sunscreen Products Food additives 1

2 II. Question posée Les NP et sont-elles cytotoxiques pour les cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE et si oui par quel mécanisme? ❶ Ya-t-il induction de mort cellulaire? ❷Quel type de mort cellulaire? ❸ Par quel mécanisme moléculaire? III. Les différents types de mort cellulaire Distinction entre: cellules en train de mourir = processus impliquant plusieurs mécanismes cellules mortes = fin du processus caractérisé par: perte de l intégrité de la membrane plasmique fragmentation de la cellule la phagocytose de ces fragments cellulaires Les différents types de mort cellulaire (décembre 2009, NCCD) 1. Nécrose ou oncosis Autophagie (autodigestion) 4. Catastrophe mitotique (mitose avortée) 5. Anoïkis(détachement des cellules) 6. Excitotoxicitéou dégénérescence nerveuse 7. Cornification ou keratinisation (épiderme) 8. Paraptose(induite par l IGF-1) 9. Pyroptose(réponse anti-microbiennes chez les macrophages) 10. Pyronécrose(réponse anti-microbienne chez les macrophages) 11. Entose(auto-cannibalisme) Cell Death and Differentiation (2009) 16, 3 11 NECROSE Distribution tissulaire Une ou quelques cellules Un groupe de cellules Stimulus III. Caractéristiques différentielles de l apoptose et la nécrose morphologiques Cellule Organites - Physiologique ou accidentel - De faible intensité (=pyknosis) Corps apoptotiques Phagocytose Changements discrets de la morphologie - Accidentel - D intensité majeur Cytolyse complète Libération du contenu intracellulaire Perte d intégrité Chromatine Condensation Floculation NECROSE Distribution tissulaire Une ou quelques cellules Un groupe de cellules Stimulus III. Caractéristiques différentielles de l apoptose et la nécrose morphologiques Cellule Organites - Physiologique ou accidentel - De faible intensité Corps apoptotiques Phagocytose Changements discrets de la morphologie - Accidentel - D intensité majeur Cytolyse complète Libération du contenu intracellulaire Perte d intégrité Chromatine Condensation Floculation Membrane plasmique Pas de rupture Rupture Réaction tissulaire Pas de réaction inflammatoire Réaction inflammatoire III. Caractéristiques différentielles de l apoptose et la nécrose NECROSE Distribution tissulaire Une ou quelques cellules Un groupe de cellules Stimulus morphologiques Cellule Organites - Physiologique ou accidentel - De faible intensité Corps apoptotiques Phagocytose Changements discrets de la morphologie - Accidentel - D intensité majeur Cytolyse complète Libération du contenu intracellulaire Perte d intégrité Chromatine Condensation Floculation Membrane plasmique Pas de rupture Rupture Réaction tissulaire Pas de réaction inflammatoire Réaction inflammatoire biochimiques ADN Fragmentation oligonucléosomale Fragmentation aléatoire Protéines s caspases et Dégradation non spécifique ATP Nécessaire Pas nécessaire III. Rôles physiopathologiques de l apoptose 1. Processus physiologique Développement et morphogénèse contrôle du nombre de cellules (production en excès et ensuite élimination des cellules superflues). Homéostasie tissulaire: cellules sont produites chaque seconde par mitose et un nombre similaire de cellules meurent par apoptose afin de garantir l homéostasie tissulaire Fonctionnement du Système Imunitaire: permet d éliminer les cellules inutiles ou nuisibles 2. Anomalies de régulation de l apoptose: processus pathologiques Pathologies associées à une inhibition de l apoptose: Cancer (lymphome, carcinomes dus à des mutations de p53,tumeurs dépendantes des hormones ex: prostate..) Désordres auto-immuns (lupus érythemateux, glomérulonéphrite autoimmune) Infections (bactériennes, virales ) Pathologies associées à un excès d apoptose: SIDA Désordres neurodégénératifs (Alzheimer,Parkinson ) Ischémie Infections (bactériennes, virales ) 2

3 14/10/2013 IV. Les différentes phases du processus apoptotique d induction membranaires d induction Réversible de Réversible membranaires IV.1. La phase de de a-modifications morphologiques 1-modifications morphologiques exposition des phosphatidylsérines Bourgeonnement de la membrane plasmique Condensation de la chromatine Exposition des phosphatidylsérines Principe Fragmentation Fragmentation cellulaire et libération de corps apoptotiques Annexine V-FITC Détection Absence de réponse inflammatoire a-modifications morphologiques induites par les NP b-modifications biochimiques G1 SubG1 S G2/M Fragments de pb 3

4 14/10/2013 a-modifications morphologiques induites par les NP a-modifications morphologiques induites par les NP TiO2 Voies mécanistiques de l Toxico-Induite par les NP et TiO2 IV.2. La phase TiO2 d induction Réversible membranaires de a- la et la chute du Ψm a- la et la chute du Ψm ψm = potentiel transmembranaire mitochondrial = ψm = potentiel transmembranaire mitochondrial Membrane interne imperméable 1. Chute du Ψm Ψ Détection : fluorochrome CMXRos ψm ψ Arrêt des phosphorylations oxydatives = perte gradient H ψm ψ - 2. de la membrane interne mitochondriale () Espace intermembranaire Membrane interne perméable aux solutés PM< 1500 Da 4

5 a-la et la chute du Ψm : la théorie de l ouverture d un pore de transition de perméabilité (PTP) a-la et la chute du Ψm = canal anionique voltage dépendant = translocateurdes nucléotides à adénines Principe Cyp-D = cytlophillined PTP fermé PTP ouvert Outer membrane HK II PBR mtck Inner membrane Cyp- D Cardiolipin Cyp- D Chute du Ψm Voies mécanistiques de l Toxico-Induite par les NP et b-conséquences de la : libération de facteurs apoptogènes à partir de l EIM 1. Cytochrome c et les procaspases AIF Cytc Procaspases Omi/ HtrA2 Smac/ Diablo Endo G 2. AIF : «Apoptosis Inducing Factor» et Endonucléase G 3. Désactivation des IAP («Inhibitor of Apoptosis Proteins») par Smac/Diablo et Omi/HtrA2 s Caspases IAP c- Les protéines de l apoptose c-1la famille des Caspases Régulatrices Adaptatrices Effectrices Caspases de l inflammation C. elegans Ced-9 Ced-4 Ced-3 Mort cellulaire Mammifères FLIP Apaf-1 FADD Casp-9 Casp-8 Casp-3 Mort cellulaire Nomenclature: Cysteinyl-Aspartate- Protease Cystéine dans le centre actif (QACxG) DED DED DED DED Caspases initiatrices Caspases exécutrices Spécificité de clivage de leurs substrats après un résidu Asp J Clin Invest. 2005;115(10):

6 c- 2 s caspases par la formation de l apoptosome c- 2 s caspases par la formation de l apoptosome L hydrolyse de l ATP lié à Apaf1 permet au Cytochrome c d interagir avec l Apaf-1 Ce qui permet l exposition du domaine d Apaf1 WD40 Les domaines d APaf 1 interagissent avec les domaines de la procaspase9 pour former un apoptosome actif L apoptosomepermet l activation de la caspase9 La caspase9 clive la pro-caspase3 en caspase3 activée et initie la cascade d activation des caspases c- 3 Les protéines régulatrices de la famille c- 3 Les protéines régulatrices de la famille etbcl-xl:formationdecanauxà cationsdansla mbext =maintien Ψ Ψm 2-:Formationdecanauxàcations et àanionsdansla mbext =chute Ψm 3- Interaction avec les protéines du PTP afinde régulerl ouverturedupore 4- Bcl-xL : inhibition de l activation des caspases par séquestration de molécules adaptatriceset dela procaspase-9 Nature Reviews Molecular Cell Biology (2008) 9, Nature407, (2000) 5- Hétérodimerisation entre les membres pro- et anti-apoptotiques (interaction entre BH3 et la poche hydrophobe formée parbh1,bh2et BH3) b-conséquences de la : s caspases b-conséquences de la : et libération du Cyt c 6

7 Voies mécanistiques de l Toxico-Induite par les NP et Voiemitochondriale: Voielysosomale Voie intrinsèque IV.3. La phase d induction : Voie extrinsèque d induction Réversible Cyt C Caspase-3, -7 membranaires de IV.3. La phase d induction : La voie lysosomale Voies mécanistiques de l Toxico-Induite par les NP et %Acridine Orange Low Cells , Time (Hours) Cathepsin B Hoechst % Cells with Lipid Peroxidation , Time (Hours) Voiemitochondriale: ROS Cyt C Voielysosomale ROS Lipid Perox PML Lysosome Cathepsin B Caspase-3, -7 7