Les différents types de mort cellulaire

Transcription

1 Les différents types de mort cellulaire Type de mort Nécrose membrane Gonflement de la cellule et des organelles, Rupture Changements morphologiques cytoplasme Vacuolisation Dégénérescence des organelles Gonflement des mitochondries noyau Dégradation aléatoire de l ADN Caractéristiques Induit une inflammation Apoptose Vésicules (Blebbing) Formation de corps apoptotiques contenant des fragments de cyto et de noyau Condensation de la chromatine Fragmentation nucléaire Echelle d ADN Mécanisme actif, «programmé» Dépendant des caspases Aucune inflammation Autophagie Vésicules (Blebbing) Vésicules autophagiques Condensation partielle de la chromatine Pas d échelle d ADN Indépendant des caspases Activité lysosomale accrue Sénescence - Granulation Aplatissement Structure hétérochromatique Arrêt de réplication Activité ß-Gal associée à la sénescence D après Nature ReviewsCancer (2004) 4:592

2 L apoptose : Bases fondamentales et Applications médicales

3 Jusqu à la fin du XIXème Siècle, la nécrose est la seule mort cellulaire reconnue 1. survenue accidentelle, contexte pathologique ( Plaies cutanées, gangrènes) 2. Tissulaire : inflammation 3. Cellulaire : mort passive non contrôlée Int. J. Morphol., 27(3): , 2009

4 Une mort non pathologique différente de la nécrose? Vogt, Virshow nécrobiose, nécrose condensante Flemming W chromatolyse du follicule ovarien Arch. Anat. Physiol (1885) Artéfact, sans signification?

5 1960 s Observation de l existence de mort cellulaire dans le développement des organismes multicellulaires Thèse de Lockshin R 1963 : Métamorphose du Ver à soie Première description de la mort cellulaire qu il considère comme une nécessité développementale

6 1966 Mort cellulaire aussi importante pour le développement des mammifères Lockshin R; Liu Y et al. Development 2002;129: Cellules interdigitales meurent à un moment donné meurent à un endroit donné Subissent un programme actif de mort > Le concept de Mort Cellulaire Programmée

7 1966 Mort cellulaire programmée dépend également de signaux environnementaux Expériences de Saunders : 1. PLV cellules condamnées à mourir 2. Injection dans une région qui persiste 3. Ces cellules persistent > cellules meurent en réponse à un signal ext donné

8 Concept de Suicide cellulaire Lockshin R 1. Hypothèse admise: cellules de l embryon destinées à mourir sont exécutées par des macrophages environnants Meurtre 2. En utilisant des Inhibiteurs de synthèse de macromolécules, Lockshin démontre que les cellules synthétisent leurs propres protéines pour mourir : Il s agit d une mort ACTIVE : suicide cellulaire Suicide La MCP nécessite la synthèse de protéines

9 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer Aug;26(4): I. description morphologique d un type de mort cellulaire différent de la nécrose : 1. Condensation 2. Fragmentation 3. Phagocytose

10 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer Aug;26(4): II. Apoptose : «chute des feuilles en automne» Apoptose survient dans des circonstances «naturelles» non pathologiques

11 L apoptose correspond aux anomalies morphologiques de la MCP, du suicide cellulaire Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. La mort apoptotique comme sculpteur de la morphologie de l embryon des mammifères Cecconi F. Cell Death Differ Nov;6(11):

12 La mort apoptotique comme sculpteur du système immunitaire de l embryon : 90 % thymocytes meurent par apoptose Eliminés Par apoptose

13 L apoptose correspond aux anomalies morphologiques de la MCP, du suicide cellulaire Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. III. La mort apoptotique serait également importante dans les Tissus adultes

14 nucléosomes Première signature biochimique de l apoptose Wyllie AH Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature Apr 10;284(5756): coupures par une endonucléase dépendante Ca2+/Mg2+ - coupures internucléosomiques 200pb => Génère des fragments de taille multiples de 200 pb : Fragments oligonucléosomiques Après electrophorèse en gel d agarose (pb) Aspect en barreaux d échelle

15

16 Détermination de la fragmentation de l ADN par technique TUNEL (terminal deoxynucleotydil transferase-dutp nick end labelling) Détection des cassures par fixation des extrémités 3 OH libres avec des nucléotides marqués (dutp-fitc) en présence de TdT

17 Les modifications membranaires -Pas de troubles de la perméabilité de la membrane plasmique -Externalisation des phosphatidylsérines : exposition des PS sur feuillet externe REPOS Feuillet externe phosphatidylsérines ACTIF Perte de l asymétrie des PL PHAGOCYTOSE Ext Feuillet interne phosphatidylsérines APOPTOSE Int

18 Détermination de l Externalisation des PS - Détection par Ligand des PS : Annexine V (-FITC) - Utilisation avec l iodure de propidium (marqueur de la perméabilité de la membrane plasmique) permet de distinguer AO et nécrose Vivantes : Pas PS ext : Annexine V neg Pas Perméabilité: IP neg Apoptotiques : PS ext : Annexine V ++ Pas Perméabilité: IP neg Nécrotiques : Perméabilité: IP ++ et annexin V +++

19 Détermination en cytométrie de flux Annexine V Nécrose IP + Ao +++

20 Découverte des Bases moléculaires de l apoptose > Étude du développement de Caenorhabditis elegans Modèle simplifié d étude de la MCP XXXXXX production de 1090 cellules Dont 131 meurent par apoptose ver adulte : 959 cellules ( ) 131 apoptose - Nombre limité de gènes / mutations des gènes -Impact mutations sur la MCP >> comptage du nombre de cellules

21 Première identification de 3 gènes impliqués dans le contrôle de l apoptose : cell death abnormal ou ced 3, -4, -9. (Horvitz R) x x x x x xced-3, ced-4 aucune mort : ver adulte 1090 cells ced-9 mort de l ensemble des cellules : 0 cell ced-3, ced-4, ced-9 aucune mort : ver adulte 1090 cells Signification : ced-3 ced-4 Exécuteurs ced-9 Protecteur

22 Première identification de 3 gènes impliqués dans le contrôle de l apoptose : cell death abnormal ou ced 3, -4, -9. (Horvitz R) ced-3 ced-4 Exécuteurs ced-3 ced-4 xced-9 Protecteur ced-9 -> Le suicide est le programme par défaut

23 Autres gènes impliqués dans l apoptose de Caenorhabditis elegans decision to die egl-1 execution ced-3 ced-4 ced-9 engulfment ced-1 ced-2 ced-5 ced-6 ced-7 ced-10 degradation nuc-1 Wah-1 CPS-6

24 Découvertes chez C. elegans ont une signification chez l homme Vaux DL Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-b cells Nature Vaux DL Prevention of programmed cell death in C. elegans by human bcl-2 Science Bcl-2 humain + Mutant ced-9 = Mutant ced-9 = X Hengartner and Horvitz C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2 Cell

25 Découvertes chez C. elegans ont une signification chez l homme Yuan and Horvitz The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell Ced-3 a comme homologue une enzyme Chef de file de la Famille des caspases (1994) Protéolyse limitée de 100 à 200 protéines cibles

26 Exemples de protéines cibles des caspases dont le clivage contribue à l aspect morphologique apoptotique 1. Acinus > condensation nucléaire 2. ICAD > fragmentation nucléaire ICAD: Inhibiteur de CAD CAD: endonucléase activée par caspases Caspases caspases effectrices ICAD CAD Substrats

27 Brenner S, Horvitz R, Sulston J. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002 genetic regulation of organ development and programmed cell death

28 Homologie des molécules régulatrices de l apoptose : C. elegans Mammifères EGL-1 Ced-9 - Famille de Bcl BH3 only Ced-4 Ced-3 APOPTOSE Apaf-1 + Famille de protéases «caspases» APOPTOSE (protéolyse) : facteur d activation des protéases apoptotique

29 Le contrôle mitochondrial de l apoptose 1993: Lazebnik Application de systèmes acellulaires à l étude de l apoptose Extrait cytosolique de cellules ayant reçu un signal de mort > Exécuteur (caspases) est localisé dans le cytosol Extrait cytosolique de cellules ayant reçu un signal de mort >Les mitochondries activent les caspases 1996: X. Wang Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for datp and cytochrome c. Cell 1990 : Hockenbery localisation mitochondriale de Bcl-2

30 La mitochondrie au centre de la régulation de l apoptose Famille de Bcl BH3 only + permébilisation de la MME + Cyt Xc Apaf-1 + x - permébilisation de la MME : facteur d activation des protéases apoptotique Famille de protéases «caspases» X X APOPTOSE (protéolyse)

31 Apoptose : un phénomène physiologique important chez l adulte Rôle dans l élimination des - Cellules âgées Toutes cellules (y compris les cellules germinales) - Cellules endommagées - Cellules nuisibles - Cellules inutiles -> 1 million/s

32 Importance de l apoptose des cellules des organismes adultes 1990: Raff M la mort apoptotique est le programme par défaut 1992: Raff M le contrôle social de la vie et de la mort Nature Autres cellules contrôlent la mort cellulaire par sécrétion de Facteurs de croissance

33 Importance de l apoptose pour maintien de la taille des tissus adultes Prolifération (Mitose) Mort cellulaire (Apoptose) homéostasie PHYSIOLOGIQUE PATHOLOGIQUES accumulation de cellules perte de cellules

34 Défaut d apoptose Cancer : accumulation de cellules, résistance aux traitements Autoimmunité : non-élimination des cellules autoréactives Resténose : Accumulation de cellules musculaires dans la paroi des artères Infections chroniques : non-élimination des cellules infectées (virus, parasites, bactéries) Excès d apoptose Ischémie : (IDM, apopléxie, reperfusion) association avec nécrose Insuffisance cardiaque : perte des cardiomyocytes Inflammation et choc septique Ostéoarthrite: déplétion des chondrocytes VIH : délétion des T Diabète de type I : destruction des îlots de Langerhans Neurodégénérescence (Alzheimer, Parkinson, SLA) Traumatisme Rejet de greffes et GVH Traitements anticancéreux

35 Apoptose aujourd hui 1972? Applications médicales : Détection in vivo Cible thérapeutique

36 Détection in vivo : Annexin V Tc99m Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction Hofstra et al Lancet 2000

37

38 MÉNINGITE BACTÉRIENNE ET INHIBITEURS DE CASPASES Contrôle S. pneumoniae + Inhibiteur de caspases Infiltration leucocytaire Apoptose neuronale Troubles fonctionnels Braun - Nature Medicine 1999

39 Caspase inhibitor design Vertex (Boston, MA, USA) Merck (West point, PA, USA) BASF (Ludwigshafen, Germany) Pfizer (Groton, CT, USA) Nicholson, Nature Oct Ischemie/Reperfusion - Sepsis - M ies Immunitaires - Coeur - Articulations - Foie

40 Oligonucléotides Bcl-2 antisense Genasense : favoriser l apoptose

41 La machinerie apoptotique Famille de Bcl BH3 only + permébilisation de la MME + Cyt c Apaf permébilisation de la MME : facteur d activation des protéases apoptotique Famille de protéases «caspases» APOPTOSE (protéolyse)

42 Les caspases (C-Asp-Ases) C: Protéases à cystéine dans site actif Asp: clivent protéines cibles après Asp (D) QACXG Synthétisées sous forme de proenzymes (procaspases) (zymogènes) : Prodomaine Grande ssu Petite ssu N D D C Activées par protéolyse après un Asp Forme active = tétramère avec 2 sites actifs QACXG Clivage autres protéines (après D)

43 Classification des caspases (14 mammifères) Caspases du groupe I = Caspases Inflammatoires (Clivage/Activation de cytokines) Caspase-1 Caspase-4 Caspase-5 Caspases du groupe 2 = Caspases effectrices (Clivage/Activation de protéines cibles) Caspase-3 Caspase-7 Caspases du groupe 3 = Caspases initiatrices (Clivage/Activation de caspases effectrices) Caspase-8 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-2 Nicholson, CDD, 1999

44 Activation séquentielle (en cascade) des caspases : Les procaspases effectrices sont activées par les caspases initiatrices Caspases Initiatrices (Caspases-2, -8, -9) Caspases Effectrices (caspases-3,-7) Protéines cibles = Phénotype APOPTOTIQUE

45 Exemples de protéines cibles clivées par les caspases effectrices Nicholson, CDD, 1999

46 Approche expérimentale : détermination des caspases effectrices - indirecte Clivage de substrats PARP - directe - dosage enzymatique - Clivage caspase Bcl-2

47 Comment les procaspases initiatrices sont activées? Particularité des caspases initiatrices : pro-domaine > 10 kda N C motifs d intéraction avec d autres protéines Complexes multiprotéiques : Plateforme d autoactivation des caspases initiatrices apoptosome (c-9), DISC (c-8), Piddosome (c-2) ) Conséquence recrutement de procaspases initiatrices > auto-activation

48 Nicholson, CDD, 1999

49 2 voies apoptotiques distinctes conduisent à l autoactivation des caspases initiatrices 1. Voie Extrinsèque Récepteurs de mort DISC Molécules adaptatrices Pro-caspases-8, -10 caspases initiatrices Caspases-8, -10 Caspase-8, caspases -10 initiatrices Caspases-3, -7 caspases effectrices Substrats

50 RECEPTEUR LIGAND ADAPTATEUR Activation de la voie extrinsèque Signalisation par les récepteurs de mort CD95L TNF-a CD95 / Fas / Apo1 DISC (Death- Inducing Signaling Complex) TNFR1 Procaspase-8, -10 Auto activation-8 Auto activation

51 Hépatite fulminante + Gène fas Cellule hépatique infection Virus de l hépatite B ou C apoptose Cellule hépatique Fas FasL Lymphocyte T activé Apo-1 / Fas Traugh DC Science 1989

52 L autoactivation des caspases initiatrices provient de la signalisation par 2 voies apoptotiques distinctes 1. Voie Extrinsèque 2. Voie Intrinsèque Récepteurs de mort Dommages (intra)cellulaires DISC Molécules adaptatrices Pro-caspases-8, -10 Bcl-2 caspases initiatrices Caspases-8, -10 Caspase-8, -10 caspases initiatrices Caspase-9 Cyt c Apoptosome Caspases-3, -7 caspases effectrices Substrats Apaf-1

53 Voie extrinsèque : Formation de l apoptosome 1. Apaf-1 (CED-4) fixe cyt c cytosolique 2. Changement conformationnel Apaf-1 3. Oligomérisation Apaf-1 4. Fixation de procaspases-9 sur Apaf-1 (en présence datp) 5. Autoactivation de caspases-9 Adrain, TiBS, 2001 La voie extrinsèque nécessite la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe dépendante des protéines de la Famille de Bcl-2

54 Oliver C L et al. Mol Cancer Ther 2005;4:23-31

55 La protéine Bcl-2 p q IgH p q Bcl-2 Identification de Bcl-2 dans les lymphomes folliculaires B humains Croce PNAS, 1984 > Translocation 14, 18 Bcl-2 sous contrôle du promoteur Ig : surexpression Bcl > Fonction Bcl-2? Oncogène? Expériences avec de cellules hématopoïétiques IL-3 dépendantes + IL-3 > Prolifération - IL-3 > Apoptose - IL-3+Bcl-2 > Pas de prolifération MAIS Bcl-2 protège de l apoptose Vaux 1988, Korsmeyer et al, Nature, 1990, Cell 1991

56 Caractéristiques structurales de la protéine Bcl-2 Phosphorylation and caspase cleavage sites BH4 BH3 BH1 BH2 TM - Domaines d homologie (BH) > BH1-2-3 : dimérisations > BH4 : stabilisation - Un domaine TM (Membrane mitochondriale externe, Réticulum endo, enveloppe nucléaire ) BHs délimitent poche hydrophobe

57 Les protéines de la Famille de Bcl-2 Une 20aine de protéines classées en 3 sous groupes : BH1-4 Anti-apoptotiques BH1-3 +/- TM Pro-apoptotiques Bad, Noxa, puma.. BH3 +/- TM Pro-apoptotiques (BH3 only)

58 Suite à un stimulus apoptotique, activation Bax et Bak oligomérisation Bax et Bak

59 L activation de Bax et Bak est nécessaire à l induction de l apoptose

60 Activation de Bax et Bak est inhibée par la dimérisation avec Structure les protéines tridimensionnelle anti-apoptotiques des protéines Bcl-2-like oligomérisation Bax et Bak Cory et Adams, 2002 Domaine BH3 d une protéine pro-apoptotique (Bak) les domaines BH1 + BH2 + BH3 = une poche hydrophobe pouvant interagir avec le domaine BH3 d une protéine pro-apoptotique (pas d interactions possibles entre Bcl-2 et Bcl-x L ) inhibition par protéines le domaine BH4 présent en N terminal stabilise anti-apoptotiques la poche Bcl-2 X X Quand le domaine BH3 de Bak est complexé à Bcl-x L, il constitue une hélice alpha amphipathique qui se niche dans la poche hydrophobe via

61 Les protéines BH3 only permettent directement l activation de Bax et Bak

62 Les protéines BH3 only permettent indirectement l activation de Bax et Bak +++ BH3 only Bcl-2 BH3 only Bax Bak Caspases

63 Stimuli apoptotiques Les protéines BH3 only sont des émissaires de mort, des sentinelles des dommages cellulaires Altérations des µtubules Dommages de l ADN Stress métabolique Activation transcriptionelle ou post-traductionelle Bim Hrf Noxa Puma Bad

64 Lever le frein de l inhibition de Bcl-2 pour favoriser l apoptose

65 > ABT-737 un BH3 mimétique, molécule inhibitrice de Bcl-2 > Et de Bcl-xl, Mcl-1 Gossipol molécule naturelle inhibitrice de Bcl-2 Phase I/II + radio/chimio : sein, glioblastome

66

67 Représentation simplifiée des voies apoptotiques Récepteurs de mort Dommages cellulaires DISC Molécules adaptatrices BH3 only Pro-caspases-8, -10 BAX, BAK, Bcl-2 Caspases-8, -10 caspases initiatrices Caspase-9 Cyt c Apoptosome Caspases-3, -7 caspases effectrices Apaf-1 Substrats

68 Les voies apoptotiques sont plus complexes 1. Existence d inhibiteurs naturels des caspases Récepteurs de mort Dommages cellulaires FLIP XX DISC (FLICE-Inhibitory proteins) Molécules adaptatrices Pro-caspases-8, -10 Caspases-8, -10 caspases initiatrices XX Caspase-9 Bcl-2 BH3 only BAX, BAK, Cyt c Apoptosome XX Caspases-3, -7 caspases effectrices IAP Substrats Apaf-1 (Inhibitor of apoptosis proteins) Cancers +++ (survivin, ciap) Inhibition directe

69 Holcik and Korneluk Nature reviews Molecular cell biology, 2001

70 Les voies apoptotiques sont plus complexes 2. Existence d autres facteurs pro-apoptotiques libérés par la mitochondrie Libération cyt c insuffisante Nécessité libération autres facteurs activateurs d ao : Cyt c Apoptosome Smac/DIABLO Apaf-1 HtrA2/OMI Caspase-9 Caspase-3 Apoptose IAP Inhibiteurs d IAP (libération régulée par Bcl-2)

71 Les voies apoptotiques sont plus complexes 3. Les voies extrinsèques et intrinsèques communiquent Récepteurs de mort Dommages cellulaires DISC Molécules adaptatrices BH3 only Pro-caspases-8, -10 BAX, BAK, Bcl-2 X Caspases-8, -10 Caspase-9 Caspases-3, -7 XX caspases effectrices Substrats IAP XX Cyt c Apoptosome Apaf-1 Smac/DIABLO

72 La protéine bid fait le lien entre les voies extrinsèques et intrinsèques VOIE APOPTOTIQUE EXTRINSEQUE DE TYPE II Nagata Nature Cell Biology 1999

73 Les voies apoptotiques sont plus complexes 4. Existence de voies apoptotiques indépendantes des caspases - Condensation cellulaire et nucléaire sont indépendantes des caspases - Modèles d apoptose indépendante des caspases - L inhibition des caspases supprime le phénotype apoptotique mais pas la mort cellulaire 2 Facteurs apoptotiques indépendants des caspases : Endonucléase G AIF (Apoptosis Inducing Factor)

74 AIF est un facteur pro-apoptotique indépendant des caspases Oxydo-reductase mitochondriale Translocation nucléaire : Condensation Fragmentation 50 kpb (phase préparatoire à la fragmentation oligonucléosomique?)

75 Les voies apoptotiques sont plus complexes 5. Existence de boucles d auto-amplification Bcl-2 Complexe I Cyt c Apoptosome Voies rétroactives Apaf-1 Caspase-9 Caspase-3 Apoptose

76 Voies apoptotiques extrinsèques Récepteurs de mort Fas/TNF-R Voies apoptotiques intrinsèques Stress cellulaires DISC FADD TRADD p53 NO Céramides FLIP Caspase-8 Voie de Type II Noxa, Puma, Bim, Bad.. ROS? Bid t-bid Bax Bak Phase d'initiation Phase d'exécution Voie de Type I t-bid Mitochondrie Pore de TP D m Bax Apoptosome Cytochrome c Pro-caspase-9 Apaf-1 Caspase-9 Bcl-2 Bcl xl Omi/HtrA2 Smac/DIABLO Endo G AIF HSP70 Point de non retour Fragmentation de l'adn de Stade II (Oligonucléosomes) Caspase-3 ICAD/CAD HSP70 Apoptose nucléaire IAP Phase de dégradation Fragmentation de l'adn de Stade I (Fragments de grande taille)