ÉTUDE DU MÉTABOLISME DES ARNm ABERRANTS DU GÈNE CODANT POUR LA FUMARYLACÉTOACÉTATE HYDROLASE

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1 NATACHA DREUMONT ÉTUDE DU MÉTABOLISME DES ARNm ABERRANTS DU GÈNE CODANT POUR LA FUMARYLACÉTOACÉTATE HYDROLASE Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'université Laval dans le cadre du programme de doctorat Biologie cellulaire et moléculaire pour l obtention du grade de Philosophiæ Doctor (Ph.D.) FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC OCTOBRE, 2004 Natacha Dreumont, 2004

2 Résumé i Résumé La cellule a élaboré des mécanismes de surveillance afin d assurer la fidélité de l expression génique. Le nonsense-mediated mrna decay (NMD) reconnaît et en général, dégrade rapidement les ARNm nonsens, qui contiennent des codons stop prématurés. Le NMD a longtemps été considéré comme un mécanisme de protection, permettant d éviter la synthèse de protéines tronquées, potentiellement néfastes pour la cellule. Plus récemment, un nouveau rôle du NMD a émergé : il semble réguler l expression génique, notamment lorsqu il est couplé à l épissage alternatif. D autre part, bien que les mécanismes de reconnaissance et de dégradation des ARNm nonsens soient de mieux en mieux compris, une controverse subsiste quand à la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères. Ces deux aspects du NMD ont été abordés au cours de ma thèse dans le cas de l étude du métabolisme des ARNm aberrants du gène de la fah, responsable de la tyrosinémie héréditaire de type I. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la maladie, j ai caractérisé les ARNm de la FAH contenant des mutations d épissage (Q279R et V259L) ou nonsens (W262X) dans l exon 9. Deux transcrits alternatifs du gène de la fah ont ainsi été mis en évidence pour ces trois mutations : del100 a éliminé l exon 8 et del231 les exons 8 et 9. Del231 est fortement produit lorsque les mutations d épissage Q279R et V259L sont présentes. L étude des transcrits chez les patients avec ces deux mutations a permis de proposer un modèle d épissage pour les exons 8 et 9. Une analyse plus poussée sur del100 et del231 a révélé que ceux-ci étaient en fait produits de façon minoritaire dans des cellules avec un gène normal de la fah, par épissage alternatif des exons 8 et 9. Del100, qui contient de nombreux PTCs suite à l élimination de l exon 8, est dégradé par NMD. Cependant, la quantité de transcrit restante semble suffisante pour la synthèse d une protéine de 31-kDa, détectable dans plusieurs tissus humains. Ce premier transcrit alternatif de la fah est important à deux points de vue : premièrement, il semble illustrer le rôle possible du NMD couplé à l épissage alternatif dans la régulation génique et deuxièmement, la protéine synthétisée pourrait être importante pour la tyrosinémie héréditaire de type I.

3 Avant-propos ii Avant-Propos Je tiens à remercier le Prof. R.M. Tanguay, le Gouvernement du Canada et le CREFSIP pour leur soutien financier. Merci aux laboratoires des Dr Michel Vincent et André Darveau, pour le trafic de réactifs et de cellules. J aimerais remercier les personnes qui suivent, pour m avoir offert leur amitié pendant ces 5 années passées à Québec : Nicolas, Jeff, Marie-Odile, Sophie, Marco et Caro, ma gang d escalade Merci à vous tous pour m avoir aidée à maintenir un équilibre et m avoir fait me sentir chez moi. Merci pour votre écoute et merci de m avoir acceptée comme je suis. Merci à Sébastien, pour son soutien et sa présence pendant la dernière ligne droite (et à sa gang pour avoir sauvé mon ordinateur et les cent premières pages de cette thèse). Je dédie cette thèse à Antonella qui m a beaucoup aidée les premières années. Merci pour ta présence maternelle et le temps que tu m as consacré. Merci pour ton aide, tes idées et les longues discussions qu on a eues le soir, qu elles soient scientifiques ou non. Même si j ai la tête dure, je n ai pas oublié ce que tu as tenté de m enseigner.

4 Table des matières. iii Table des matières Résumé...i Avant-Propos... ii Table des matières... iii Liste des tableaux... vii Liste des figures... viii Liste des abréviations...ix Chapitre 1 Introduction Les mécanismes de surveillance de l ARNm : le nonsense-mediated mrna decay Importance physiologique du NMD Comment la cellule différencie-t elle un PTC d un codon de terminaison physiologique? La règle de position Le EJC (exon-exon junction complex) Le complexe de surveillance Un mécanisme conservé Les protéines Upfs Assemblage séquentiel du complexe de surveillance Le cycle de phosphorylation/déphosphorylation de hupf1 est médié par les protéines hsmg Controverse concernant la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères Identification du site de dégradation par fractionnement des cellules Le NMD dépend de la traduction Importance des évènements nucléaires dans la dégradation des ARNm nonsens Le PTC peut influencer la maturation du pré-arnm Effet du PTC sur l épissage : le nonsense-associated altered splicing (NAS) Le modèle d exportation cotraductionnelle Le premier cycle de traduction Le modèle d exportation cotraductionnelle Le modèle du scanning nucléaire Le cas des immunoglobulines et du TcR De la traduction dans le noyau? Le scanning nucléaire La dégradation des ARNm nonsens La dégradation physiologique des ARNm Les facteurs intervenant dans la dégradation des ARNm nonsens Le NMD : un mécanisme très complexe La tyrosinémie héréditaire de type I Description clinique et incidence de la TH Traitements de la TH Les modèles animaux...40

5 Table des matières. iv Le FAA, métabolite toxique Stress oxydatif et résistance à l apoptose La fumarylacétoacétate hydrolase Le gène de la FAH Mosaïcisme par réversion des mutations Objectifs de recherche Chapitre 2 A missense mutation (Q279R) in the fumarylacetoacetate hydrolase gene, responsible for hereditary tyrosinemia, acts as a splicing mutation Avant-propos Résumé Abstract Background: Results: Conclusion: Background Results Expression of FAH in a non-tumoral liver region results from reversion of the Q279R mutation The Q279R mutation is associated with altered mrna splicing in vivo Q279R acts as a splicing mutation in a minigene assay Discussion Conclusion Materials and Methods Case History Detection of the Q279R and IVS6-1g >t mutations in liver samples RT-PCR Minigene constructs and analysis Acknowledgements Figures Chapitre 3 V259L, associated with atypical symptoms of hereditary tyrosinemia type I, partially affects the splicing of exons 8 and 9 of the fah gene Avant-propos Résumé Abstract Introduction Material and methods Analysis of FAH expression in the liver of the patient Analysis of total RNA and identification of the alternative transcripts Minigenes constructs Results and Discussion Confirmation of the HTI phenotype and identification of a new mutation in exon V259L partially affects exon 9 definition Acknowledgments Figures Chapitre

6 Table des matières. v Cytoplasmic nonsense-mediated mrna decay for a nonsense (W262X) transcript of the gene responsible for hereditary tyrosinemia, fumarylacetoacetate hydrolase Avant-propos Résumé Abstract Introduction Material and methods Patients Lymphoblastoid cell line establishment and cellular culture RNA extraction from lymphoblastoid cells Analysis of W262X-FAH transcripts Semi-quantitative RT-PCR Results and discussion W262X-containing transcripts are strongly down-regulated Diminution of W262X-FAH mrnas occurs in the cytoplasmic compartment Translation is required for decay of nonsense FAH mrnas Acknowledgements Figures Eléments complémentaires Stratégie des minigènes Matériel et méthodes Résultats préliminaires et discussion Chapitre 5 A minor alternative transcript of the fumarylacetoacetate hydrolase gene produces a protein despite being likely subjected to nonsense-mediated mrna decay Avant-propos Résumé Abstract Background: Results: Conclusions : Background Results Identification of two alternative transcripts of the fah gene The del100 transcript is translated into a protein The del100 transcript is subjected to NMD Discussion Conclusions Material and methods Cell culture RT-PCR analysis Production of an antiserum against the DEL100 protein Preparation of the anti-hfah monoclonal antibody Western blot analysis Tests of the specificity of the anti-del100 antiserum Acknowledgements Figures Chapitre 6 Discussion et Conclusion...135

7 Table des matières. vi 6.1 Discussion Perspectives générales Annexe A Constructions des minigènes de la FAH Les minigènes wt- int et W262X- int Les minigènes wt-int13 et W262X-int La cassette K L insert exons intron Les constructions wt-int9 et W262X-int Annexe B : les protéines DEL100 et DEL

8 Liste des tableaux. vii Liste des tableaux Tableau 1 : Les protéines associées au nonsense-mediated mrna decay chez différents organismes eucaryotes Tableau 2 : Mutations faux-sens (23) Tableau 3 : Mutations d épissage (15)...46 Tableau 4 : Mutations nonsens (7)...47 Tableau 5 : Mutations causant un décalage du cadre de lecture (3) Tableau 6 : Récapitulatif des résultats préliminaires obtenus avec les minigènes de la FAH dans les cellules HeLa...107

9 Liste des figures. viii Liste des figures Figure 1 : Rôle de l épissage dans la reconnaissance du codon stop prématuré....7 Figure 2: Le domaine 4GH de hupf Figure 3: Le EJC recrute le complexe de surveillance Figure 4 : Le remodelage des complexes hupf1 dépend de son état de phosphorylation...17 Figure 5 : Les mécanismes possibles de NAS...23 Figure 6 : les complexes d initiation de la traduction...25 Figure 7 : Le modèle d exportation cotraductionnelle...28 Figure 8 : le modèle du scanning nucléaire Figure 9 : Le sentier majeur de dégradation des ARNm chez S. cerevisiae...33 Figure 10 : Les deux sentiers de dégradation intervenant dans le NMD...35 Figure 11 : Le sentier catabolique de la tyrosine...38 Figure 12 : Mutation analysis in different liver regions Figure 13 : RT-PCR on RNA from different liver sections and fibroblasts Figure 14 : Diagram of RNA alternative transcripts found in the IVS6-1g->t and Q279R patient...70 Figure 15 : Analysis of the splicing pattern obtained with the minigenes...71 Figure 16 : Analysis of FAH expression in the patient s liver Figure 17 : Sequence analysis of intron 6 and exon Figure 18 : V259L promotes the skipping of exon Figure 19 : Model of exons 8 and 9 splicing Figure 20 : FAH cdna and RT-PCR strategies...99 Figure 21 : W262X-containing mrnas are greatly reduced in the homozygous HTI patients Figure 22 : The diminution of W262X mrnas is apparent in the cytoplasm, but not in the nuclear fraction Figure 23: W262X mrnas are stabilized following a block of translation Figure 24 : Représentation schématique des différents minigènes de la FAH Figure 25 : La présence de l intron 13 n est pas suffisante pour la dégradation de l ARNm nonsens W262X Figure 26 : Les mutations E357X et E364X entraînent la dégradation des ARNm de la FAH Figure 27 : Del100 and del231 result from minor alternative splicing pathways and not from the presence of the W262X mutation Figure 28 : Del100 transcript encodes for a protein expressed in various tissues Figure 29 : Specificity of the anti-del100 antiserum Figure 30 : Del100 is subjected to NMD Figure 31 : Predicted splicing pathways of the region encompassing exons 6 to Figure 32 (Annexe A) : Le principe du triple PCR Figure 33 (Annexe A): Les différentes étapes d obtention des minigènes Figure 34 (Annexe B) : La FAH et DEL100 divergent dans la partie C-terminale Figure 35 (Annexe B) : La région codée par les exons 8 et 9 est absente chez DEL

10 Liste des abréviations. ix Liste des abréviations. 4GH eif4g homology ADN acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire ARN acide ribonucléique ARNm ARN messager ARNt ARN de transfert ATP adénosine 5 -triphosphate bp base pair Da dalton DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride datp 2 -désoxyadénosine 5 -triphosphate dntp 2 -désoxynucléoside 5 -triphosphate ESE exonic splicing enhancer FAA fumarylacétoacétate FAH fumarylacétoacétate hydrolase FBN1 fibrilline GAPDH glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase GSH glutathion GPx1 glutathione peroxidase 1 HCC hepatocellular carcinoma HGA homogentisate HGO homogentisate dioxygénase HPPD hydroxylphénylpyruvate dioxygénase Ig immunoglobuline kda kilodalton kb kilobase MAAI maléylacétoacétate isomérase NAS nonsense-associated altered splicing NMD nonsense-mediated mrna decay NPC nuclear pore complex NTBC 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione NTP nucléotide triphosphate PTC premature termination codon RNP ribonucleoparticle hnrnp heterogenous ribonucleoparticle mrnp messenger ribonucleoparticle PCR polymerase chain reaction RAR récepteur à l acide rétinoïque RT reverse-transcription RUST Regulated Unproductive Splicing and Translation SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis Smg Suppressor with Morphogenetic defects on Genitalia STE stabilizing element

11 Liste des abréviations. x TAT tyrosine aminotransférase TcR T-cell receptor TH1, 2 ou 3 tyrosinémie héréditaire de type 1, 2 ou 3 Upf UP-Frameshift

12 Chapitre 1 Introduction

13 Introduction 2 La cellule a élaboré de nombreux mécanismes afin d assurer la fidélité de l expression génique. Le nonsense-mediated mrna decay (NMD) est un processus de surveillance de l ARNm qui a été mis en évidence il y a une vingtaine d années lors de l étude de pathologies humaines causées par des mutations nonsens ou créant un décalage du cadre de lecture (Baserga and Benz, 1988; Urlaub et al., 1989). Ces deux types de mutations créent des codons stop prématurés ( premature termination codon, PTC) qui selon toute logique, devraient causer la synthèse de protéines tronquées, qui peuvent posséder une fonction différente de celle de la protéine de départ, avoir un effet dominant négatif ou encore, ne plus avoir de fonction. L étude des transcrits affectés par ces mutations a révélé que ceux-ci étaient en fait rapidement dégradés et que le NMD permettait de protéger la cellule contre les effets potentiellement néfastes des protéines tronquées. Le NMD n est pas uniquement restreint à ce rôle de protection contre les effets des mutations, mais semble également réguler l expression de certains transcrits produits de façon physiologique dans la cellule. De plus, ce mécanisme extrêmement complexe est un parfait exemple de l interdépendance des différentes étapes de maturation du transcrit, que celles-ci soient nucléaires ou cytoplasmiques. 1.1 Les mécanismes de surveillance de l ARNm : le nonsensemediated mrna decay Importance physiologique du NMD. Un tiers des mutations responsables des pathologies humaines et de la plupart des cancers sont des PTCs. Le NMD reconnaît et en général dégrade rapidement les ARNm portant un codon nonsens prématuré. Les PTCs peuvent être introduits directement par une mutation ponctuelle nonsens qui change un codon codant pour un acide aminé donné en codon stop, soit UAA, UGA ou UAG. Les mutations créant un décalage du cadre de lecture par la délétion ou l insertion d un ou de plusieurs nucléotides sont elles aussi à l origine des PTCs. Les mutations d épissage sont également souvent responsables d un décalage du

14 Introduction 3 cadre de lecture, lorsqu il y a élimination d un exon ou plus fréquemment, rétention d une partie ou de la totalité d un intron. La dégradation des transcrits nonsens permet d éviter la synthèse de protéines tronquées en C-terminal, potentiellement néfastes à la cellule, de par un effet dominant négatif ou le gain d une nouvelle fonction. Le NMD semble être responsable de la récessivité de nombreuses pathologies humaines. Par exemple, la β- thalassémie, causée par une déficience du gène de la β-globine, est normalement récessive. Lorsque les mutations nonsens sont localisées dans les deux premiers exons, l ARNm est dégradé (Baserga and Benz, 1988). Cependant, une mutation nonsens située dans le dernier exon est responsable d une forme dominante de la maladie (Hall and Thein, 1994). Dans ce cas, l ARNm n est pas dégradé et une protéine tronquée est synthétisée. La dégradation des chaînes tronquées non fonctionnelles de β-globine va surcharger l appareil protéolytique et causer l apparition de corps d inclusion, aggravant davantage l inefficacité de l érythropoïèse (Hall and Thein, 1994). En plus de protéger la cellule contre les effets des mutations causant l apparition de PTCs, le NMD joue un rôle dans le développement cellulaire normal. Par exemple, les gènes du TcR et des immunoglobulines (Ig) sont soumis à de nombreux réarrangements pendant le développement des lymphocytes. Des segments V, D et J sont joints ensemble pour créer des gènes fonctionnels. Le grand nombre de combinaisons possibles entre ces segments contribue à la diversité du répertoire immunitaire. La terminal transférase introduit des nucléotides à la jonction entre les segments et augmente encore cette diversité. Ces réarrangements sont cependant peu fidèles et la plupart vont générer des gènes non fonctionnels, contenant des PTCs. Le NMD joue un rôle primordial dans le maintien d un répertoire de TcR et Ig fonctionnels puisqu il dégrade les transcrits non productifs (Li and Wilkinson, 1998; Lozano et al., 1994; Carter et al., 1995). D autre part, la machinerie d épissage n est pas efficace à 100% et une faible proportion de transcrits aberrants est produite durant la maturation des ARNm. Ces transcrits aberrants contiennent très souvent des codons stop prématurés et sont donc éliminés par NMD. Par

15 Introduction 4 exemple, des ARNm ayant retenu un intron et exportés dans le cytoplasme chez la levure sont dégradés par NMD (He et al., 1993). Des données récentes suggèrent que le NMD ne fonctionne pas seulement comme un mécanisme de protection contre les ARNm aberrants, produits suite à des mutations ou à des erreurs lors de la maturation des transcrits. Il semble que le NMD puisse également servir à la régulation de l expression génique, en agissant sur des ARNm PTC+ produits de façon normale. Ainsi, chez C. elegans, il a été montré que les gènes codant pour certaines protéines ribosomales et les protéines SRp20 et SRp30b sont des cibles naturelles du NMD (Morrison et al., 1997; Mitrovich and Anderson, 2000). L expression de ces protéines est régulée via le couplage de l épissage alternatif avec le NMD. Des isoformes non productives générées par épissage alternatif sont dégradées par NMD et l expression protéique est ainsi régulée de façon négative (Morrison et al., 1997; Mitrovich and Anderson, 2000; Lamba et al., 2003). Lewis et al. (2003) ont estimé en se basant sur les ESTs ( Expressed Sequence Tags ) que 35% des ARNm alternatifs contenaient des PTCs. Ce phénomène de RUST ( Regulated Unproductive Splicing and Translation ; Lewis et al., 2003) est beaucoup plus répandu que préalablement soupçonné et pourrait être encore sousestimé (Hillman et al., 2004). Il semble notamment que le couplage de l épissage alternatif avec le NMD soit couramment employé pour la régulation de protéines impliquées dans l épissage. Ainsi, il a été montré pour SC35, PTB, et CLK-1 que ces protéines, en se liant à leur ARNm, entraînent la production de transcrits alternatifs contenant un PTC qui sont dégradés. L expression de ces facteurs d épissage est ainsi régulée de façon négative (Hillman et al., 2004; Menegay et al., 2000; Sureau et al., 2001; Wollerton et al., 2004) Comment la cellule différencie-t elle un PTC d un codon de terminaison physiologique? Le codon de terminaison est le même qu il soit prématuré ou physiologique. D autres éléments doivent donc permettre de discriminer entre un évènement prématuré et un signal physiologique de terminaison de la traduction.

16 Introduction La règle de position. Des études réalisées sur la triose phosphate isomérase (TPI) humaine ont montré que lorsqu on supprime tous les introns de l ARNm ou que les PTCs sont proches du codon de terminaison, l ARNm n est pas dégradé (Cheng et al., 1994; Zhang et al., 1998a). Ces observations laissaient supposer qu un PTC se distingue d un codon de terminaison physiologique par sa position relativement au dernier intron (Cheng et al., 1994). Zhang et al. (1998a) ont montré que lorsque le PTC est situé à plus de 50 nucléotides en amont du dernier intron, l ARNm de la TPI est dégradé (Figure 1A; Zhang et al., 1998a). Lorsque l intron est déplacé en 3, la frontière est également déplacée. Ces résultats ont été confirmés par ceux obtenus sur la β-globine humaine (Zhang et al., 1998b; Thermann et al., 1998). Cependant, dans le cas du TcR, la distance du PTC par rapport à l intron, qui entraîne la dégradation de l ARNm, est seulement de 8 à 10 nucléotides (Carter et al., 1996). Une analyse menée sur plus de 1500 gènes de champignons, de plantes, d insectes et de vertébrés est venue confirmer les observations faites sur la TPI et la β-globine (Nagy and Maquat, 1998). Une très faible proportion de ces gènes possède un ou plusieurs exons dans le 3 UTR et dans la quasi-majorité des cas, le codon de terminaison physiologique est situé à moins de 50 nucléotides du dernier intron épissé. Toutes ces observations ont conduit à l énoncé de la règle de position qui stipule qu un codon de terminaison situé à plus de 50 nucléotides en amont du dernier intron épissé va entraîner le NMD (Figure 1A; Nagy and Maquat, 1998). Il ne semble pas y avoir de limite supérieure pour cette frontière puisqu un PTC situé à plus de 1000 nucléotides du dernier intron entraîne la dégradation de l ARNm (Maquat and Li, 2001). Ceci suggère également que les gènes ne comportant pas d intron ne sont pas assujettis au NMD. Cela a été vérifié dans le cas du gène HSP70 de souris ou encore pour le gène encodant l histone H4, pour lesquels l insertion de PTCs n entraîne pas de NMD, à moins d insérer un intron derrière le PTC, et ce à plus de 50 nucléotides (Maquat and Li, 2001). Enfin, lorsqu un intron est inséré en aval du codon de terminaison physiologique, ce dernier est alors reconnu comme prématuré et l ARNm est dégradé (Zhang et al., 1998a; Zhang et al., 1998b; Thermann et al., 1998; Neu-Yilik et al., 2001). Il existe au moins un exemple naturel où le codon stop authentique devient

17 Introduction 6 prématuré suite à des évènements d épissage alternatif en aval (Wilson et al., 1999). En effet, dans le cas de l ARNm de AUF-1, des variants peuvent être générés suite à l épissage alternatif des deux exons formant l extrémité non-traduite. Dans deux de ces transcrits alternatifs, il semble que la rétention d un intron en aval du codon de terminaison authentique (qui est alors situé à plus de 50 nts de l intron) le fasse devenir prématuré et que les transcrits soient alors assujettis au NMD (Wilson et al., 1999) Pour que l intron puisse promouvoir la reconnaissance du PTC, il doit être épissé : lorsque les sites donneur et accepteur sont mutés et que l intron n est pas épissé, l ARNm nonsens n est plus dégradé (Carter et al., 1996; Thermann et al., 1998). De plus, un PTC chevauchant deux exons est reconnu seulement après l élimination de l intron, suggérant que le PTC est reconnu après l épissage (Zhang et al., 1998a). Toutes ces données, en plus de la règle de position, ont conduit à l hypothèse que l épissage laisse une marque après l élimination de l intron de l ARNm mature. Le Hir et al. ont mis en évidence, à l aide d une stratégie de couplage des protéines sur l ARNm, un complexe protéique qui se dépose au niveau des jonctions exon-exon (Le Hir et al., 2000a). Des expériences de protection à la RNAse H par le même groupe ont montré que la liaison de ce complexe ne dépendait pas de la séquence mais plutôt de la distance par rapport à la jonction (Le Hir et al., 2000b).

18 Introduction 7 Figure 1 : Rôle de l épissage dans la reconnaissance du codon stop prématuré. (A) La règle de position stipule que lorsqu un codon de terminaison est situé à plus de 50 nucléotides en amont de la dernière jonction exon-exon, alors il est reconnu comme prématuré (PTC) et l ARNm est dégradé par NMD. Lorsque le codon de terminaison est situé à moins de 50 nucléotides de la dernière jonction ou dans le dernier exon (Ter), l ARNm ne sera pas dégradé et il y aura arrêt de la traduction. (B) Un complexe protéique de 335kDa est déposé en amont des jonctions exon-exon lors de l épissage du pré-arnm. Ce EJC ( exon-exon junction complex ) favorise l export de l ARNm via l interaction entre REF et TAP/p15, qui va à son tour interagir avec des composants du pore nucléaire (NPC). Dans le cytoplasme, seules les protéines Y14, Magoh, hupf3 et RNPS1 restent associées à l ARNm. Le EJC semble être le lien qui manquait entre l épissage, l exportation et la reconnaissance du PTC. Adapté de Le Hir et al., 2003.

19 Introduction Le EJC (exon-exon junction complex). Le EJC (pour exon-exon junction complex ), un complexe protéique de 335 kda, se lie 20 à 24 nucléotides en amont des jonctions exon-exon (Figure 1B; Le Hir et al., 2000a). Il n est pas nécessaire à l épissage ou à la relâche des ARNm du spliceosome, il aide au transport en recrutant la protéine TAP et interagit avec deux facteurs du NMD, hupf2 et hupf3 (Le Hir et al., 2001b). Les travaux de Le Hir et al. (2001) et d autres groupes ont permis d identifier les composantes du EJC. Le complexe comprend des protéines favorisant l épissage comme SRm160 (Blencowe et al., 1998) et DEK (McGarvey et al., 2000), ainsi que RNPS1 qui est un activateur général agissant en synergie avec les protéines SR (Lykke-Andersen et al., 2001). Aly/REF est une protéine qui interagit avec l hétérodimère TAP/p15 qui va permettre l exportation de l ARNm en se liant aux composantes du pore nucléaire (Le Hir et al., 2001b). La protéine Y14 a été identifiée lors d une recherche par double hybride des partenaires de RanBP5 (Ran binding protein 5; Kataoka et al., 2000). Y14 immunoprécipite avec des complexes mrnp différents de ceux obtenus par immunoprécipitation avec les hnrnps : ces complexes contiennent des ARNm matures sur le point d être exportés car liés à TAP (Kataoka et al., 2000). Y14 est l homologue de la protéine Tsunagi de D. melanogaster qui interagit avec Mago nashi et sert à la localisation de l ARNm Oskar (Mohr et al., 2001). L homologue humain Magoh a également été identifié comme un des composants du EJC (Le Hir et al., 2001a). Le EJC est dynamique puisque seules Y14, Magoh et RNPS1 restent liées à l ARNm tandis que les autres protéines se dissocient avant l exportation ou juste après (Figure 1B). Le EJC permet de garder une trace des événements nucléaires qui se sont produits sur un ARNm et fournit le lien qui manquait entre l épissage, l exportation et la traduction. Le EJC semble en effet être la marque qui signale à la cellule qu un codon de terminaison est prématuré ou non, puisque d une part, hupf3 est associée au EJC dans le noyau (Gehring et al., 2003; Singh and Lykke-Andersen, 2003) et dans le cytoplasme et que d autre part, la liaison de Y14 ou RNPS1 dans le 3 UTR d un ARNm de la β-globine entraîne la dégradation par NMD de celui-ci (Gehring et al., 2003; Lykke-Andersen et al., 2001). La figure 1B décrit schématiquement les protéines du complexe qui s associent au cours de

20 Introduction 9 l épissage en amont des jonctions exon-exon, et aident à l exportation de l ARNm en recrutant TAP/p15. Dans le cytoplasme, le EJC est réarrangé. Lors de la traduction, les protéines restantes dont Y14 sont enlevées de l ARNm (Dostie and Dreyfuss, 2002) Le complexe de surveillance Un mécanisme conservé. Le NMD a été observé chez tous les organismes eucaryotes (Tableau 1). Chez la levure S. cerevisiae, la perte de fonction des protéines Upf1 à 3 ( up-frameshift ) stabilise les transcrits nonsens sans affecter la demi-vie des transcrits normaux (Cui et al., 1995). Les mutants upf - chez la levure poussent plus lentement et la fonction mitochondriale semble affectée (Culbertson and Leeds, 2003). Sept gènes smg (pour suppressor with morphogenetic defects on genitalia ) ont été identifiés chez C. elegans, chacun d eux étant requis pour la dégradation des ARNm nonsens par le NMD (Hodgkin et al., 1989). Comme leur nom l indique, les mutants Smg-/- sont viables mais présentent des anomalies au niveau du développement des organes génitaux mâle et femelle (Hodgkin et al., 1989). SMG-2, SMG-3 et SMG-4 sont les orthologues respectifs de Upf1p, Upf2p et Upf3p (Tableau 1). Les facteurs SMG sont divisés en 2 classes (Mango, 2001) : ceux qui sont requis pour la phosphorylation de SMG-2 par SMG-1 (SMG-3 et SMG-4) ou ceux qui favorisent la déphosphorylation de SMG-2 (SMG-5 à 7). Chez la levure, Upf1p ne semble pas phosphorylée.

21 Introduction 10 Tableau 1 : Les protéines associées au nonsense-mediated mrna decay chez différents organismes eucaryotes. H. sapiens C.elegans M. musculus S. cerevisiae Fonction prédite/domaines putatifs hupf1 SMG-2 Rent-1 Upf1p Activités hélicase et ATPase, liaison à l ARN hupf2 SMG-3 Rent-2 Upf2p Domaine 4GH hupf3a/hupf3b (ou hupf3x) SMG-4 Non identifié Upf3p Signaux d import et d exportation nucléaires; domaines de liaison à l ARN hsmg-1 SMG-1 Non identifié Non identifié Protéine reliée aux kinases phosphatidylinositol; phosphoryle hupf1 hsmg-5 SMG-5 Non identifié Non identifié Déphosphorylation de hupf1; interagit avec PP2Ac hsmg-6 SMG-6 Non identifié Non identifié Déphosphorylation de hupf1 hsmg-7 SMG-7 Non identifié Non identifié Déphosphorylation de hupf1; interagit avec PP2Ac Chez l homme, l orthologue de Upf1p a été identifié en premier (Perlick et al., 1996). hupf2 et les protéines hupf3 ont par la suite été identifiées par recherche d homologie dans les banques de données par plusieurs groupes (Mendell et al., 2000; Lykke-Andersen et al., 2000; Serin et al., 2001). Des orthologues aux protéines SMG-1 et SMG-5 et 7 de C. elegans ont récemment été caractérisés (Chiu et al., 2003; Denning et al., 2001; Yamashita et al., 2001). La perte de Rent-1 (Upf1) chez la souris est incompatible avec le développement embryonnaire à partir du stade d implantation (Medghalchi et al., 2001). Bien que le NMD soit un mécanisme conservé que l on retrouve chez tous les eucaryotes, le processus se complexifie au cours de l évolution (Culbertson and Leeds, 2003). Le nombre de facteurs impliqués dans la surveillance des ARNm augmente et le phénotype des mutants devient létal chez les mammifères.

22 Introduction Les protéines Upfs. hupf1 a été la première protéine du complexe de surveillance à avoir été identifiée chez l homme (Perlick et al., 1996; Sun et al., 1998). Elle est exprimée dans tous les tissus mais à des niveaux différents (Perlick et al., 1996). Les protéines humaine et de levure sont conservées sur la région centrale (80% de similarité) mais les extrémités N- et C-terminales divergent (Perlick et al., 1996). hupf1, comme Upf1p, possède une fonction ATPase, une activité hélicase ainsi qu une activité de liaison aux NTPs (Bhattacharya et al., 2000; Pal et al., 2001). L ATP est un cofacteur qui module la liaison de hupf1 à l ARN (Bhattacharya et al., 2000). La mutation R844C inactive la fonction hélicase et confère un effet dominant négatif à la protéine, ce qui a pour effet de stabiliser les ARNm nonsens lorsque ce mutant est transfecté dans des cellules (Sun et al., 1998). hupf1 est une protéine localisée principalement dans le cytoplasme (Lykke-Andersen et al., 2000) mais un traitement à la leptomycine B sur des cellules HeLa entraîne une accumulation de hupf1 dans le noyau, suggérant qu elle est en fait une protéine navette (Mendell et al., 2002). De plus, chez l homme, hupf1 est phosphorylée par la protéine hsmg-1 (Yamashita et al., 2001; Pal et al., 2001). hupf2 a été caractérisée en 2000 par plusieurs groupes (Lykke-Andersen et al., 2000; Mendell et al., 2000; Serin et al., 2001). Elle est exprimée à des niveaux différents selon le tissu examiné (Mendell et al., 2000). Elle est localisée dans le cytoplasme mais se concentre autour du noyau. (Lykke-Andersen et al., 2000). hupf2 possède un domaine d interaction avec hupf1 dans sa partie C-terminale, un domaine d interaction avec hupf3 dans la partie N-terminale ainsi que plusieurs domaines présentant une homologie avec des facteurs d initiation de la traduction (Mendell et al., 2000; Serin et al., 2001). Ces domaines ont été nommés 4GH (pour eif4g homology ; Mendell et al., 2000) et le deuxième domaine interagit avec eif4a, Sui1 et hprt1 (deux composants de eif3; Figure 2).

23 Introduction 12 Figure 2: Le domaine 4GH de hupf2. Les domaines 4GH permettent l interaction de eif4g avec eif4e, eif4a et PABP; et ainsi la formation d une structure particulière de l ARNm qui permet l interaction indirecte entre le 5 et l extrémité 3 poly(a). L ARNm est protégé des exonucléases présentes dans le cytoplasme. Le modèle proposé par Mendell et al., 2000 suggère que hupf2 viendrait perturber ces interactions via son domaine 4GH. Adapté de Mendell et al., Deux protéines homologues à Upf3p de levure ont été identifiées chez l homme (Lykke- Andersen et al., 2000; Serin et al., 2001): hupf3a (ou hupf3) et hupf3b (ou hupf3x), le gène codant pour cette dernière étant situé sur le chromosome X (Serin et al., 2001). Les deux gènes présentent des variants suite à de l épissage alternatif (Serin et al., 2001; Ohnishi et al., 2003) Ces deux protéines sont nucléaires mais une petite fraction est clairement visible dans le cytoplasme (Lykke-Andersen et al., 2000). Des expériences réalisées sur des hétérokaryons ont permis de montrer que les hupf3s sont des protéines navettes (Lykke-Andersen et al., 2000; Serin et al., 2001). Enfin, plusieurs groupes ont

24 Introduction 13 démontré que ces protéines étaient le lien manquant entre le EJC et le NMD. En effet, hupf3 s associe au EJC dans le noyau et le cytoplasme (Kim et al., 2001; Singh and Lykke-Andersen, 2003) Assemblage séquentiel du complexe de surveillance. Plusieurs groupes ont développé des systèmes permettant de lier les protéines dans le 3 UTR des ARNm, afin de reconstituer les effets du complexe de surveillance (Lykke- Andersen et al., 2000; Lykke-Andersen et al., 2001; Gehring et al., 2003). Les protéines d intérêt sont fusionnées à des peptides viraux (enveloppe de MS2 ou peptide λn) et les séquences de liaison à ces peptides sont insérées dans le 3 UTR d un minigène normal de la β-globine (Lykke-Andersen et al., 2000; Lykke-Andersen et al., 2001; Gehring et al., 2003). Lorsque les protéines fusionnées sont exprimées dans les cellules, elles se lient aux séquences insérées dans le 3 UTR et lorsqu elles font partie du complexe de surveillance, elles entraînent la dégradation du minigène de la β-globine. Cette technique a été utilisée pour montrer que les protéines hupf1, hupf2 et hupf3s, ainsi que Y14 et RNPS1 étaient directement impliquées dans la reconnaissance des PTCs et les évènements subséquents (Lykke-Andersen et al., 2000; Lykke-Andersen et al., 2001; Gehring et al., 2003). Lors de l épissage du pré-arnm dans le noyau, le EJC composé des protéines SRm160, Aly/REF, DEK, Y14, Magoh et RNPS1 est déposé 20 à 24 nucléotides en amont des jonctions exon-exon (Figures 1B et 3). La protéine hupf3 est recrutée à un stade plus tardif de l épissage, probablement via une interaction avec Y14 et RNPS1 (Lykke-Andersen et al., 2001; Gehring et al., 2003). L ARNm mature est exporté hors du noyau grâce au recrutement de TAP/p15 par Aly/REF. Une fois dans le cytoplasme, seules les protéines RNPS1, Y14, Magoh et hupf3 restent associées à l ARNm. hupf2 s associe possiblement à hupf3 à la périphérie du noyau. On suppose que lors de la traduction, le ribosome enlève les EJCs. Lorsque le ribosome s arrête au niveau d un codon stop, hupf1 est probablement recrutée via les facteurs de terminaison de la traduction erf1 et erf3 (Czaplinski et al., 1998) et son interaction avec le EJC via hupf2 va déclencher la dégradation de l ARNm.

25 Introduction 14 Lorsque le codon de terminaison est localisé dans le dernier exon, il ne reste plus de EJC en aval et il y a terminaison de la traduction, sans dégradation de l ARNm. Figure 3: Le EJC recrute le complexe de surveillance. Le EJC est déposé sur l ARNm lors de l épissage dans le noyau. Les protéines Y14 et RNPS1 recruteraient le facteur hupf3. La protéine hupf2 se lie probablement à hupf3 après l exportation de l ARNm dans le cytoplasme. Lors de la traduction, les ribosomes déplacent les EJCs liés au niveau des jonctions exon-exon. Lorsque le ribosome rencontre un codon de terminaison, il s arrête et les facteurs de terminaison de la traduction erf1 et erf3 sont recrutés, avec hupf1. L interaction de hupf1 avec le EJC via hupf2 déclencherait la dégradation de l ARNm.

26 Introduction Le cycle de phosphorylation/déphosphorylation de hupf1 est médié par les protéines hsmg. Certains facteurs de NMD chez C. elegans n ont pas été retrouvés chez la levure Saccharomyces cerevisiae, suggérant que le processus s est complexifié au cours de l évolution. En revanche, plusieurs facteurs SMG ont été identifiés chez l homme et régulent le niveau de phosphorylation de hupf1, comme c est également le cas chez le nématode. Les PIKs ( phosphatidyl-inositol kinase ) présentent une sous-famille, caractérisée par des protéines de haut poids moléculaire et agissant comme des sérine-thréonine kinases plutôt que comme des kinases à lipides. Cette sous-famille est divisée en trois sous-groupes : celui des protéines ATM/ATR/RAD3, qui agissent dans les sentiers de réponses aux dommages à l ADN; le groupe des cibles de la rapamycine qui agissent dans la réponse traductionnelle aux signaux mitotiques; et le groupe des DNA-PKcs qui fonctionnent dans la réparation des cassures d ADN générées lors de la méiose et de la recombinaison des segments V(D)J (Denning et al., 2001). Les caractéristiques de cesmg-1 la désignent comme un nouveau groupe de cette sous-famille des PIKs. Une protéine d environ 340-kDa a été identifiée chez l homme par son homologie avec les protéines des différents sous-groupes des protéines apparentées aux PIKs et avec cesmg-1. L ARNm est exprimé dans la majorité des tissus humains à des niveaux variables (Denning et al., 2001). hsmg-1 possède une activité intrinsèque de phoshorylation, sensible à l action de la wortmannin ou de la caféine (Denning et al., 2001; Yamashita et al., 2001). De plus, hsmg-1 phosphoryle hupf1 in vitro et in vivo sur au moins quatre sérines (Denning et al., 2001; Yamashita et al., 2001). Lorsque hsmg-1 est surexprimée dans des cellules HeLa, un minigène nonsens de la β- globine est davantage dégradé (Yamashita et al., 2001). De plus, hsmg-1 coimmunoprécipite avec les protéines hupfs, suggérant fortement que la protéine a un rôle dans le NMD, via la phosphorylation de hupf1 (Yamashita et al., 2001). Il est intéressant de noter que chacun des groupes de la sous-famille des protéines apparentées aux PIKs joue un rôle dans la surveillance des étapes fondamentales de

27 Introduction 16 l expression génique, que ce soit au niveau de la surveillance de l intégrité structurale de l ADN (ATM, ATR et DNA-PK), de la régulation de l initiation de la traduction (les cibles de la rapamycine) ou dans le cas de hsmg-1, dans la surveillance des ARNm. Chez le nématode, les protéines cesmg-5 à -7 sont impliquées dans la déphosphorylation de SMG-2 (l orthologue de hupf1). Suite à l analyse des banques de données, des protéines présentant une similarité avec ces dernières ont été identifiées (Chiu et al., 2003; Ohnishi et al., 2003). hsmg-5 et -7 semblent jouer un rôle dans la déphosphorylation de hupf1 (Ohnishi et al., 2003). En effet, les deux protéines forment un complexe avec la forme phosphorylée de hupf1, et s associent avec la phosphatase PP2A et notamment avec sa sous-unité catalytique (PP2Ac). Un mutant de hupf1, auquel il manque la partie N- terminale, interagit moins avec hsmg-5 et est présent sous une forme hyperphosphorylée. D autre part, des mutants de hsmg-5 augmentent la quantité de hupf1 phosphorylée. Une surexpression de ces mêmes mutants diminuent la dégradation par NMD de minigènes nonsens de la β-globine (Ohnishi et al., 2003). Seule une fraction de hupf1 est présente sous une forme phosphorylée, suggérant que la phosphorylation de la protéine est une étape limitante. De plus, une phosphorylation et une déphosphorylation séquentielles semblent être requises pour le NMD. Ce cycle régule très probablement le remodelage du complexe de surveillance (Figure 4). En effet, des données récentes ont montré que hupf1 sous sa forme phosphorylée s associe préférentiellement avec hupf2 et hupf3a L (la forme longue de hupf3a obtenue par épissage alternatif), tandis qu un deuxième complexe consiste en hupf1 phosphorylée, hsmg-5 et 7, PP2Ac et hupf3a S (la forme courte de hupf3a; Ohnishi et al., 2003; Schell et al., 2003). D autre part, la phosphorylation de hupf1 semble modifier sa localisation dans la cellule. En effet, hupf1 phosphorylée est retrouvée sur les polysomes, tandis que la protéine est libre dans le cytoplasme sous sa forme hypophosphorylée (Pal et al., 2001).

28 Introduction 17 Figure 4 : Le remodelage des complexes hupf1 dépend de son état de phosphorylation. hupf1 est phosphorylée par hsmg-1 et est alors associé à hupf2 et la forme longue de hupf3a (hupf3a L ). hsmg-5 et -7, avec la sous-unité catalytique de PP2A (PP2Ac) vont déphosphoryler hupf1. Ce deuxième complexe contient hupf3a s. Adapté de Schell et al., 2003 et Ohnishi et al., Controverse concernant la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères. Chez S. cerevisiae, le NMD est considéré comme cytoplasmique (Czaplinski et al., 1999). La situation est moins claire chez les mammifères. Ainsi, la localisation subcellulaire du NMD est une question sujette à controverse depuis quelques années sur la base des résultats contradictoires obtenus dans différents systèmes.

29 Introduction Identification du site de dégradation par fractionnement des cellules. Afin d identifier dans quel compartiment avait lieu la dégradation des ARNm nonsens, des expériences de fractionnement ont été réalisées sur des cellules transfectées avec des minigènes contenant des PTCs (Belgrader et al., 1994; Zhang et al., 1998b; Thermann et al., 1998). Dans la très grande majorité des cas qui ont été étudiés chez les mammifères, la dégradation des ARNm nonsens est observable dans la fraction nucléaire (Maquat, 1995). Trois exceptions ont été rapportées pour lesquelles la diminution des ARNm nonsens est visible dans la fraction cytoplasmique, sans aucun effet au niveau du noyau. C est le cas de l ARNm de GPx1 (glutathione peroxidase 1), une sélénoprotéine (Moriarty et al., 1998); de l ARNm HexA, responsable de la maladie de Tay-Sachs (Rajavel and Neufeld, 2001); et de l ARNm de la β-globine lorsqu il est exprimé dans des cellules érythroïdes de patients ou dans des souris transgéniques (Lim et al., 1989; Lim et al., 1992) Le NMD dépend de la traduction. Les structures connues capables de lire le code génétique sont les ribosomes au cours de la traduction. Lorsque la traduction est inhibée, les ARNm nonsens sont stabilisés. Cette inhibition peut se faire de différentes façons : par l introduction d une structure secondaire dans le 5 UTR de l ARNm (Belgrader et al., 1993), par l ajout dans le milieu d ARNt suppresseurs qui vont permettre l incorporation d un acide aminé et introduire ainsi une mutation faux-sens (Belgrader et al., 1993), par le traitement des cellules à l aide de diverses drogues inhibant la traduction comme par exemple le cycloheximide, l anisomycine ou la puromycine (Noensie and Dietz, 2001). De plus, certains ARNm nonsens dont le PTC est localisé dans la partie proximale ne sont pas dégradés du fait de la réinitiation de la traduction à un AUG proche. Le fait que les ARNm nonsens soient stabilisés partiellement quand la traduction est inhibée suggère donc que cette dernière joue un rôle important dans la dégradation des ARNm. Un des dogmes de la biologie cellulaire veut que la traduction ait lieu dans le cytoplasme des cellules, lorsque les deux sous-unités ribosomales sont assemblées. Cependant, ce rôle de la traduction dans le NMD est en contradiction avec les résultats obtenus sur les cellules fractionnées (voir paragraphe précédent).

30 Introduction Importance des évènements nucléaires dans la dégradation des ARNm nonsens. La discrimination entre un PTC et un codon de terminaison physiologique repose sur la position du codon stop par rapport à l intron distal. Le dépôt du EJC au niveau des jonctions exon-exon au cours de l épissage permet à la cellule de garder une trace de la position des introns dans le cytoplasme, et ainsi de déterminer si le codon stop est prématuré ou non, comme vu précédemment. En plus du rôle de l épissage (qui se déroule dans le noyau), d autres observations suggèrent l importance de ce compartiment pour le NMD. En effet, il a été montré que dans certains cas, le PTC peut influencer les événements de maturation du pré-arnm (Muhlemann et al., 2001) Le PTC peut influencer la maturation du pré-arnm. Le PTC semble inhiber l épissage du pré-arnm dans le cas des immunoglobulines ou du TcR (Aoufouchi et al., 1996; Muhlemann et al., 2001). En effet, dans le cas de la chaîne légère κ des immunoglobulines, la diminution des ARNm nonsens dans le cytoplasme semble attribuable à une diminution du taux d ARNm épissé dans le noyau (Aoufouchi et al., 1996). Des expériences de transcription et d épissage dans un système cell-free suggèrent que l épissage est inhibé en présence d un PTC. Cependant, ce phénomène serait restreint aux chaînes légères κ puisque lorsque l expérience est répétée sur un minigène de la β-globine, aucune inhibition de l épissage n est observée (Aoufouchi et al., 1996). Des résultats similaires ont été obtenus sur des cellules HeLa transfectées avec des minigènes de la chaîne lourde µ des immunoglobulines et du TcR β (Muhlemann et al., 2001). Il a été montré par hybridation fluorescente in situ (FISH) et protection à la ribonucléase (RPA) que les pré-arnm nonsens de ces deux types de minigènes s accumulent proche du site de transcription (Muhlemann et al., 2001). Cette accumulation de transcrits non épissés cause une diminution nucléaire du taux d ARNm matures PTC+. Cet effet est spécifique à la présence du PTC puisqu une mutation faux-sens ou une insertion de nucléotides qui restaure le cadre de lecture ne causent pas d accumulation du pré-arnm. Ces exemples

31 Introduction 20 suggèrent donc que le PTC peut avoir des conséquences sur la maturation des ARNm, suggérant qu il peut être reconnu au niveau du noyau (Wilkinson and Shyu, 2002) Effet du PTC sur l épissage : le nonsense-associated altered splicing (NAS). Dans certains cas, l exon contenant le PTC est éliminé de l ARNm mature, un phénomène appelé nonsense-associated altered splicing (NAS). Le choix des sites d épissage pourrait être influencé par le cadre de lecture, afin de favoriser le transcrit pour lequel la traduction se termine au codon habituel, comme suggéré par les études réalisées sur l ARNm de la fibrilline (FBN1; Dietz et al., 1993; Dietz and Kendzior, 1994). Le NAS pourrait ainsi procurer un avantage sélectif aux cellules, lorsque la protéine qui est synthétisée retient une activité résiduelle. Le PTC serait reconnu dans le noyau par un mécanisme hypothétique de scanning (Figure 5A; Cartegni et al., 2002; Dietz and Kendzior, 1994; Urlaub et al., 1989). La notion de scanning nucléaire est cependant en contradiction avec le dogme qui stipule que l épissage a lieu dans le noyau, tandis que la reconnaissance des codons se passe dans le cytoplasme au cours de la traduction. Des études réalisées sur d autres transcrits ont mené à une autre explication, qui semble plus logique : le PTC peut entraîner l élimination de l exon le contenant en altérant des séquences agissant en cis sur l épissage (Cartegni et al., 2002). Le NAS contrairement au NMD peut être indépendant de la traduction : des mutations du décalage du cadre de lecture ou nonsens, aussi bien que des mutations faux-sens et silencieuses peuvent affecter la rétention de l exon dans l ARNm mature. Ces mutations affaiblissent des ESEs (pour exonic splicing enhancer ), qui sont des séquences courtes et dégénérées servant de sites de liaison aux effecteurs de l épissage comme les protéines SR (Blencowe, 2000). L étude de l exon 18 de l ARNm de BRCA1 a notamment montré que le PTC altérait un ESE, ce qui résultait en l élimination de l exon 18 d un minigène (Liu et al., 2001). La mutation Y2113X cause l élimination de l exon 51 de l ARNm de FBN1 (Dietz et al., 1993; Dietz and Kendzior, 1994). Les trois codons nonsens à la position 26 de l exon 51 causent son élimination d un minigène, tandis qu une mutation faux-sens n a pas