T A N D E M. C. Molette UMR 1289 : INRA/INP-ENSAT/ENVT

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1 T A N D E M C. Molette UMR 1289 : INRA/INP-ENSAT/ENVT

2 Pourquoi étudier le protéome? Protéome, produit final du génome

3 Pourquoi étudier le protéome?

4 Pourquoi étudier le protéome? Nombre de protéines dans la cellule: Un défi impossible? Abondance très variable: Expression élevée : Expression modérée : Expression faible :

5 Pourquoi étudier le protéome? Transcriptomique : raccourci insuffisant pour l étude de la génomique fonctionnelle

6 Différents outils disponibles 1 Méthodes séparatives : a) chromatographie bidimensionnelle b) électrophorèse mono ou bidimensionnelle 2 Méthodes d identification : a) MALDI-TOF-MS b) LC-ESI-MS 3 Autres approches : SELDI-TOF

7 Deux types d approches distinctes Cartographie protéique d un tissu, d une cellule, fraction cellulaire Recenser toutes les protéines visibles Comparaison de l expression protéique dans plusieurs situations Recenser les protéines différentiellement exprimées

8 Etapes du processus analytique 1. Séparation des biomolécules d intérêt Extraction de l échantillon protéique Isolation d organite Fractionnement +/- fin... Electrophorèse bi-dimensionnelle ou autres méthodes de séparation 2. Caractérisation moléculaire Détection Identification des protéines Profils d expression différentielle

9 1- Méthodes séparatives Différents types de fractionnement des protéines

10 Quelques rappels sur la structure et les propriétés des protéines Structure primaire: enchaînement des acides aminés Poids moléculaire et point isoélectrique Structure secondaire: interactions entre différents groupes chimiques des acides aminés hydrophobicité Structure tertiaire: repliement de la protéine suite aux contraintes imposée par la structure secondaire Hydrophobicité et poids apparent Structure quaternaire: association de plusieurs sous-unités protéiques

11 Différents types de fractionnement - Séparation d organites cibles poids de l organite - Tampons de différentes forces ioniques solubilité/extractabilité - Chromatographie hydrophobicité, poids apparent - Précipitation avec le sulfate d ammonium solubilité - Immuno - précipitation protéine spécifique

12 Séparation des organites par centifugation Rupture de la membrane plasmatique pour préparer le tissu/ l homogénat cellulaire: Sonification Homogénisation du tissu Choc osmotique ( Molecular cell biology. Lodish. Fig 5-23)

13 Séparation fine des organites sur gradient de sucrose Comment vérifier la purité? Marqueurs spécifiques : Cytchrome c, mitochondrie Catalase, péroxisome Estérase, microsomes (Lodish fig 5-24)

14 Différents types de fractionnement extractabilité Low Ionic Strength (LIS): 0.05M tampon phosphate, ph = 7.3 Protéines cytoplasmiques (sarcoplasmiques) High Ionic Strength (HIS): 0.05M tampon phosphate, 0.55M KCl, ph = 7.3 Protéines myofibrillaires Culot: 0.01M tampon phosphate, 0.075M KCl, 2mM MgCl 2, ph = 7 Protéines cytosquelettiques D après Rathgeber et al., 1999

15 Tris-Cl 10 mm ph 7,5 Différents types de fractionnement chromatographie Rinçage Elution 1,5 M NaCl 0,5 M NaCl 0,15 M NaCl Protéines à pi acides et neutres D après Borderies et al., 2003

16 Différents types de fractionnement Précipitation fractionnée Sulfate d ammonium: 10 à 80% Pas de 10% de sulfate d ammonium Récupération du précipité et analyse électrophorétique Fractionnement en fonction de l hydrophobicité des protéines

17 1- Méthodes séparatives Electrophorèse bidimensionnelle

18 Méthodologie globale suivie pour une analyse protéomique Condition A Condition B Séparation extraction A B 1 ière dimension IPG strips ph MW 2 nd dimension A Coloration B Analyse d image Excision des spots d intérêt A B Spectrométrie de masse & Identification des protéines D après Panday et Mann, 2000

19 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Quel est l objectif de cette étape? Séparer les protéines en fonction de leur point isoélectrique Quelles conditions doivent satisfaire les protéines avant la séparation électrophorétique? protéines solubles dans l eau quantité de sels < 1 mm filtration concentration des protéines > 2 mg/ml filtration ou précipitation

20 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Préparation des protéines OBJECTIFS Prévenir toutes modifications artéfactuelles des polypeptides dans le milieu de solubilisation Maintenir les protéines en solution pendant tout le processus de 2-DE Éliminer toutes substances inférant (ex. les sels) Eventuellement concentrer des protéines

21 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Solubilisation des protéines CHAPS Détergent non ionique Urée/thiourée Agent chaotrope Dithiotréitol (DTT) Ampholyte: améliore la migration en 1 ière dimension

22 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Ex. de composition de la solution Chaotropes: 8M Urée 2M Thiourée/ 7M Urée Détergents: 4% CHAPS 2 % CHAPS / 2 % SB-14 Agents réducteurs: 65 mm DTE (dithioerythritol) 100 mm DTT ( dithiothreitol) 2 mm tributyl phosphine Ampholytes 2%

23 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Principe de IPG: Immobilized ph gradients (IPGs) Le gradient de ph est généré par un petit nombre (6-8) de molécules définies (immobilines) qui ont co-polymérisées avec la matrice d acrylamide. Fabrication de n importe quel gradient de ph (large, étroit, très étroit) etre ph 3 et 12. Capacité de dépôt plus élevée. Méthode de référence pour la séparation des protéines en 1 ière dimension.

24 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Strips individuels: 24, 18, 11, 7 cm de long 3 mm de large 0.5 mm d épaisseur Choix du strip

25 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Quelle quantité de protéines peut-on déposer? Pour un strip de 18 cm: Analytique : µg Micropréparatif : mg

26 1 ière dimension = isoélectrofocalisation Migration des protéines Deux étapes: - Réhydratation du strip (min 12h) - migration des protéines (~ 8-10h) Caractéristiques de la migration: Voltage élevé: de 50V à V Ampérage très faible: max 50 µa/strip Cumul: ~ Vh Température constante 20 C

27 2 nde dimension = SDS-PAGE Quel est l objectif de cette étape? Séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire Quelles conditions doivent satisfaire les protéines avant la séparation électrophorétique? même charge électrique pour toutes les protéines

28 2 nde dimension = SDS-PAGE Réalisation du gel Principaux composants: Acrylamide taille de la maille du réseau Bis-acrylamide réticulation du réseau Sodium dodecylsulfate (SDS) charge négative

29 2 nde dimension = SDS-PAGE Préparation des strips Principaux composants de la solution de base: SDS Charge négative sur toutes les protéines Urée Rupture des liaisons hydrogène Etape 1: DTT Réduction des ponts disulfures Etape 2: Iodoacétamide carbaminométhylation des cystéines

30 2 nde dimension = SDS-PAGE Migration des protéines Deux étapes: - pénétration des protéines (~ 15 min) - migration des protéines (~ 5 h) Caractéristiques de la migration: Ampérage constant 35mA/gel Température constante 8-10 C

31 1- Méthodes séparatives Détection des spots sur les gels

32 Détection des spots Méthodes classiques de détection Analyse différentielle Méthode de détection spécifique pour les modifications post-traductionnelles

33 Méthodes classiques de détection Coloration avec des colorants organiques ou nitrate d argent Bleu de Coomassie (R and G) Argent Marquage radio-actif Fluorescence

34 Méthodes classiques de détection Quelle coloration choisir? Nitrate d argent Bleu de Coomassie Fluorescence Sensibilité Homogénéité Linéarité Rapidité Compatibilité spectrométrie de masse

35 Avantages et limites des méthodes Chromatographie bidimensionnelle (+) méthode non destructive, les protéines sont intactes (+) reproductibilité (+) interface avec la spectrométrie de masse (-) couteux (-) compatibilité avec spectrométrie de masse limitee en fonction des détergents utilisés

36 Avantages et limites des méthodes Electrophorèse bidimensionnelle Résolution et séparation (+) on peut voir les phosphorylations, glycosylations (car focalisation) (-) la densité des spots doit rester raisonnable Gamme dynamique quantitative (-) concentrer les échantillons au max Spectre d analyse (-) protéines très basiques / haut PM sont difficiles a voir Reproductibilité (-) variabilités techniques et biologiques

37 Analyse différentielle Difference gel electrophoresis (DIGE) Multiplexed proteomics (MP) Isotope-coded affinity tagging (ICAT) Differential gel exposure

38 Analyse différentielle Difference gel electrophoresis (DIGE) Unlu, 1997, electrophoresis 18, 2071

39 Analyse différentielle Difference gel electrophoresis (DIGE)

40 Analyse différentielle Multiplexed proteomics (MP) Steinberg, 2001, Proteomics 1,

41 Analyse différentielle Isotope-coded affinity tagging (ICAT) Méthode très efficace pour identifier les protéines membranaires intactes Smolka, 2002, Mol Cell Proteomics 1, 19-29

42 Analyse différentielle Differential gel exposure Co-électrophorèse en 2-DE de 2 échantillons protéiques. Marquage In vivo en utilisant des isotopes tels que 14 C et 3 H Séparation par 2-DE. Transfert sur une membrane PVDF. Détection du ratio 3 H / 14 C en exposant la membrane à 2 plaques. Investigation des modifications du taux de synthèse de protéines individuelles Monribot-Espagne, 2002, Proteomics 2,

43 2- Méthodes d identification Analyse d image Identification des protéines d intérêt

44 Analyse d image Détection des spots présents Superposition des gels appartenant à un même groupe obtention d un master gel Comparaison qualitative et/ou quantitative des master gels protéines d intérêt

45 Logiciels couramment utilisés: Imagemaster 2D Platinum (GE Healthcare) Melanie III TM (Proteomic Solution) PDQuest (Biorad) Samespot (Progenesis) Decodon Autres fonctions: Quantification Alignement Comparaison Match Analyse d image Image synthétique à partir d un gel

46 Quelles protéines différentiellement exprimées? 1- Tout ou rien 2- Comparaison des profils protéiques a- Traitement des données brutes Normalisation/calibration/données manquantes b- Protéines différentiellement exprimées c- Interactions entre protéines

47 Méthodes d identification Identification des protéines selon leur composition en acides aminés après hydrolyse acide Identification des protéines par spectrometrie de masse Identification des protéines par séquençage des acides aminés

48 Méthodes d identification Principe = mesurer la masse molaire de biomolécules en les séparant en fonction de leurs rapports m/z avec une grande sensibilité et une bonne résolution. Possibilité de fractionner les chaines polypeptidiques au niveau des liaisons peptidiques ou au niveau des chaines latérales pour obtenir des informations sur la séquence ou la composition en acides aminés. La structure d'un spectromètre de masse : La source d'ionisation qui permet de produire des ions en phase gazeuse (de type MALDI ou ESI). L'analyseur qui permet de séparer les différents ions en fonction du rapport m/z. Le détecteur qui permet de convertir le courant ionique en courant électrique mesurable.

49 Identification des protéines d intérêt Les technologies disponibles 2 technologies principales Cartographie peptidique appareils de type MALDI-ToF-MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time of Flight Mass Spectrometer Fragmentation peptidique appareils de type LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography ElectroSpray Ionisation - MS / MS Un seul type de préparation des échantillons

50 Identification des protéines d intérêt Préparation des échantillons Objectif: Rendre disponible les protéines imbriquées dans le gel pour l identification Principales étapes: Nettoyage du gel Digestion de la protéine par une enzyme (trypsine) Elution des peptides obtenus

51 Identification des protéines d intérêt Préparation des échantillons Excision des spots d intérêt: Manuelle Automatique Digestion dans le gel: Etape de lavage Déshydratation et séchage Digestion avec la trypsine (50 ng trypsin, 37C 16h) Extraction des peptides Désallage et concentration des peptides

52 Identification des protéines d intérêt MALDI-ToF-MS

53 Identification des protéines d intérêt MALDI-ToF-MS Ionisation

54 Identification des protéines d intérêt MALDI-ToF-MS Temps de vol Principe : Accélération des ions de masse différente à une énergie cinétique uniforme Temps de vol différent pour parcourir une distance donnée Expulsion des ions de la source d ionisation par paquets Accélération sous une différence de potentiel Vs

55 Identification des protéines d intérêt MALDI-ToF-MS Liste des pics Recherche dans les bases de données Validation de l identification de la protéine

56 Identification des protéines d intérêt LC-ESI-MS/MS peptides Formation d une goutte Evaporation de la goutte Explosion Evaporation de l ion Analyseur 2 Chambre de collision Analyseur 1 Ion moléculaire

57 Identification des protéines d intérêt LC-ESI-MS/MS Liste des pics et séquence de certains peptides Recherche dans les bases de données Validation de l identification de la protéine

58 Comparaison des approches par MALDI-TOF et ESI-MS-MS MALDI-TOF MS Echantillon sur une plaque (matrice cristalline). Les spectres indiquent les masses des ions peptidiques. Identidication des protéines par empreinte de masse (mass fingerprinting). ESI-MS-MS Echantillon en solution (high performance liquid chromatography). Les spectres MS-MS montrent des fragmentations. Identification des protéines par des algorythmes de corrélation

59 Identification des protéines d intérêt Algorythmes et programmes 3 groupes principaux: - Programmes utilisant l empreinte peptidique pour l identification des protéines (PeptIdent, MultiIdent, ProFound); - Programmes opérant aussi pour les spectres MS/MS (PepSea, MASCOT, MS-Fit, MOWSE); - Programmes opérant uniquement pour les spectres MS/MS (SEQUEST, PepFrag, MS-Tag, Sherpa).

60 Identification des protéines d intérêt Bases de données disponibles - SWISS-PROT est une base de données de séquences annotées de protéines. Elle contient aussi des information sur la fonction de la protéine, les modifications post-traductionnelles ; - TrEMBL est un complément de SWISS-PROT, qui contient toutes les séquences protéiques traduites à partir de la séquence nucléotidique de la base de données EMBL; - PIR-International (Protein Identification Resource, National Biomedical Research Foundation, Washington, USA) est aussi une base de données avec des séquences annotées de protéines; - NCBInr (National Center of Biotechnological Information) est une base de données contenant les séquences traduites à partir des séquences d ADN de GenBank mais aussi des séquences issues des bases de données PDB, SWISS-PROT et PIR; - ESTdb (Expressed Sequence Tags database, NCBI, NIH). - programmes utilisés uniquement pour la MS/MS (SEQUEST, PepFrag, MS-Tag, Sherpa).