PROTEOME ET PROTEOMIQUE. Master M2 BBSG Octobre 2006

Transcription

1 PROTEOME ET PROTEOMIQUE Master M2 BBSG Octobre 2006

2 PROTEOME : ENSEMBLE COMPLET DES PROTEINES CODÉES PAR UN GÉNOME QUI PEUVENT ÊTRE EXPRIMÉES ET MODIFIÉES PAR UNE CELLULE, UN TISSU OU UN ORGANISME (WILKINS, 1996). 1 Génome N Protéomes STATIQUE DYNAMIQUE

3 PROTEOME : ENSEMBLE COMPLET DES PROTEINES CODÉES PAR UN GÉNOME QUI PEUVENT ÊTRE EXPRIMÉES ET MODIFIÉES PAR UNE CELLULE, UN TISSU OU UN ORGANISME (WILKINS, 1996). L analyse rapide et à grande échelle des protéomes est devenue possible grâce à : * Connaissance des génomes * Méthodes de séparation des protéines * Spectrométrie de Masse * Bioinformatique

4 Les informations..de l analyse du Protéome Aide à l Annotation des génomes peptides courts, exons/introns, épissage alternatifs, protéines hypothétiques.. Profils d expression Complémentarité Transcriptome Modifications post-traductionnelles phosphorylation, glycosylation Clivages N-et/ou C-terminaux Cofacteurs.. Interactions protéine-protéine et Complexes supra-moléculaires

5 Les informations.et les problèmes..de l analyse du Protéome Aide à l Annotation des génomes peptides courts, exons/introns, épissage alternatifs, protéines hypothétiques.. Profils d expression Complémentarité Transcriptome Modifications post-traductionnelles phosphorylation, glycosylation Clivages N-et/ou C-terminaux Cofacteurs.. Interactions protéine-protéine et Complexes supra-moléculaires Abondance des protéines Nombre et quantité Modifications post-traductionnelles Multiplicité Dynamique des protéomes

6 Les champs d études de l Analyse Protéomique

7 MÉTHODES DE FRACTIONNEMENT DES PROTÉINES Propriétés Charge Densité Hydrophobicité Interaction spécifique Technique Chromatographie échangeuse d ions Ultracentrifugation Chromatographie en phase inverse Chromatographie d affinité Point Isoélectrique Rayon de Stokes Electrofocalisation PAGE-SDS Chromatographie d exclusion Electrophorèse Bidimensionnelle

8 Electrophorèse bidimensionnelle 1 ère Dimension : séparation = f(pi) 2 ième Dimension : séparation = f(taille) Electrofocalisation suivie Electrophorèse en Milieu Dénaturant

9 1 ere Dimension : Electrofocalisation Migration des protéines dans un gradient de ph jusqu à ce qu elles rencontrent une zone de ph où elles sont électriquement neutres. ph=pi Sur Gel de polyacrylamide Gradient de PH induit par Immobilines gréffées de façon covalente à l acrylamide Immobiline DryStrips (GE Healthcare) ReadyStrip IPG strip (BioRad)

10 Dépôt de l échantillon protéique sur le Strip Ettan IPGphor 3 GE Healthcare Life Sciences Multiphor II Champs électrique 3500V à 8000 V Protean IEF Bio-Rad Les Protéines se répartissent le long du Strip selon leur pi

11 2 eme Dimension : PAGE-SDS Sodium dodecyl sulfate (SDS) Séparation en fonction de la taille Etape d Equilibration Urée, SDS, DTT Charge Proteines -

12 2 eme Dimension : PAGE-SDS Sodium dodecyl sulfate (SDS) Séparation en fonction de la taille uniquement car toutes les protéines seront chargées négativement Etape d Equilibration Urée, SDS, DTT Charge Proteines - Ettan DALT

13 Avantage Electrophorèse 2D versus 1D ph 3 PM Résolution : Séparation de 10 à 20 fois plus de protéines en 2D qu en 1D (+ de 2000 taches protéiques) ph 10

14 Comment arriver à une telle résolution? 1> Taille des gels (26x20cm) en gradient (8 18 %)

15 Comment arriver à une telle résolution? 1> Taille des gels (26x20cm) en gradient (8 18 %) 2> Caractéristiques du Strip (1ere dimension) Gradient de ph 0.04 U ph/cm Longueur des IPG Strips 1 U ph/cm

16 Résolution en Electrophorèse 2D Détection d isoformes 11 cm 11 cm 17 cm

17 Qualité de l échantillon protéique IMPORTANCE CAPITALE : De la QUALITE de l échantillon dépendra la RESOLUTION du GEL. But de la Préparation : Rompre les interactions covalentes (pont di-sulfure) et non covalentes entre les protéines et/ou les autres constituants cellulaires (lipides, acides nucléiques..). * Agents chaotropes : Urée, Thiourée * Détergents non-ioniques ou zwitterioniques (CHAPS, NP- 40, Triton X-100, SB3-8, octyl β D glucopyranoside ) * Agents Réducteurs : DTT, TBP Eliminer les molécules interférentes (sels, lipides, acides nucléiques..) * précipitation (TCA), dialyse Protection contre les modifications de l échantillon (protéolyse.) * basse température, inhibiteur. Adaptation en fonction de l échantillon

18 Adaptation en fonction de l échantillon ph 4 ph 7 Bactérie Mésophile sulfatoréductrice Tampon de solubilisation ph 4 ph 7 Bactérie Hyperthermophile thiosulfatoréductrice Urée 8M CHAPS 2% (w/v) DTT 50 mm IPG buffer 2% ph 4 ph 7 Bactérie Hyperthermophile thiosulfatoréductrice Urée 7M SB3-8 2% (v/v) Thiourée 2.5M TBP 1% (v/v) CHAPS 2% (w/v) IPG buffer 2% IGEPAL 2% (v/v)

19 Détection des protéines sur Gels 2D Questions à se poser : * Quelle est la méthode de visualisation? * Sensibilité critère important? * Quelle analyse ensuite (quantification, identification)? * Quels sont mes moyens financiers? Méthodes post-séparative Méthodes pré-séparative Bleu de coomassie Nitrate d argent Zn Marqueurs Fluorescent DIGE Sensibilité +++ Quantification +++ Financier ---

20 Détection des protéines sur Gels 2D * Quelle est la méthode de visualisation? Directe : BC, Nitrate d Argent Excitation : Fluorescence : SYPRO * Sensibilité critère important? Limite de détection Nitrate d argent (0.1ng) > Fluorescence (SYPRO Ruby) (1ng) > BC (5ng) * Quelle analyse ensuite (quantification)? Linéarité de la réponse (gamme dynamique) Fluorescence (SYPRO Ruby) (4) > BC (2-3) > Nitrate d argent (1.5) Compatibilité MS Fluorescence (SYPRO Ruby) > BC > Nitrate d argent * Quels sont mes moyens financiers? Coût Fluorescence (SYPRO Ruby) > Nitrate d argent > BC

21 Analyse Post-Séparative Techniques d identifications de protéines: Composition en AA Séquençage N terminal Spectrométrie de masse 3 Composantes : Source d ionisation Analyseur de masse (séparation m/z) Détecteur

22 Spectromètre de Masse = Combinaison de ces Composantes 2 sources d ionization : MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization ) Acide Sinapinique Acide 2-5 dihydroxybenzoique (Molécules aromatiques) * Co-cristallisation échantillon/matrice sur plaque * Haut voltage (20 kv) + Flash Laser sous vide * Sublimation de la matrice et relargage de l échantillon dans la phase gazeuse Ionization de l échantillon par protonation/ fixation de cation Séparation des espèces chargées Analyseur

23 Spectromètre de Masse = Combinaison de ces Composantes 2 sources d ionization : MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization ) Acide Sinapinique Acide 2-5 dihydroxybenzoique (Molécules aromatiques) ESI : Electrospray Ionization Milieu Liquide Source Electrospray :

24 Spectromètre de Masse = Combinaison de ces Composantes 2 sources d ionization : MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization ) Acide Sinapinique Acide 2-5 dihydroxybenzoique (Molécules aromatiques) ESI : Electrospray Ionization 4 types d analyseur de masse : Temps de vol (TOF) Triple Quadrupole Trappe Ionique Résonance cyclotronique par TF (FTICR)

25 Les Principaux Types de Spectromètres de Masse en Protéomique TOF Source MALDI Enregistrement du temps de vol de chaque espèce ionisée : «les petits ions volent plus vite que les gros» Détermination du rapport m/z pour chaque espèce Spectre de masse

26 Les Principaux Types de Spectromètres de Masse en Protéomique Champs de Radio Fréquence Ejection des espèces chargées par variation du voltage de RF Détecteur MS n Filtre de masse quadrupolaire Voltage AC/DC de polarité opposée S Source Electrospray Variation continu du voltage permet Le passage des espèces chargées Modification post-traductionnelle Détecteur MS/MS

27 Evolution de ce Matériel Précision et Sensibilité * miniaturisation de la source d ionisation (nanoesi) (qqs nl/min) * amélioration de la technologie pour augmenter la sensibilité : MALDI-TOF : femtomole ( molécules) ESI Q. : dizaine d attomole ( molécules) FT-ICR : zeptomole (600 molécules) (Fourier Transform - Ionic Cyclotronic Resonance) Protéome d 1 cellule Mais : problèmes de contamination Bruits chimiques des flacons, keratine..,

28 IDENTIFICATION Empreinte Peptidique «Peptide-Mass FingerPrinting» Identification

29 Protéomique Différentielle de D. vulgaris 30.0 A > Découpage du spot 14.4 ph 3 2> In-gel digestion Hydrolyse par la trypsine B > Analyse des peptides générés MALDI-TOF MS

30 Identification de la protéine d Intérêt Analyse du Spectre 1> Calibration Interne Peptides d autolyse de la Ti ( 842.5; ) 2> Détection des pics Rapport Signal/bruit

31 Identification de la protéine d Intérêt Liste de Masses

32 Identification de la protéine d Intérêt Traitement Bioinformatique Principe : Comparaison de la liste de masse expérimentale avec la liste de masse théorique de chaque protéine da la banque de données digérée par la Ti Logiciels par service web : PeptideSearch (EMBL) Profound (Université de Rockefeller) prowl.rockefeller.edu ProteinProspector (Université de Californie, San Francisco) prospector.ucsf.edu Logiciels en local: GPMAW (Lighthouse data) ProteinProspector (Université de Californie, San Francisco)

33 Identification de la protéine d Intérêt Traitement Bioinformatique

34 Identification de la protéine d Intérêt Traitement Bioinformatique Score : 1> % de recouvrement de séquence 2> Ecart de masse Expérimental/Théorique Liste de candidat

35 Identification de la protéine d Intérêt Traitement Bioinformatique

36 IDENTIFICATION Identification par «Peptide Sequence Tag» Stratégie : Obtention d éléments de séquence internes à 1 ou plusieurs peptides Spectrométrie de Masse en Tandem MS/MS Identification

37 Principe MS/MS Spectromètres de masse : ESI -Triple Quadrupole ESI -Trappe Ionique (PSD-MALDI-TOF) * Sélection de l ion de masse M dans le spectromètre * Fragmentation par collision (gaz neutre) Coupure de la liaison peptidique * Ions série b (N-terminal) Séquence-spécfique * Ions série y (C-terminal) Séquence-spécfique * Comparaison des spectres de masses des produits de fragmentation

38 Principe MS/MS Spectromètres de masse : ESI -Triple Quadrupole ESI -Trappe Ionique (PSD-MALDI-TOF) Eléments de séquence interne au peptide «Peptide Sequence Tag» Recherche en banque d une protéine qui contiendrait : 1 peptide de masse M ayant une séquence interne X-X-X-X-X IDENTIFICATION

39 Identification par MS/MS Spectromètres de masse : ESI -Triple Quadrupole ESI -Trappe Ionique Méthode automatisé : SEQUEST 1> MS liste de peptides candidats 2> Génération des spectres MS/MS théoriques de chaque peptide candidat 3> Comparaison avec le spectre MS/MS expérimental et établissement d un score 4> Liste des meilleurs scores : IDENTIFICATION

40 Automatisation EVOLUTIONS TECHNOLOGIQUES 2D GELS Spots detection Spot Picking In gel Digestion MS Peptide Mass Fingerprint Identification

41 Automatisation EVOLUTIONS TECHNOLOGIQUES 2D GELS Station Robotisée Spots detection Spot Picking In gel Digestion MS Peptide Mass Fingerprint Identification

42 Les Limites de l Electrophorèse 2D Reproductibilité Variation d un gel à l autre Réplicats et analyse statistique DIGE Protéines de pi extrèmes (<3.5 et > 8-9) Pb focalisation : basse résolution et perte de protéines Protéines membranaires et/ou très hydrophobes (25 à 30% du protéome) Pb de solubilisation Détergents non-ioniques (SB3-8, SB-12 ) Protéines de haut poids moléculaires ( kda) Pb de pénétration dans les gels Réhydratation active des strips Protéines faiblement représentées Pb de détection

43 Amélioration et Emergence de Nouvelles Technologies Séparatives Amélioration des techniques d électrofocalisation et de détection Technologies In-Gels Chromatographie Liquide Puces à protéines.. Technologies Off-Gels LC-MS/MS

44 DIGE : Protéomique Quantitative Marqueurs Fluorescents : Cy2, Cy3, Cy5 Détection : 125 pg Gamme dynamique :10 5 Avantages : Sensibilité Quantitatif

45 LC-MS/MS Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem Digestion enzymatique (Ti, ChTi ) du mélange complexe AVANT SEPARATION

46 LC-MS/MS Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem Séparation des peptides par HPLC Force Ionique Temps (min)

47 LC-MS/MS Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem Séparation des peptides par HPLC Force Ionique ACN ACN ACN Temps (min) Temps (min) Temps (min) Temps (min)

48 LC-MS/MS Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem Force Ionique Temps (min) ACN ACN ACN Temps (min) Temps (min) Temps (min) Identification MS/MS MS/MS MS/MS

49 LC-MS/MS Laboratoire de John Yates Jr. (La Jolla USA) Technologie «MudPIT» «Multidimensional Protein Identification Technology» Protéome de la levure Parmi les protéines identifiées relative forte proportion de protéines: * faiblement abondantes (facteur de transcription, kinases etc ) * Membranaires * de pi extrême * de Haut poids moléculaire Washburn et al, (2001) Nature Biotech. 19,

50 LC-MS/MS Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem Avantages En plus : Rapide (24h-48h) Quantitative Inconvenients * Moyens lourds de MS et Informatique 3000 spectres MS et MS/MS par heure * Compétence en MS plus importante

51 Spectrométrie de masse et Quantification La Spectrométrie de masse n est pas quantitative : l intensité d un ion n est pas systématiquement proportionnelle à sa concentration

52 Spectrométrie de masse et Quantification MAIS : 2 peptides ne différant que par leur composition isotopiques donnent des signaux identiques en intensité Couplage MS / Marquage isotopique = Protéomique Quantitative

53 Protéomique Différentielle par MS Ruedi Aebersold (Seattle, USA)

54 Stratégies de Marquage Isotopique Stable Comparaison d 1 nombre identiques de cellules provenant de 2 cultures différentes : 1 en milieu minimum non marqué 1 en milieu minimum marqué avec des acides aminés 15 N, 2 D, 13 C ou en milieu enrichi 15 N Incorporation des isotopes pendant la traduction des protéines

55 Stratégies de Marquage Isotopique Stable Mélange complexe protéiques de 2 échantillons différentes sont protéolysés en: 16 O-H 2 O 18 O-H 2 O Incorporation de 18 O en C-terminal du peptide

56 Stratégies de Marquage Isotopique Stable ICAT Isotope-Coded Affinity Tag * Marquage des protéines par des réactifs isotopiques * Digestion enzymatique * Purification des peptides marqués (affinité biotine) * Séparation des peptides par HPLC * Analyse par MS/MS «en ligne» * Ratio Lourd/Léger * Identification Possible que sur des proteines qui possèdent des Cystéines libres.

57 Stratégies de Marquage Isotopique Stable itraq Isobaric tagging Reagent 1> Marquages des peptides par 1 des 4 réactifs itraq Comparaison de 4 conditions différentes

58 Stratégies de Marquage Isotopique Stable itraq Isobaric tagging Reagent 1> Marquages des peptides par 1 des 4 réactifs itraq Comparaison de 4 conditions différentes Chaque Tag a la même masse (145) Mais les «reporter» diffèrent d 1Da par différence isotopique

59 Stratégies de Marquage Isotopique Stable itraq Isobaric tagging Reagent 1> Marquages des peptides par 1 des 4 réactifs itraq Comparaison de 4 conditions différentes 2> Détection des «reporters» et Quantification par MS/MS 3> Identification du peptide par «Sequence Tag»

60 Stratégies de Marquage Isotopique Stable itraq Isobaric tagging Reagent Analyse Protéomique Différentielle de plusieurs mutants de Saccharomyces cerevisiae Ross et al, 2004, Mol. Cell. Prot., 3-12,

61 Approche ICAT sur la Levure

64 Puces à Protéines Lab on a Chip Array-based methods : (Analogue aux puces à ADN) Immobilisation sur des supports en verre siliconés Criblage d un mélange complexe de protéines pour différents types d interactions Applications : Immobilisation de l ensemble des protéines produites par une bibliothèque de cdna et criblage pour des interactions (jusqu'à 2 µm): Protéine-Protéine Antigène-Anticorps. Walter et al, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3,

65 Puces à Protéines Lab on a Chip SPR-MS Couplage résonance Plasmonique de Surface (BIAcore)/MS Identification par MS/MS des Protéines Fixées sur le SensorChip