Transformation de la biomasse par voie biochimique

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1 Transformation de la biomasse par voie biochimique Frédéric Monot 1

2 Transformation biochimique de la biomasse Pressage fermentation hydrolyse fermentation? 2

3 Transformation biochimique de la biomasse lignocellulosique Les principaux polymères des parois végétales 3 Lignine Cellulose Hemicelluloses

4 Transformation biochimique de la biomasse 4 étapes principales Production d enzymes Cellulases étape 3 LCB Prétraitement Cellulose + lignine Hydrolyse enzymatique Glucose Fermentation Bio-produit Hemicellulose hydrolysée Lignine Séparation étape 1 étape 2 Bio-carburant étape 4 4

5 Introduction L étape du prétraitement: déconstruction du complexe lignocellulosique Hémicelluloses Prétraitements Hémicelluloses Lignines Cellulose Lignines Cellulose Adapté de Kumar et al., 2009 Rôle des prétraitements (Kumar, 2009) Déstructuration de la matrice lignocellulosique Rendre la cellulose plus accessible aux enzymes Les différents prétraitements (Mosier et al., 2005) Physiques (broyage, extrusion ) Chimiques (acide, alcalin ) Physico-chimiques (explosion à la vapeur) 5

6 Introduction L étape d hydrolyse enzymatique: mode d action des cellulases et hémicellulases Hydrolyse de la cellulose Les endoglucanases (EG1 et EG2) Produit: oligosaccharides solubles Les cellobiohydrolases (CBH1 et CBH2) Produit: cellobiose La β-glucosidase Produit: glucose Hydrolyse des hémicelluloses 6 ( XYN) Endo-1,4-β-xylanases ( ABF) α-l-arabinofuranosidases (FAE) Féruloyl Estérase (GLR) α-d-glucuronisidase (AGL) α-d-galactosidase (AXE) Acétyl-xylane-estérase

7 Introduction L étape de fermentation : éthanol et au-delà Ingénierie métabolique & biologie synthétique J Nielsen & JD Keasling, 2011, Nat. Biotechnol 29 Went et al., 2013, Curr Op Chem Biol 17:1 7

8 Transformation biochimique de la biomasse & Enerbio Production d enzymes 3 - Thèse Thomas Portnoy 1 - Thèse Nassim Belmokhtar Cellulases 2 - Thèse Laetitia Poidevin 5 -Thèse Florent Collas LCB Prétraitement Cellulose + lignine Hydrolyse enzymatique Glucose Fermentation Bio-produit Hemicellulose hydrolysée 4 -Thèse Charles Taylor Lignine Séparation 6 -Thèse Camille Delebecque Bio-carburant 8 1 : Etude de la saccharification enzymatique du miscanthus par des cocktails cellulolytiques de Trichoderma reesei 2 : Caractérisation risation d enzymes fongiques dégradant les parois végétales v et complémentation mentation du sécr crétome de T. reesei 3 : Analyse du transcriptome de T. reesei pour l am l amélioration de la production de cellulases 4 : Isolation of environmental lignin degrading bacteria and identification of extracellular enzymes 5 : Production of Isopropanol, Butanol and Ethanol by genetically modified Clostridia 6 Séminaire : Organization Enerbio 2013 of intracellular _ FM reactions with rationally designed scaffolding systems

9 Thèses Enerbio bio : thématiques Etude de la saccharification enzymatique du miscanthus par des cocktails c cellulolytiques de Trichoderma reesei Caractérisation risation d enzymes fongiques dégradant les parois végétales v et complémentation mentation du sécr crétome de T. reesei Analyse du transcriptome de T. reesei pour l am l amélioration de la production de cellulases Cellulases : hydrolyse et production Un des points cruciaux des procédés biologiques Isolation of environmental lignin degrading bacteria and identification of extracellular enzymes Ligninases : pour un traitement spécifique des lignines Production of Isopropanol, Butanol and Ethanol by genetically modified Clostridia Organization of intracellular reactions with rationally designed scaffolding systems Vers la production d autres molécules grâce à l ingénierie métabolique à la biologie synthétique 9

10 Thèses Enerbio bio : Universités s de rattachement Nassim Belmokhtar : Etude de la saccharification enzymatique du miscanthus par des cocktails cellulolytiques de Trichoderma reesei Univ Reims Champagne Ardenne Laetitia Poidevin : Caractérisation risation d enzymes fongiques dégradant les parois végétales et complémentation mentation du sécr crétome de T. reesei Univ Aix-Marseille I Thomas Portnoy : Analyse du transcriptome de T. reesei pour l am l amélioration de la production de cellulases - Univ Pierre et Marie Curie Paris Collaboration avec T.U. Vienne, AU Charles Taylor : «Isolation of environmental lignin degrading bacteria and identification of extracellular enzymes» - University of Warwick, UK Florent Collas : Production of Isopropanol, Butanol and Ethanol by genetically modified Clostridia - AgroParisTech Collaboration avec U. Wageningen, NL Camille Delebecque : Organization of intracellular reactions with rationally designed scaffolding systems - Univ Paris-Descartes Collaboration avec Harvard Medical School, USA => Ouverture à l international 10

11 Étude de l hydrolyse l enzymatique du miscanthus par des cocktails cellulolytiques de Trichoderma reesei Nassim BELMOKHTAR Dr Nicolas LOPES FERREIRA IFP Energies nouvelles Rueil-Malmaison Directeur de thèse Pr Philippe DEBEIRE Dr Brigitte CHABBERT UMR FARE-URCA Fractionnement des Agro ressources et Environnement Reims

12 Pourquoi le miscanthus? Espèce la plus étudiée o Miscanthus x giganteus Graminée vivace à rhizomes o Une seule phase d implantation, peu d intrants Métabolisme photosynthétique de type C4 o Potentiel élevé de production de biomasse (20 t/ha) Deux modalités de récolte o Précoce (automne) o Tardif (hiver ; retour éléments nutritifs vers rhizomes) Récolte précoce Récolte tardive 12

13 Objectif de la thèse Exploration du potentiel de saccharification du miscanthus Mécanismes fondamentaux d hydrolyse enzymatique Hétérogénéité tissulaire et hydrolyse enzymatique Cocktails enzymatiques et optimisation de la saccharification Effet des prétraitements acide et alcalin sur: La distribution des composés phénoliques au sein des différents tissus Aptitude à l hydrolyse enzymatique des types cellulaires Progression des cellulases inactives et identification des points bloquants Performances de cocktails enzymatiques ayant des activités remodelées Performances de différentes doses d enzymes Performance de cocktails synthétiques 13

14 Hétérogénéité tissulaire et hydrolyse enzymatique Haut de la tige Organisation tissulaire Sclérenchyme épidermique (A) Faisceaux vasculaires Sclérenchyme périvasculaire (B) EN 3 Parenchyme (C) EN 2 24 cm 50 µm Microscopie à fluorescence UV EN 1 14 Bas de la tige Tige de miscanthus (Biomasse aérienne) 10 µm 10 µm 10 µm autres observations / microspectrophotométrie à transmission UV Conséquence de l hétérogénéité tissulaire?

15 Hétérogénéité tissulaire et hydrolyse enzymatique Hydrolyse enzymatique: digestion des parois végétales après prétraitement acide ou alcalin Réactivité des parois cellulaires aux prétraitements et aux enzymes Sclérenchyme épidermique prétraité à l acide sulfurique dilué + cellulases Hydrolyse à l aide d enzymes pures et de mélanges reconstitués g/l miscanthus explosé à la vapeur 10 mg d enzymes /g de MS Belmokhtar et al., 2012 (Bioenergy Research)

16 Étude de l hydrolyse enzymatique du miscanthus par des cocktails cellulolytiques de Trichoderma reesei Conclusions Distribution hétérogène des composés phénoliques dans les tissus du miscanthus Dégradation enzymatique différentielle des types cellulaires (gommée par des prétraitements sévères) Efficacité des cocktails enzymatiques reconstitués Importance de l activité β- glucosidase sur la cinétique initiale Bonne digestibilité enzymatique du miscanthus prétraité 16

17 Caractérisation d enzymes fongiques dégradant les parois végétales et complémentation du sécrétome de Trichoderma reesei Laetitia Poidevin 2010 Dr Senta BLANQUET IFP Energies nouvelles Rueil-Malmaison Dr Eric RECORD Université Aix Marseille 17

18 Contexte : Familles de glycosides hydrolases des champignons Analyse de la base de données CAZy : nombre élevé de cellulases dans le génome de P. anserina Communication personnelle de Pedro Coutinho, CNRS-AFMB, Marseille

19 Objectifs de la thèse Améliorer le cocktail enzymatique de Trichoderma reesei Criblage in silico d enzymes cibles - Aucune cinnamoyl estérase chez T. reesei - 33 gènes codant pour des GH61 chez P. anserina Étude du potentiel lignocellulolytique de P. anserina - Comparaison des sécrétomes de P. anserina selon l induction - Recherche d enzymes complémentant le sécrétome de T. reesei Podospora anserina

20 ESTA de Piromyces equi Les cinnamoyl estérases : enzymes auxiliaires Acide férulique lié en 0-5 ou 0-2 du L-Arabinose Cinnamoyl estérases Structure d une hémicellulose de céréale. Illustration d après Williamson G. et al., 1998

21 Conclusions Cinnamoyl estérase Domaine catalytique d ESTA de P. equi produit avec succès chez T. reesei et caractérisé EstA ne semble pas améliorer la saccharification de la paille de blé par T. reesei Potentiel d ESTA pour la production d acide férulique à partir de substrats végétaux (antioxydant et précurseur de la synthèse de vanilline : applications potentielles alimentaires et médicales) Sécrétomes de P. anserina Activités des PaCel6 optimales à ph alcalin et à température peu élevée Pas d effet avec PaGH61A et PaGH61B Profils des sécrétomes fortement dépendants de l'inducteur Complémentation de T. reesei observée avec certains sécrétomes

22 Analyse du transcriptome de Trichoderma reesei pour l am amélioration de la production de cellulases Thomas Portnoy 2011 Dr Antoine Margeot IFP Energies nouvelles Rueil-Malmaison Pr Stéphane Le Crom U. Pierre et Marie Curie Paris 11/12/

23 Trichoderma reesei : un champignon producteur de cellulases Comprendre les régulations méthode de production en 2 phases (1) croissance du micro-organisme organisme (2) production des enzymes questions but induction par le lactose perception de l'induction? gènes impliqués? régulateurs et réseaux de régulation? définir des cibles génétiques pour augmenter la capacité de production des enzymes Glucose Cellules T. reesei induction Lactose (1) (2) Enzymes Cellulases

24 Fonctionnement d un micro-organisme Génome Expression du génome Réactions - Environnement Substrats 24 ADN amplitude réponse ARN régule traduit en Protéines régulateurs enzymes perçoit catalyse C est le génome (ADN) qui porte l information caractérisant l organisme TRANSCRIPTOME = 1 ère étape de l expression Métabolites Energie Nutriments Croissance Survie Déchets Enzymes

25 Expression des gènes au cours de la production Approche méthodologique Quels gènes sont actifs lors de la production d enzymes? Analyse du transcriptome Suivi simultané de l expression l des 9129 gènes Puces à ADN ADN ARN Protéines régulateurs enzymes Substrats Métabolisme Energie Nutriment Croissance Survie Produit spots/lame 25

26 Expression des gènes au cours de la production Résultats 592 gènes dans 10 groupes de régulation Certains gènes déjà connus et attendus Une majorité pas connue pour être impliquée Etablissement d un «scénario» Jourdren et al., 2010 Portnoy et al., 2011a Portnoy et al., 2011b 26

27 Conclusions 1. Étude des effets du lactose sur l expression des facteurs de transcription influençant l expression des gènes de cellulases démonstration inédite d une régulation positive exercée par le lactose sur les gènes xyr1, ace1et ace2 2.Identification de l ensemble des cibles de CRE1 dans un contexte de répression catabolique et de dérépression démonstration que CRE1 était dans certains cas liéàdes régulations positives de l expression des gènes, contrairement au modèle généralement admis 3. Analyse globale des effets de l induction de la production de cellulases en bioréacteur sur l expression des gènes de souches plus ou moins productrices démonstration de l importance de l expression génétique basale dans l acquisition des capacités d hyperproduction des mutants identification des principales fonctions cellulaires soumises à des régulations 27 11/12/

28 Isolation of environmental lignin degrading bacteria and identification of extracellular enzymes Charles R. Taylor (2012) Pr Tim Bugg Department of Chemistry, The University of Warwick UK 11/12/

29 Contexte et objectifs Principales enzymes dégradant la lignine Peroxydases (lignine peroxidases et Mn peroxydases) Mono-oxygénases (laccases) Ligninases bactériennes moins connues que ligninases fongiques Exploration de la diversité bactérienne (y compris en conditions thermophiles) Recherche de nouvelles enzymes 29 11/12/

30 Résultats Mise au point d un test de screening original 30 11/12/20 13 Isolement de 10 souches bactériennes originales dont 3 thermophiles (sols de forêts, compost de paille de blé) Caractérisation des souches Estimation du pouvoir lignolytiquede 2 souches (Microbacteriumphyllosparaeet Sphingobacterium) 30

31 Résultats (2) Actions sur différents substratss Voie de dégradation possible Lignines Kraft Purification d enzymes de Sphingobacterium Action de Sphingobacteriumsur lignines Kraft de forte et faible masse moléculaire activités des enzymes difficiles àétablir (pas de ligninasesidentifiées, rôle éventuel de superoxyde dismutases) 31 11/12/

32 Conclusions Un nouveau test de criblage de souches lignolytiques Plusieurs souches bactériennes capables de dégrader des lignines de haut Mwen fractions de faibles Mw Capacités variables des souches vis-à-vis des composés aromatiques Détection de plusieurs superoxyde dismutases Prétraitement de délignification enzymatique encore très prospectif 32 11/12/

33 Production of Isopropanol, Butanol and Ethanol by genetically modified Clostridia Florent Collas 2012 Dr Rémy Marchal IFP Energies nouvelles Rueil-Malmaison Dr. Ana Lopez-Contreras Food and Biobased Research Pr Claude Gaillardin 11/12/

34 Modifier le métabolisme? Clostridium acetobutylicum produit un mélange Acétone Butanol Ethanol Glucose Pyruvate Acetyl-CoA Acetate Ethanol Acetoacetyl-CoA Acetoacetate Acétone Acétone peu intéressant transformé en Isopropanol par d'autres micro-organismes organismes Butyryl-CoA Butyrate Acétone Isopropanol Butanol 34

35 Ingénierie métabolique de Clostridium Méthodologie insertion dans C. acetobutylicum d'un gène hétérologue codant pour l'enzyme formant l'isopropanol surexpression des enzymes natives de la voie métabolique de l'acétone Glucose Pyruvate Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA Acetate Acetoacetate Acetone Ethanol Isopropanol Butyryl-CoA Butyrate Butanol 35

36 Ingénierie métabolique de Clostridium Résultats Performances production d'un mélange Isopropanol/Ethanol/Butanol sans acétone productivité x 2 C. acetobutylicum pfc007 (wild type) BuOH (g/l) 9 13 acetone (g/l) isopropanol (g/l) ethanol (g/l) productivity (ABE or IBE) g/(l.h) fermentation en continu augmentation de la productivité 36

37 Organization of intracellular reactions with rationally designed scaffolding systems Camille Delebecque 2012 Dr Ariel Lindner Université Paris-Descartes Pr Pamela Silver Harvard Medical School 11/12/

38 Biologie synthétique Chiarabelli et al., 2013 Nielsen & Keasling, 2011 Cellule minimale semi-synthétique Compartimentation cellulaire - carboxysome Bonacci et al., 2012 Seo et al., 2013 Différents types d assemblage 38

39 Design de RNA scaffolds utilisation d ARN non codants Design d aptamères sites MS2 et PP7 de fixation de protéines Design de nanostructures d ARN polymérisation possible Protocole complet décrit dans Delebecque et al., Nature Protocols, 2012, 7,

40 Application à la production d hydrogène Fd(red) + 2H + = H 2 + Fd(ox) Différents assemblages sur modules d ARN FM = Ferredoxin/MS2, H = [Fe-Fe]hydrogénase/PP7 Production d hydrogène par E. coli exprimant la voie de production d hydrogène et les différents assemblages d ARN Delebecque et al., Science, 2011, 333, 470 Après normalisation sur quantités d ARN dans cellules, facteurs d aug. D0 = x 4 D1 = x 6.2 D2 = x 24 40

41 Principales conclusions 1. Design et construction de nouveaux outils d assemblage de nanostructures d ARN non codants organites artificiels sites de fixation aux protéines => contrôle de l organisation spatiale 2. Démonstration du concept validation sur production d hydrogène (système Fd/H2ase) 3. Développement de «biobricks» pour biologie synthétique avec une cyanobactérie outils génétiques pour modification des hétérocystes d Anabaena futur châssis de biologie synthétique? 41

42 Enerbio & transformation biologique de la biomasse Principaux apports Production d enzymes 4 - Thèse Thomas Portnoy 1 - Thèse Nassim Belmokhtar Cellulases 3 - Thèse Laetitia Poidevin 5 -Thèse Florent Collas LCB Prétraitement Cellulose + lignine Hydrolyse enzymatique Glucose Fermentation Bio-produit Hemicellulose hydrolysée 2 -Thèse Charles Taylor Lignine Séparation 6 -Thèse Camille Delebecque Bio-carburant 1 : Dégradation enzymatique différentielle des types cellulaires => application à prétraitements doux 2 : Nouvelles bactéries lignolytiques thermo-tol tolérantes => nouvelles enzymes lignolytiques 3 : Rôle de certaines enzymes auxiliaires => à explorer 4 : Identification de processus encore inconnus impliqués dans la production des cellulases 5 : Nouvelles perspectives ouvertes par l ing ingénierie nierie métabolique de Clostridium 42 6 Séminaire : Nouveaux Enerbio outils 2013 _ de FM biologie synthétique tique permettant une organisation spatiale des protéines

43 Merci de votre attention 43