- 3 - PEUPLEMENTS. 3.1 Variabilité et rôle trophique de la matière organique dissoute de différentes origines

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1 - 3 - PEUPLEMENTS 3.1 Variabilité et rôle trophique de la matière organique dissoute de différentes origines

2 Variabilité et rôle de la matière organique dissoute de différentes origines comme source nutritionnelle pour les algues mixotrophes, conséquences sur la structuration des communautés phytoplanctoniques Coordination : Christian Béchemin 1. Résumé l'année 2001 a été consacrée à la validation de la stratégie d échantillonnage et à l adaptation des méthodes analytiques. Un ensemble de matériels permettant l extraction des substances organiques dissoutes et leur séparation en différentes fractions de taille a été acquis et installé. Un pilote de préfiltration et un pilote de concentration par ultrafiltarion des substances organiques dissoutes ont été développés au laboratoire et testés sur diverses eaux de la Charente, afin d organiser l aspect logistique concernant l échantillonnage de plusieurs centaines de litres d eau et d optimiser les étapes nécessaires à la concentration. 2. Rappel thématique et hypothèses de travail Le phytoplancton constitue une des principales sources de nourriture des échelons supérieurs de la chaîne alimentaire et notamment des bivalves cultivés dans le Bassin de Marennes- Oléron. Au delà de ce rôle, les phénomènes de prolifération du phytoplancton, dits efflorescences phytoplanctoniques, sont devenus dans certaines cas un problème environnemental et économique préoccupant du fait de leur importance, de l augmentation de leur fréquence, mais aussi en raison de la modification de la structure des communautés phytoplanctoniques favorisant les espèces nuisibles. Non seulement les efflorescences algales sont impliquées dans le phénomène d eutrophisation par le développement d une biomasse importante sous l influence d apports accrus en sels nutritifs, mais certaines de ces proliférations, caractérisées par la prédominance d espèces toxiques, représentent un danger létal pour les cheptels marins et la santé humaine. A l origine de ces événements, les changements survenus dans les rapports de concentration en éléments nutritifs minéraux (azote, phosphore et silicium) sont considérés comme un des facteurs majeurs. Cependant l influence des apports minéraux en nitrate, la stabilisation des apports en phosphate et la réduction des apports en silicate favorisent la prédominance d espèces n'utilisant pas le silicium. Des observations ont montré qu'un grand nombre de ces espèces étaient auxotrophes et/ou mixotrophes, et l hypothèse a été émise d une stimulation de leur développement par les apports en matière organique dissoute terrigène (MOD) déversés par les fleuves dans les eaux côtières. Nous avons donc proposé de (i) déterminer l'importance, la nature et la variabilité de la matière organique dissoute terrigène de différentes sources ; (ii) vérifier si certaines substances organiques dissoutes sont capables de modifier la structure des communautés phytoplanctoniques locales.

3 2.1. Rappel sur la stratégie opérationnelle Pour répondre à ces deux questions, trois approches méthodologiques ont été identifiées : La première consiste à développer un outil analytique permettant le dosage du carbone et de l'azote organiques dissous aux concentrations naturelles pour pouvoir décrire les variations spatio-temporelles globales de la matière organique dissoute d'après ses constituants de base. La deuxième concerne la connaissance structurale des substances organiques dissoutes, et nécessite la mise en œuvre d'une étape d extraction des composés du milieu naturel. Deux catégories de procédures ont été retenues : - l utilisation des résines macroporeuses non ioniques et ioniques, - les techniques membranaires, (ultrafiltration et osmose inverse). La troisième combine des expérimentations utilisant des microalgues isolées et des populations phytoplanctoniques naturelles, cultivées en présence de différents types de matière organique dissoute isolés des eaux de l'estuaire de la Charente et du Bassin de Marennes-Oléron, de la baie de L Aiguillon. 3. Etat des travaux effectués en 2001 Nature et importance de la matière organique dissoute terrigène Dosage du carbone et de l'azote organiques dissous : Afin de répondre aux questions suscitées par ce projet de recherche, il a été procédé par le laboratoire à l achat d un détecteur simultané de carbone et d azote organique dissous par oxydation catalytique à haute température. Ce détecteur a été installé au CREMA le 9 Juin Il fait actuellement, l'objet d une mise au point adaptée à cette thématique. Extraction des substances organiques dissoutes : L étude de la MOD se fait en grande partie à partir de matériel isolé du milieu naturel par des techniques d extraction globales. Certaines de ces techniques permettent d associer à la fois la concentration et le fractionnement de la MOD. C est le cas des résines macroporeuses non ioniques ou des résines échangeuses d ion, et de l ultrafiltration. Ultrafiltration à flux tangentiel : Les techniques membranaires tel que l ultrafiltration, permettent la concentration et le fractionnement de la MOD à partir de grandes quantité d eau sans exposer les substances organiques dissoutes à des agents chimiques. Les molécules dissoutes sont séparées en fonction de leur taille, en faisant passer une solution sous pression à travers la membrane. Les macromolécules dont le poids moléculaire est supérieur à un certain seuil sont retenues tandis que les plus petites y compris les molécules du solvant, passent dans le filtrat. En filtration à flux tangentiel, la solution est pompée à grande vitesse le long des membranes, des séparateurs placés entre les membranes perturbent le flux pour créer une turbulence qui réduit la formation de la couche polarisée. Pour adapter le procédé de concentration à cette étude, un pilote d ultrafiltration a été mis au point au laboratoire. Ce pilote permet le traitement en grands (300 L), moyens (100 L) et petits (5 L) volumes. L origine marine des eaux à traiter a nécessité l utilisation de pompes en titane de puissance suffisante pour lutter contre l effet de la force ionique élevée de l eau de mer. Afin d éviter le colmatage de la membrane par les particules et les microorganismes de l eau de la Charente, un module de préfiltration allant jusqu à 0,2 a été construit. Il met en oeuvre une série de cartouches de filtration en profondeur offrant une grande efficacité pour la rétention des particules et des microorganismes, avec un débit important à de faibles pressions différentielles. Une pompe péristaltique assure une circulation douce du liquide, afin d éviter

4 l éclatement des microorganismes et d éviter ainsi un enrichissement de la MOD en substances intracellulaires. Le module d ultrafiltration comprend en plus de son système de membranes, une pompe assurant la mise en pression et la «recirculation» du liquide à concentrer, ainsi qu'un ensemble de manomètres pour régler les pressions. Dans un premier temps la mise en œuvre a porté sur l extraction et la concentration des substances organiques macromoléculaires dissoutes de poids moléculaire supérieur à 1000 Dalton. Au cours de cette mise au point, il a fallu tenir compte de contraintes liées à ce travail de recherche. Ainsi une quantité importante de substance devait être récupérée afin de satisfaire les exigences analytiques de la RMN, de la spectrométrie de masse et de la pyrolyse de masse. Prélèvement Filtration < 30 < 25 < Refroidissement Rétentat Membrane 1. Perméat Pompe Pilotes de préfiltration et d ultrafiltration mis au point au laboratoire

5 Extraction sur résines : Pour cette recherche, un ensemble de résines Amberlite XAD-8 et XAD-4 a été acquis afin de procéder au fractionnement de la MOD par couplage de ces deux résines. L utilisation de résines macroporeuses non ioniques est à l origine de la distinction entre substances humiques et non humiques. Elles sont constituées de billes dures et insolubles à base de polymères macroporeux non chargés. Dans un premier temps les techniques d extractions sur résines ont porté sur la fraction hydrophobe de la MOD en utilisant le protocole proposé par Thurman et Malcolm (1981). Par la suite, l utilisation de résines en série a permis d étendre le champ d investigation aux substances appelées acides hydrophiles. La fraction de carbone organique dissous adsorbé sur la résine XAD-8 constitue les substances humiques. Les substances adsorbées sur la résine XAD-4 sont dénommées acides hydrophiles et peuvent représenter de 20 à 30% du carbone organique dissous. Le couplage des deux résines permet un taux de récupération total de 85% de la MOD. Caractérisation chimique de la matière organique dissoute Utilisation de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du 13 C : La RMN 13 C permet d obtenir des informations qualitatives sur la distribution structurale du carbone organique. Conduite sur quelques centaines de mg d extrait lyophilisé, elle est non destructrice de la matière organique et assure la mesure directe des atomes de carbone. Elle permet de distinguer nettement les extraits isolés de rivière, du milieu marin, ou du sol. En 2001, une série de mesures encourageantes a été effectuée en collaboration avec l université de La Rochelle sur des extraits de MOD obtenu par ultrafiltration à partir d eaux provenant de l embouchure de la Charente. Cependant une mise au point importante reste à faire notamment au regard du type d appareillage utilisé et du type de molécules ciblé. Pour cette action, une collaboration a été mise en place avec le Laboratoire de Chimie Européen de l Université de Bordeaux doté d un équipement en RMN et d un environnement de chercheurs et techniciens plus adapté à notre thématique. Utilisation de la Pyrolyse couplé à la chromatographie gazeuse et détection de masse : La pyrolyse couplée à la chromatographie gazeuse et à la détection de masse est une méthode qui permet de caractériser une matière organique macromoléculaire après dissociation de celle-ci en molécules plus petites. Elle permet d'obtenir rapidement une signature spécifique à une matière organique donnée, basée sur des résidus de lipides, glucides, protéines et pigments chlorophylliens. Elle sera conduite en collaboration avec le Laboratoire de Synthèse et Réactivité des Substances Naturelles (UMR 6514) de l'université de Poitiers, sur de la MOD concentrée par ultrafiltration puis réduite à l'état solide par lyophilisation.