Colloque en Région #2 à Lille, 2 et 3/10/2014

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1 Après le succès de son premier colloque en région à Lyon le 27 mars dernier, l Aspec a réitéré l événement les 2 et 3 octobre 2014 dans la région Nord de la France, à la Faculté de Médecine de Lille. Partagés entre l amphithéâtre et l Atrium où se tenaient les 15 partenaires exposants de l Aspec, près de deux cents participants sont venus faire le point sur la maîtrise de la contamination de l air et des surfaces. La première journée dédiée aux personnels des établissements de santé, a permis d éclairer les participants sur la version 2013 de la NF S Le second jour visait plus spécifiquement les industries de la santé et a permis de faire connaître aux participants les dernières avancées sur la caractérisation de l air et des surfaces. Les intervenants de la matinée nous ont parlés des techniques de mesure et de caractérisation de l air et des surfaces. Christel Routaboul, Professeur de Traitement des matériaux au Lycée Roosevelt de Reims, a rappelé les propriétés physico-chimiques des surfaces. Lorsque ce sujet est abordé, des notions d échelle doivent être précisées : - Echelle millimétrique dite échelle macroscopique : elle s apparente au rendu ou «peau» du produit fini. - Echelle micrométrique : celle-ci permet d appréhender la microgéométrie d une surface. La plupart des matériaux sont issus d un cristal résultant de l arrangement régulier d atomes. A cette échelle, interviennent des paramètres comme l énergie de surface (J/m 2 ) ou encore la tension superficielle (N/m). - Echelle nanométrique : celle-ci vise à étudier l empilement des atomes. Toute surface appartient à l une des trois familles suivantes : - Surface propre issu d un modèle «théorique» étudié sur des monocristaux dans le vide. Cette surface présente un caractère instable en raison des réactions de chimisorption/physisorption avec les éléments du milieu dans lequel se trouve la surface ; - Surface conditionnée (préparée par polissage mécanique, chimique, électrochimique, etc.) ; - Surface industrielle préparée par un procédé et des outils. La caractérisation des surfaces peut porter sur : - des éléments géométriques ; en particulier, l analyse de la rugosité, définie par les normes internationales ISO 4237 et ISO 25178, pour des défauts micrométriques inférieurs à 20 µm), - leur composition chimique (en général, par rayonnement), - des aspects mécaniques : les épaisseurs de dépôt sont quantifiables par des méthodes non destructives (Induction magnétique, Courant de Foucault, Fluorescence X) ou destructives (coupes micrographiques, coulométrie)

2 Les trois échelles précédemment évoquées donnent lieu à la distinction entre des surfaces hydrophiles ou hydrophobes (différence de mouillabilité). François Villeval, R&D biomérieux, a traité de la surface comme support associé au transfert et au dépôt de micro-organismes. En effet, pour ceux-ci l air représente un milieu hostile alors que des conditions plus favorables peuvent être rencontrées sur les surfaces. C est le cas des biofilms, véritables écosystèmes microbiens pour les bactéries. De manière similaire aux filtres à air, les mécanismes physiques impliqués dans le transfert des particules dans l air vers les surfaces sont : - la diffusion (particules fines inférieures à 1 µm) ; - la sédimentation dont la vitesse est régie par la loi de Stockes Cunningham et proportionnelle, à la masse et au carré de la vitesse de la particule ; elle concerne les grosses particules de dimension supérieure à 1 µm ; - l inertie (impaction sur un obstacle). L adhésion d un micro-organisme sur son support est associée à deux types d interactions physico-chimiques : - forces physiques non spécifiques comme les forces électrostatiques et les interactions hydrophobes ; - interactions physico-chimiques spécifiques du micro-organisme. La charge électrique à la surface des micro-organismes étant négative, il est démontré que des biomatériaux chargés positivement favorisent l adhésion qui varie en fonction du potentiel de surface du support. L adhésion des cellules végétatives et des spores augmente avec le caractère hydrophobe du support. Inversement, plus un support est hydrophile, moins les bactéries s y fixent. Lors de l adhésion, se produit généralement une interaction entre des protéines d ancrage (adhésines) présentes à la surface du micro-organisme et une matrice extracellulaire (fibronectrine, collagène, ) externe à la bactérie. Les structures bactériennes type pili ou fimbriae contribuent elles-mêmes à l attachement des bactéries sur un support. Les pili peuvent produire des facteurs d attachement qui favorisent la liaison à une matrice extracellulaire. Les micro-organismes adhérents peuvent se développer et colonisés une surfaces. Les biofilms sont rencontrés à l interface liquide/solide (tuyauteries, par exemple) mais aussi air/solide. La définition proposée pour le biofilm est (Lindsay, 2006): Communauté de bactéries attachées de manière irréversible à un support produisant des substances polymériques extracellulaires et montrant un phénotype altéré comparativement aux cellules planctoniques (transcription génétique et relation les unes aux autres).

3 Etapes de formation d un biofilm Développement des conditions de surface adaptées (film de conditionnement) Humidité Matières organiques, polysaccharides, glycoprotéines ECM Rugosité, hydrophobicité, charges Mécanismes de transport mis en œuvre dans l adhésion Dynamique des fluides eau, air, liquides corporels Sédimentation, impaction Adhésion en 2 temps Adhésion réversible électrostatique, hydrophobe, VdW Adhésion irréversible et permanente par phénomène de liaison Production de polymères extracellulaires par la bactérie (EPS) Attachement irréversible Renforcement de la liaison Protection du biofilm Développement du biofilm et recolonisation Recolonisation Essaimage Nouvelles espèces Laure ALLOUL-MARMOR, qui a succédé au Docteur Fabien SQUINAZI à la présidence de la commission française AFNOR X44B a dressé un panorama des normes existantes et de l état d avancement des projets en cours portant sur la conception, la réalisation et l exploitation des salles propres, des zones propres, et des environnements maîtrisés qui s intéressent désormais aux contaminants particulaires, chimiques (série de normes ISO 14644) et microbiologiques (série de normes ISO 14698). Cf. : Salles propres, dossier SP90, article résumé du Workshop Expertlabs Les tableaux portant sur la propreté particulaire et chimique des surfaces ont déjà été mentionnés à l article référencé, Les avancées en caractérisation chimique des surfaces et des matériaux, L.Debard & S.Vandriessche, revue Salles propres n 90. D un point de vue particulaire de l air, Laure ALLOUL-MARMOR a évoqué l évolution du tableau des classes de propreté ainsi que le nombre d emplacements de prélèvement en fonction de la surface de la pièce en référence à la norme ISO/DIS (2 ème version DIS) actuellement en enquête publique jusqu au 20 octobre 2014 :

4 Classes de propreté particulaire de l air selon ISO/DIS (2 ème version DIS en enquête publique jusqu au 20 octobre 2014) Numéro de classification Concentrations maximales admissibles (particules/m 3 d air) en particules de taille égale ou supérieure à celle donnée ci-dessous ISO (N) 0,1 µm 0,2 µm 0,3 µm 0,5 µm 1 µm 5 µm Classe ISO 1 10 Classe ISO Classe ISO Classe ISO Classe ISO Classe ISO Classe ISO Classe ISO Classe ISO Valeurs qui disparaissent du tableau Nombre d emplacements de prélèvement en fonction de la surface de la pièce (ISO/DIS ème version DIS en enquête publique jusqu au 20 octobre 2014) Surface de la salle (m 2 ) inférieur ou égale à Nb min. de points de prélèvement à réaliser Surface maximale élementaire (m 2 ) Différence de points prélèvement entre le versions 2014 et 1999 >1000 N L = 27 x A / 1000 Pour les particules ultrafines ou nanoparticules (de diamètre inférieur à 100 nm), le projet de norme ISO/DIS propose d étendre les classes de propreté particulaire de l air jusqu'à des tailles allant jusqu à 1 nm.

5 Classes de propreté particulaire de l air à l échelle nanométrique selon le projet de norme ISO/DIS Pour de nombreux domaines d activités (Etablissements de santé, R&D, Production ), le contaminant majeur est le micro-organisme. Les experts travaillant sur les projets de révision des normes ISO réfléchissent à une classification microbiologique de l air et une autre classification microbiologique pour les surfaces. Le micro-organisme se présentant sous la forme d une bactérie, d une algue ou d un champignon microscopique peut être responsable d une infection, d une maladie, d une altération d un produit ou de tout autre effet affectant sa qualité. La démarche vise à définir des niveaux de propreté microbiologique de l air exprimés en termes de classe ACV x N, laquelle représente la concentration maximale admissible de CFU d une espèce microbienne ou d un groupe microbien d intérêt par mètre cube d air. Il en est de même pour définir des Niveaux de propreté microbiologique d une surface, exprimés en termes de classe (SCV x N), laquelle représente la concentration maximale admissible en CFU d une espèce microbienne d intérêt ou d un groupe microbien d intérêt par unité de surface prélevée, chaque valeur limite étant associée à une méthode de prélèvement déterminée (chiffonnette, écouvillon, boite contact, etc.). Toutefois, à l heure actuelle, les experts internationaux ne semblent pas avoir trouvés de consensus sur ces classes et de nombreuses questions sont encore ouvertes à la discussion : Faut-il créer des classes microbiologiques à l image des classes particulaires? Seraient elles plutôt des niveaux à ne pas dépasser lors de la surveillance? Doivent elles être exprimées en UFC ou en unité viable permettant ainsi la caractérisation d espèces spécifiques et l utilisation d autres techniques que les seules méthodes traditionnelles??? Quoiqu il en soit, l introduction de ces nouvelles classes de propreté devrait faire évoluer les définitions de la salle propre et de la zone propre, pour que ces dernières reposent sur le même principe fondateur : la maîtrise et la classification de la concentration des particules dans l air en premier lieu. La définition de l environnement maîtrisé devrait quant à lui caractériser un espace maîtrisé et classé selon des paramètres de propreté autres que celui de la propreté particulaire de l air. Les normes ISO «Salles propres» évoluent et s adaptent pour prendre en compte les différents types de contaminant : particulaire, nanoparticulaire, chimique, microbiologique

6 de l air et des surface ; ceci afin de fournir des réponses plus adaptées aux concepteurs et utilisateurs de salles propres visant à mieux protéger les patients et les produits de ces contaminants. Pascal Kaluzny n a malheureusement pas pu intervenir. Mais pour s excuser, voici le message qu il voulait faire passer : Président de Tera Environnement, il souhaitait rappeler quelques chiffres marquants en lien avec la pollution atmosphérique : selon l OMS, 2,4 millions de décès par an et 19 % des cancers dans le monde attribuables à l environnement ; ainsi que le contexte réglementaire «Air intérieur» détaillant des textes parus récemment : - Décret n du 2 décembre 2011 relatif à la surveillance de la qualité de l'air intérieur dans certains établissements recevant du public (JOCE du 4 décembre) ; - Décret n du 2 décembre 2011 relatif aux valeurs-guides pour l'air intérieur pour le formaldéhyde et le benzène (JOCE du 4 décembre) ; - Décret n relatif à l'évaluation des moyens d'aération et à la mesure des polluants effectués au titre de la surveillance de la qualité de l'air intérieur de certains établissements recevant du public. Ainsi que la série de normes ISO portant sur l air intérieur (dont partie 1 : aspects généraux de la stratégie d échantillonnage). Pour la caractérisation chimique d échantillons, on distingue trois grandes familles de méthodes : - Les mesures en ligne au moyen de capteurs, - Les analyses semi-quantitatives - Après prélèvement, les analyses spécifiques en fonction de composés ; Composés Organiques Volatils (ou COV), Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (ou HAP), Anions, Cations. Quelques méthodes d analyse des surfaces ont été présentées et sont listées dans le tableau ci-dessous : (Pour plus de détails : Quelles techniques analytiques choisir? C.Antoine, CEA et D.Faye, CNES revue Salles propres n 66, janv-fév 2010) Objectif Méthode Points particuliers Mesure de la surface spécifique d un matériau BET (Brunauer, Emmett et Teller) A partir de 1 m 2 /g Taille des pores : 0,4 à 400 nm Morphologie, structure, analyse Microscopie Electronique à Qqs nm aux micromètres chimique (si diffraction Balayage (MEB) d électrons) Microscopie Electronique à Transmission (MET) Structure et caractérisation de Diffraction rayons X surface Caractérisation minéralogique ou structurale des surfaces Analyses qualitatives et semiquantitatives des fragments organiques les plus volatils Nature des fonctions : acide, amine, alcool (analyse qualitative) Spectrométrie de masse des ions secondaires à temps de vol (Tof- SIMS) Pyrolyse/GCMS IRTF De la dizaine à quelques centaines de nanomètres Nature du support : PET, PVC, Mét Technique d identification des liaisons atomiques basée sur l absorption du rayonnement IR des liaisons. Renseignements sur la nature

7 Nature des fonctions : acide, amine, alcool (analyse qualitative) Spectroscopie de photoélectrons X (XPS) des liaisons chimiques de l échantillon. A partir de la dizaine de µm Il en est de même pour les méthodes d analyse physico-chimique des polluants de l air répertoriés ci-dessous : Famille de méthode d analyse Détecteur/Méthode d analyse Polluant recherché Spectrométrie UV-visible Ozone, H2S MS + plasma inductif Métaux, Alcalins, (ICP-MS) Alcalino-terreux Chromatographie ionique Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie liquide haute performance (HPLC) Spectrométrie d émission atomique par plasma à couplage inductif (ICP-OES) Analyse d environ 50 éléments Analyse des acides et des bases dans l air et dans l eau : acides carboxyliques, amines, bases, minéraux Remarques Molécules excitées par ionisation puis séparées selon leur masse Molécules excitées par ionisation puis séparées selon leur masse. La lumière émise par l élément est mesurée puis comparée à l étalon Détection à partir du ppt Molécules séparées en fonction de leur charge Ionisation de flamme COV Du ppb au % Spectromètre de masse COV, Du ppb au % Fluorescence UV HAP (aussi Du ppb au % aldéhydes, cétones) UV-visible Pesticides

8 Jean-Sébastien BONIN, responsable Projets de la société PMT France, a présenté les résultats d essai ayant permis la validation d un système à temps réel pour les micro-organismes selon les pharmacopées américaines USP 1223 & européennes EP Il s agit du BioTrak, compteur optique de particules viable. Cette appareil utilise une propriété naturelle de certains métabolites présents dans les microorganismes : l émission d un rayonnement de fluorescence en réponse à l excitation induite par de la lumière laser. De fait, cet instrument de mesure permet d obtenir 2 informations ; la taille de la particule obtenue en diffraction de la lumière laser (i.e. compteur optique) et au même instant et en fonction de la détection ou non de la fluorescence, s il s agit d une particule inerte ou viable. Un filtre placé en aval du système permet de collecter les particules pour une identification ultérieure éventuelle. L objectif de cette étude a été de démontrer via l utilisation d un banc d essai, que cette méthode alternative est au moins équivalente aux méthodes traditionnelles par prélèvement sur milieu de culture, et qu un biocount est équivalent à un UFC/m3. Pour ce faire, les paramètres suivants ont étudiés : la précision, l exactitude, l efficacité physique, la limite de détection et la limite de quantification, la linéarité, la plage de mesure, la robustesse et la rugosité.

9 L après-midi a été consacré à des retours d expérience issus de différents domaines d activité. Audrey Schultz, Famar, a présenté la technique d écouvillonnage mis en place chez cet industriel pharmaceutique pour des surfaces critiques difficiles d accès, en ZAC ou en isolateur, et pour lesquelles la méthode par gélose de contact n est pas applicable. Un travail d analyse type 5M a été mené sur une présomption de résultat hors spécification (OOS) survenu lors de manipulation au laboratoire. La méthode utilisée montrait des risques lié aux opérations de transfert (classe A vers classe D, classe D vers laboratoire d analyses, ) et aux délais associés. Pour réduire ces étapes à risques, une solution technique innovante a été proposée par Merck-Millipore : l écouvillon «tout en un» radiostérilisé (25 à 35 kgy) dans son emballage final. Cet écouvillon intègre un embout en microfibre de polyester humidifié avec solution de NaCl 0,9%, un tube en plastique transparent et un réservoir contenant le milieu de culture trypticase soja avec son neutralisant (lécithine Tween). Ce dispositif limite les manipulations et les opérations de transfert dans des tubes en verre. Les premiers résultats utilisateurs en ZAC et au laboratoire semblent prometteurs pour ce produit validé pour un emploi en classe A, en complément des géloses de contact. David CHEUNG, Chargé d Opérations chez ENTREGRIS, a proposé une revue des tests effectués dans son entreprise, prestataire pour des activités de nettoyage, de désinfection et de conditionnement de pièces, composants et produits dans les différentes industries. Son retour d expérience a concerné l industrie des Dispositifs Médicaux (DM), et en particulier, les DM implantables qui doivent répondre à la norme française NF S intitulée Implants chirurgicaux Exigences de validation pour le procédé de nettoyage des implants orthopédiques avant conditionnement final, révisée et homologuée en août 2013, après une phase expérimentale. Les tests réalisés sont listés ci-après : Famille de contrôle Contrôle microbiologique de la charge du produit Dosage d endotoxines Analyse granulométrique et gravimétrique Description Phase validation Phase routine Remarque Mesure de la population de micro-organismes viables selon norme ISO Test LAL selon PE 8è éd PE 8 ème édition Norme ISO Recommandation * Validation de la détermination du Bioburden * Test de bactériostasie *Analyse des conditions des milieux de culture Taux de recouvrement, Coefficient de dilution à déterminer Bioburden A effectuer sur les 3 premiers lots de fabrication consécutifs puis à la fréquence souhaitée Récupération de la contamination par extraction, puis filtration sur membrane, Si validation préalable, le résultat correspond à la quantité réelle de micro-organismes présents sur le dispositif. Dans le cas contraire, le résultat ne peut être utilisé que pour suivre le procédé. Si validation préalable, le résultat correspond à la quantité réelle d endotoxines présentes sur le dispositif. Dans le cas contraire, le résultat ne peut être utilisé que pour suivre le procédé. Précision de 0,1 mg

10 des particules IEST-STD-1246 E séchage, étuvage et dessiccation, pesée. Le nombre d extractions doit permettre d atteindre un seuil résiduel de contamination 10 % Analyse Microscope élémentaire Electronique à (composition Balayage (MEB) physicochimique) couplé aux rayons X (EDX) Recherche de Chromatographie Recherche d un élément ionique contaminants ionique (CI) spécifiques ICP-MS Recherche d un élément métallique GC-MS Recherche d un contaminant HPLC organique Validation du Norme ISO Résistance mécanique : force scellage d un Norme EN maximale correspondant à la emballage résistance d arrachage ou à la force nécessaire pour commencer à ouvrir l emballage (ex : > 1,5 N / bande de 15 mm) Pelabilité : force moyenne pour continuer à ouvrir l emballage (contrôle visuel d homogénéité) Test d étanchéité : le scellage est exposé, pendant 15 min, à une solution colorée. Aucune pénétration du liquide ne doit être constatée. Contrôles de Salles propres Comptages particulaires de l air, l environnement contrôles de l aérobiocontamination et de la biocontamination des surfaces, température, hygrométrie relative, Station de Résistivité, ph, Comptages traitement et de particulaires, COT, endotoxines, distribution d eau contrôles microbiologiques déminéralisée Vérification de l aptitude du scellage à conserver un état stérile du produit emballé Trois cas de contamination de pièces métalliques et plastiques ont été évoqués : - Contamination d implants orthopédiques par une lessive (Sodium Lauryl Sulfate) : les recherches en chromatographie ionique ont porté sur les ions sodium et sulfate. - Contaminant de vis orthopédiques en inox par de l huile de coupe, lors des opérations d usinage : l analyse en CPG a montré l insuffisance des process aqueux et la performance supérieure des méthodes de dégraissage par CO2 spray plutôt que par solvant traditionnel. - Contamination d implants oculaires en polycarbonate par auréoles blanchâtres : l analyse MEB-EDX a permis d identifier le détergent comme source principale des éléments S, Cl, K et Ca.

11 Enfin, et pour conclure la Journée, le professeur Pascal ODOU et Michèle VASSEUR, Pharmacien responsable du Laboratoire de Biopharmacie, Pharmacie Galénique et Hospitalière de l institut de Pharmacie du CHRU de Lille ont présenté leur retour d expérience sur les difficultés rencontrées lors des phases de conception, de qualification et de mise en service d une unité provisoire de pharmacotechnie : l UCPA (Unité Centralisée des Préparations Aseptiques). Cette unité a été construite afin de permettre la continuité de l activité, avant réhabilitation de l ancienne unité UPCC (Unité de Préparation Centralisée des Cytotoxiques) dans l objectif final de sécuriser et d accompagner l activité croissante des préparations injectables cytotoxiques, Pour ce faire, une analyse a posteriori par «arbre des causes» a été choisie. Elle a distingué 4 sous-ensembles : la centrale de traitement d air, l isotechnie, l enveloppe de la ZAC (Zone à Atmosphère Contrôlée) et équipements hors isotechnie et la sûreté de fonctionnement. Au vu de la quantité d information à traiter, une grille présentée ci-après a été créée permettant le recueil des données du groupe de travail multidisciplinaire et facilitant la restitution des résultats de l analyse : ELEMENTS FONCTIONS MODES DE DEFAILLANCE EFFETS PRODUIT ET UTILISATEURS Quel composant est concerné? Quel est le fonctionnement normal du composant? Quel est le dysfonctionnement? 1/ Que s est-il passé à la découverte du dysfonctionnement? 2/ Que se serait-il passé si le dysfonctionnement n'avait pas été découvert? CAUSES Quelles sont ou pourraient être les causes? GRAVITE, FREQUENCE ET INDICE DE CRITICITE Quelle est la fréquence relative des causes? Quelle est sa gravité? Quelle est sa criticité? ACTIONS CORRECTIVES Quelles sont les mesures curatives et préventives prises? VIGILANCE GESTION PROJET ULTERIEUR 1/ A quelle phase du projet doit-on être vigilant? 2/Quelles sont les actions à entreprendre pendant cette phase pour éviter le dysfonctionnement? 96 incidents ou dysfonctionnements ont été analysés, 14 possédant un indice de criticité élevée, c est-à-dire jugé inacceptable pour la poursuite de l activité dans la ZAC. Pour exemples, trois de ces incidents ont été présentés lors de la conférence : - un à risque de contamination microbiologique : fuite au niveau du caisson de filtration provenant de la gaine de soufflage et/ou du bac à condensat de l humidificateur, - un à risque de contamination particulaire : taux de brassage en ZAC à la limite de la conformité demandée, et - un à risque de contamination chimique : problème d installations des isolateurs avec une cascade de pression non conforme et des ruptures de leurs étanchéités, nécessitant la mise en place d un plan de surveillance renforcé (prélèvement de surface et dosage de 12 molécules). Pour chacun d eux, le risque produit sur la production ou l exploitation a été analysé, les actions correctives mises en place et les points de vigilance pour la nouvelle installation UPCC décelés pour prise en compte, soit en révisant le cahier des charges, soit en indiquant les tests à réaliser lors des étapes de qualification.

12 Devant la lourdeur et la complexité du travail réalisé pour résoudre la majorité des dysfonctionnements observés, cette présentation a mis en avant la nécessité de rédiger le cahier des charges sur la base d une analyse de risque formalisée au préalable s appuyant sur des outils de gestion de projet et d aide à l exploitation tels que les normes NFS et l annexe H de l ISO L analyse de la sûreté de fonctionnement qui en résulte sera une garantie pour l utilisateur d avoir une salle robuste et fonctionnelle à long terme.

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