7. Séquençage des protéines

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1 7. équençage des protéines Protéine inconnue séquençage des acides aminés tructure primaire structure secondaire structure tertiaire structure quaternaire tratégie de séquençage d une protéine tratégie de base développée par Frederick anger en 1953 (Prix Nobel 1958) Étapes impliquées dans le séquençage d une protéine: Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités) dans la protéine Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires) Détermination de la composition des acides aminés de chaque chaîne polypeptidique Les chaînes polypeptiques sont souvent trop longues pour être directement séquencées; elles doivent avant être coupées en des plus petits fragments peptidiques par des réactions spécifiques. Détermination de la séquence de chacun des fragments peptidiques par la dégradation d Edman Élucidation de la séquence de chacune des chaînes polypeptidiques par recouvrement des séquences des différents fragments Détermination de la structure de la protéine entière, incluant les liens disulfures entre les sous-unités 266

2 7.2 Analyse des résidus terminaux R N 3 N R N R R N C - résidu N-terminal résidu C-terminal Puisque chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N- terminal et C-terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une protéine peut être déterminé en identifiant le nombre de chacun des résidus terminaux Analyse N-terminal Réaction avec du chlorure dansyl (réagit avec des α-amines): N(C 3 ) 2 Cl chlorure dansyl R 2 2 N C C N C C N C C... Cl N(C 3 ) 2 2 R 2 N C C N C C N C C... polypeptide dansyl N(C 3 ) 2 N(C 3 ) 2 2 R 2 N C C N C C N C C N C C R 2 N 3 C C N 3 C C... acide aminé dansyl (espèce fluorescente) acides aminés libres 268

3 Dégradation d Edman (analyse séquentielle): = phényl isothiocyanate (PITC) (séquençage de peptides constitués de 40 à 60 résidus) 269 N C PITC R 2 2 N C C N C C N C C... 3 N R 2 C N C C N C C N C C... PITC polypeptide acide trifluoroacétique N N Ph 1. extraction dans un solvant organique R 2 N 3 C C N C C traitement avec 3 N NPh dérivé phénylthiohydantoin dérivé thiazolinone λ max = 296 nm répétition du cycle 270

4 équençage automatisé par dégradation d Edman 271 Réaction enzymatique (exopeptidase): R 2 2 N C C N C C N C C... aminopeptidase R 2 2 N C C - N 3 C C N C C... L utilité des aminopeptidases pour l analyse des résidus N-terminal est limitée puisque ces enzymes agissent spécifiquement sur certains acides aminés et avec des vitesses de réaction différentes. 272

5 7.2.2 Analyse C-terminal Il n y pas de processus comparable à la dégradation d Edman pour l analyse séquentielle des résidus C-terminal. Réaction enzymatique (exopeptidase):... R 2 N C C N C C N C C - carboxypeptidase R 2... N C C N C C - 3 N C C - Due à la nature sélective des carboxypeptidases, certains résidus sont résistants aux coupures ou sont coupés très lentement. 273 Réaction chimique (ex. hydrazinolyse): 3 N C C... R n-1 N C C N C C - R n polypeptide 90 C, h N 2 -N 2 conditions légèrement acide 3 N C C - R n N 3 R n-1 C C N N N C C N-N 2 acide aminé libre hydrazines aminoacyles 274

6 7.3 Coupure des liens disulfures C - C - C - C - 3 N C 3 N C 3 N C 3 N C C 2 C 2 C 2 C 2 Cystéine Cystéine Cystine Insuline Les liens disulfures doivent être coupés avant le séquençage pour séparer et déplier les sous-unités. 275 xydation avec de l acide performique: Cystine N N C C 2 C 2 C C Acide cystéique N N C - C C 2 C C C C C Toutes les cystéines dans une protéine sont oxydées (celles qui sont liées ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol). L acide performique réagit aussi avec d autres résidus; ex. le groupement indole de la Trp est partiellement détruit et les résidus Met sont oxydés. C 3 C 3 (C 2 ) 2 N C C C (C 2 ) 2 N C C Méthionine 276

7 Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol: Cystine N N C C 2 C 2 C C C 2 C 2 C 2 ou C 2 C 2 C C 2 Cystéines N N C C 2 C 2 C C C C 2 C 2 ou C 2 C Pour empêcher la ré-oxydation de la cystéine formée: N C C 2 N IC 2 C - alkylation C C 2 C 2 C - I C Iodoacétate C Cystéine Cystéine protégée 278

8 7.4 Détermination de la composition d acides aminés d une protéine Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique est un paramètre caractéristique de chaque protéine. Une protéine inconnue peut souvent être identifiée en mesurant le pourcentage relatif des différents acides aminés et en comparant avec des bases de données. Premièrement, les liens peptidiques dans une protéine sont hydrolysés par traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides aminés libérés sont ensuite séparés et quantifiés. Traitement acide: polypeptides 6 M Cl, reflux à C pour 24 hres sous vide. 279 Des temps de réaction plus long sont nécessaires pour une hydrolyse complète des résidus Leu, Val et Ile. Par contre, certains résidus sont dégradés dans ces conditions sévères. Trp est considérablement dégradée. La vitesse de dégradation de certains résidus, tels que Thr, Tyr et er peut être mesurée et un facteur de correction peut être inclut pour tenir compte de la perte de ces acides aminés en fonction du temps d hydrolyse. De plus, l hydrolyse acide convertit Asn à Asp et Gln à Glu, respectivement (du N 4 est éliminé). Pour déterminer la quantité de ces acides aminés, la teneur totale de Asx (Asn Asp), Glx (Gln Glu) et N 4 (Asn Gln) doit être mesurée et comparée. Puisque des conditions optimales pour l hydrolyse acide sont difficiles à établir, la réaction est effectuée plusieurs fois dans des conditions différentes et la composition des acides aminés est déduite à partir des différentes expériences d hydrolyse. 280

9 ydrolyse basique: Polypeptides 6 M Na, reflux à 100 C pendant 4 à 8 hres. L hydrolyse basique est seulement utilisée dans des cas spéciaux puisqu elle est plus problématique que l hydrolyse acide. Dans ces conditions, Arg, Cys, er et Thr sont décomposées et d autres résidus sont dé-aminés et racémisés. Ceci limite l utilisation de l hydrolyse basique à la détermination de la teneur en Trp. Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la détermination de l Asn, de la Gln et du Trp. Puisque les exopeptidases et endopeptidases exhibent des spécificités élevées, il est essentiel d utiliser un mélange d enzymes pour assurer l hydrolyse de tout les liens peptidiques. Des faibles concentrations d enzymes doivent être utilisées (~1%) puisqu elles sont aussi des protéines qui peuvent être dégradées et contaminées le mélange réactionnel. 281 Après hydrolyse, les acides aminés libres sont séparés par chromatographie à échange d ions ou par PLC à phase inversée. Exemple: composition des acides aminés dans un peptide (Ala, Arg, Asp, Gly 2, Phe) N(C 3 ) 2 2 N C C C 2 C 2 N C C dérivés fluorescents Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention et quantifiés selon leur volume d élution. 282

10 7.5 Coupure spécifique des liens peptidiques Fragmentation enzymatique Endopeptidases: Coupure spécifique de liens peptidiques à l intérieure d une chaîne Exopeptidases: Coupure d un acide aminé N- ou C-terminal d une chaîne peptidique 283 trypsine Protection de la Lys et de l Arg contre l hydrolyse par la trypsine 284

11 La charge positive sur ce dérivé de la cystéine rend cet acide aminé plus susceptible à l hydrolyse par la trypsine Fragmentation chimique Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal d un résidu Met. Br

12 7.6 Détermination de l ordre des fragments peptidiques La séquence des fragments peptidiques individuels est déterminé en établissant l ordre dans lequel ils étaient connectés. La séquence des acides aminés dans un 1 er set de fragments est comparé avec celui d un 2 è set de fragments pour lequel les points de coupure sont différents. Un recouvrement de quelques résidus est généralement suffisant pour identifier un point de connexion Détermination des positions des liens disulfures Fragmentation de la protéine native => mélange de fragments peptidiques, dont certains sont liés par des ponts disulfures Le mélange peptidique est analysé par électrophorèse sur gel en 2D en utilisant les mêmes conditions de séparation dans les deux directions. Après séparation dans la 1 ère direction, la matrice est exposée à l acide performique pour couper tout les liens disulfures existants. Ensuite la séparation est effectuée dans la 2 è directions. Les fragments qui ne contiennent pas de liens disulfures sont positionnés sur la diagonale puisque leur vitesse de migration dans le deux directions est identique. 288

13 L électrophérogramme des fragments contenant des liens disulfures montrera 2 points pour les fragments produits par oxydation qui sont positionnés on dehors de la diagonale. Les fragments liés par des ponts disulfures peuvent être isolés du gel et identifiés par séquençage. La séquence des acides aminés est ensuite comparer avec celle de la protéine entière, permettant ainsi l identification de la position des liens disulfures. 289