Mémoire de Magistère

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1 MINISTERE DE L ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université d'oran Es Senia Faculté des Sciences Département de Biologie Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire./ :4;/ 3<:= 6<79;9<>;/?@A BC/DE;/ F5G/ 2 3HDEI;/ 6<79;9<@J 0>K5 Mémoire de Magistère Option : Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire Thème ÉTUDE DU POTENTIEL ANTIGÉNIQUE DES PROTÉINES DU LACTOSÉRUM BOVIN APRÈS HYDROLYSE ENZYMATIQUE TRYPSIQUE ET CHYMOTRYPSIQUE SOUS IRRADIATION AUX MICRO-ONDES Présenté par : Mme KAZI TANI AMILA (épouse ABER AOUNI) Membres du jury : Président : Mr BOUTIBA Z. Professeur, Université d Oran Examinateur : Mr KHEROUA O. Mr AOUES AEK Professeur, Université d Oran Professeur, Université d Oran Rapporteur : Mr SAIDI D. Professeur, Université d Oran Co-rapporteur : Mr EL MECHERFI K-E. Chargé de cours, Université d USTO

2 Remerciements Mes premiers remerciements iront à Mr. SAIDI et Mr. KHEROUA pour leur accueil au sein du laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire. Je suis reconnaissante à mon encadreur, Pr. SAIDI Djamel de m avoir fait bénéficier de son expérience et de sa compétence ainsi que de la confiance qu'il m'a toujours témoignée. Je le remercie également pour ses corrections et ses relectures averties. Un remerciement particulier à Mr. BOUTIBA Zitouni, professeur à l université d Oran, qui a bien voulu accepter de présider le jury. Mes remerciements vont également au Pr. AOUES AEK, Professeur à l université d Oran qui a bien voulu accepter de juger mon travail. Qu il trouve ici l expression de ma profonde gratitude. Je remercie aussi Pr. KHEROUA Omar, professeur à l université d Oran pour le temps qu il a consacré à la correction de mon mémoire. Je remercie tout particulièrement Mr. ELMECHERFI Kamel, Maitre assistant à l Université des Sciences et Technologies d Oran de m avoir assistée durant mon experimentation ainsi que pour ses precieux conseils. Je remercie tous les membres du laboratoire de la Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire ; Mr. Chekroun A, Mr. Mezmaze F, Mme Addou S, Mme Belarbi H, Mme Mehedi N et Mlle Kadouri H. Merci aussi à tous mes collègues du laboratoire qui m ont aidé ou conseillé et qui se reconnaîtront ici. J exprime ma profonde sympathie à Djazia, Hassina, Omar et kawthar ; je les remercie pour leur aide, leur soutien durant l année pratique et leur souhaite une bonne continuation.

3 Résumé Les laits à base d hydrolysats de protéines sont fréquemment utilisés comme substituts pour les enfants présentant une APLV. Toutefois, des cas d hypersensibilité vis-à-vis de ces laits ont été rapportés. C est pourquoi, il est essentiel de trouver une formule ne présentant pas de risques liés à la consommation des laits infantiles. L objectif de ce travail est de déterminer l effet de l hydrolyse trypsique ou chymotrypsique combiné aux micro-ondes sur l antigénicité des principales protéines du lactosérum. Les lactosérums ont subit une hydrolyse trypsique ou chymotrypsique combinée à un traitement par les micro-ondes (40 c) pendant 5 ou 15 minutes. Un autre lot de lactosérums a été soumis à une hydrolyse enzymatique de même type mais incubé au bain marie à 40 c pendant 5 ou 15 minutes afin de nous servir de référence. Sur les différents échantillons, on a procédé à une évaluation de l antigénicité des lactoprotéines sériques par la méthode ELISA, vis-à-vis des IgG spécifiques anti g-lg et anti h- La obtenues chez le lapin. La technique du Western blot a ensuite été réalisée afin de confirmer les résultats obtenus par la méthode précédente. Les résultats obtenus montrent que : L hydrolyse par la trypsine combinée aux rayonnements micro-ondes diminue significativement (p<0,05) la réactivité du lactosérum vis-à-vis des IgG anti g-lg. L hydrolyse par la chymotrypsine combinée aux rayonnements micro-ondes pendant 5 min entraine une baisse significative (p<0,05) de la réactivité du lactosérum vis-à-vis des IgG anti g-lg et elle est d autant plus significative à 15 min de traitement (p<0,01). La réactivité vis-à-vis des IgG anti h-la des lactosérums soumis au traitement micro-ondes seul a par contre augmenté (p<0,05) en comparaison avec le lactosérum natif. le pouvoir antigénique anti h-la des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques soumis au bain marie est moins important par rapport aux hydrolysats soumis aux micro-ondes. En conclusion, l hydrolyse enzymatique combinée aux rayonnements micro-ondes semble diminuer sensiblement l antigénicité de la g-lg, ce qui n est pas le cas de l h-la dont l antigénicité s est vue stable sous l influence des M.O.Ceci nous amène à supposer que l effet combiné du traitement micro-ondes à l hydrolyse enzymatique a facilité le clivage de la g-lg par les endoprotéases à l opposé de l h-la qui a résisté à l hydrolyse enzymatique sous micro-ondes avec probablement un démasquage d épitopes antigéniques initialement cachés dans la forme tridimensionnelle de la protéine. Mots clés : Hydrolyse Trypsique Hydrolyse Chymotrypsique Micro-ondes Antigénicité O-Lactoglobuline P- Lactalbumine Réactivité.

4 Abstract The milk-based protein hydrolysates are commonly used as substitutes for children with APLV. However, cases of hypersensitivity vis-à-vis these milks have been reported. It is therefore essential to find a formula showing no risks associated with consumption of infant milk. This work is aimed to determine the effect of microwave (MW) treatment combined with tryptic or chymotryptic hydrolysis on antigenicity of the main whey proteins. The bovine whey are submited to microwave (40 Ccombined with tryptic and chymotryptic hydrolysis for 5 or 15 minutes. Another aliquots of whey was subjected to a similar enzymatic hydrolysis but incubated in a bath water at 40 C for 5 or 15 minutes to serve as a reference. Of the different samples, we evaluated antigenicity of whey proteins by ELISA method, towards specific IgG anti g-lg and anti h -La obtained from rabbits. The technique of western-blot was then performed to confirm the results of the previous method. The results show that: The hydrolysis by trypsin combined with microwaves decreases significantly (p <0.05) whey s reactivity towards IgG anti g-lg. Hydrolysis by chymotrypsin combined with microwave irradiation causes a significant decrease (p <0,05) of the reactivity of whey towards IgG anti g-lg. That was more significant at 15 min of exposure. Responsiveness towards IgG anti h-la, of the whey submitted to microwave treatment increased compared to the native whey. The same observation was made for tryptic and chymotryptic hydrolysates; the conventional hydrolysis of whey were more efficient than the hydrolysis under microwaves. In conclusion, enzymatic hydrolysis combined with the microwave treatment seems to significantly decrease the antigenicity of g-lg.it is not the case of h-la s antigenicity wich was steady under the influence of MO. This leads us to suppose that microwaves could favour the exposure of some residues specifically recognised by proteases and then, enhance hydrolysis. In the opposite, h-la was resistant to proteolysis under MW, and this treatment probably display hidden epitopes in three dimensional shape of the protein Keywords: tryptic Hydrolysis chymotryptic Hydrolysis - Microwave - Antigenicity - O-lactoglobulin - P-lactalbumin - Reactivity.

5 Westernblot!!!,. # $ % & ' (!! )* +*, -. /.. 0 1* 2! $ 345! (, 8!! 0.! 7 )0; &, 9 & :5. '&! < $ =; > ( $ =; >!.! )0. <, # ), ( )A )* % 2 <, # )*!! $.ELISA (!- 7 < (..! 5 7 GA > : IgG ' ( 7!, 7 # $ ( >! )0;. Lg ' 7!K # ( 5 $ JK! )0;.( 15. )&, Lg IGg La IgG $ ( > 7!,. G )A )*!! 0; 7 La 4. $ ( G 7 : ) La,2 < Lg!, $ ( > )0;. $ JK! 1!K 4K La $,Lg 0; 3 5! $ $ JK )0; 4-. G!. 5 A )* >!K M *,! $ ( )0; :. 4 _ (!, O$ 8 ( )! )!

6 Liste des abréviations AA : acides aminés. ACF : Adjuvant Complet de Freund. Ac/Ag : Anticorps/Antigène. AIF : Adjuvant Incomplet de Freund. AG : Acides Gras. APLV : Allergie aux Protéines du Lait de Vache. h-la : h Lactalbumine. BCR : B Cell Receptor. l-lg : beta lactoglobuline. B M : bain marie. C.M.H : Complexe Majeur d Histocompatibilité. CPA : Cellules Présentatrice d Antigène. Cys : Cysteine. Da : Daltons. ELISA : Enzymes Linked Immunosorbant Assay. E/S : enzyme/substrat. GALT : Gut Associated Lymphoid Tissue. HP : Haute Pression IgA, IgE, IgG : Immunoglobulines A,E,G. IgG-HRP : IgG-Horse Radish Peroxydase. IL4 : Interleukine 4. KDa : Kilo Daltons LB et LT : lymphocytes B et T. Lf : Lactoferrine. MO : Micro-ondes. OPD : Ortho Phenylène Diamine. PM : poids moléculaire. PLV : Protéines du Lait de Vache. PVDF : Polyvinyylidene Di Fluoride. SAB : Sérum Albumine Bovine. SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis. TCR : T Cell Receptor.

7 Liste des figures et des tableaux 1. Liste des figures Figure 1. Structure moléculaire de la -Lactoglobuline Figure 2. Structure de l -Lactalbumine Figure 3. Organisation schématique des tissus lymphoïdes associés à la paroi digestive Figure 4. Prise en charge des antigènes alimentaires présents dans la lumière intestinale et leur présentation au système immunitaire associé à la muqueuse intestinale Figure 5. Représentation schématique de deux anticorps interagissant avec un épitope linéaire et conformationnel Figure 6. Représentation schématique des séquences antigéniques de la -Lg- 18 Figure 7. Représentation schématique des séquences antigéniques de l -La Figure 8. Représentation schématique de l action des enzymes pancréatiques Figure 9. Représentation schématique de la plaque ELISA «Nunc,Maxisorb» 96 puits à fond plat Figure 10. Représentation schématique du dispositif d immunoblot Figure 11. Titres en IgG sériques anti - Lg et anti -La mesurés par la technique ELISA chez des lapins immunisés à la -Lg Figure 12. Réactivité vis-à-vis des IgG anti--lg du lactosérum traité aux microondes comparé au lactosérum natif Figure 13. Réactivité vis-à-vis des IgG anti--la du lactosérum traité aux MO par rapport au lactosérum natif Figure 14. Réactivité vis-à-vis des IgG anti -Lg des hydrolysats trypsiques traités aux MO pendant 5 ou 15 minutes

8 Figure 15. Réactivité vis-à-vis des IgG anti -La des hydrolysats trypsiques traités par les micro-ondes pendant 5 ou 15 minutes Figure 16. Réactivité vis-à-vis des IgG anti -Lg des hydrolysats chymotrypsiques sous micro-ondes pendant 5 et 15 minutes Figure 17. Réactivité vis-à-vis des IgG anti -La des hydrolysats chymotrypsiques traités par les micro-ondes pendant5 et 15 min Figure 18. Profils éléctrophorètiques et immunoblots des lactosérums natifs et traités, et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Figure 19. Profils éléctrophorètiques et immunoblots des lactosérums natifs et traités, et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Liste des tableaux Tableau 1. Barrières digestives à l absorption d antigènes étrangers Tableau 2. Comparaison entre la reconnaissance de l antigène par les Lymphocytes B et T (LB, LT) Tableau 3. Exemple de protéases commerciales utilisées pour l hydrolyse des protéines Tableau 4. Digestion des protides chez le nouveau-né Tableau 5. Peptides issus de l hydrolyse trypsique de la -LG Tableau 6. Peptides issus de l hydrolyse chymotrypsique de la -LG Tableau 7. Adjuvants et mécanismes d action Tableau 8. Composition des gels de polyacrylamide- SDS 5% et 15% Tableau 9. Composition des tampons d échantillon et de migration (SDS-PAGE) 42 Tableau 10. Composition des solutions de coloration et de décoloration Tableau 11. Composition du tampon de transfert (Western blot) Tableau 12. Composition de la solution de révélation

9 SOMMAIRE INTRODUCTION RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Généralité sur les lactoprotéines La -Lactoglobuline L - Lactalbumine La sérum albumine bovine et la lactoferrine Antigénicité des protéines du lactosérum Réponse immune vis-à-vis des aliments; la barrière immunologique Immunogénicité, antigénicité et allergénicité L immunogénicité Le caractère étranger La taille moléculaire Composition et hétérogénéité chimique Sensibilité à l apprêtement et à la présentation de l antigène L antigénicité L allergénicité Epitopes Antigénicité de la -Lg Antigénicité de l -La Différents procédés de réduction de l antigénicité du lait de vache Le traitement thermique L hydrolyse enzymatique L hydrolyse bactérienne La haute pression Les micro-ondes Le génie génétique

10 SOMMAIRE MATERIEL ET METHODES 1. Immunisation du modèle animal Animaux Antigènes Adjuvants Protocole d immunisation Prélèvements sanguins Méthodes d analyses Dosage des anticorps IgG sériques par ELISA Principe général de la méthode ELISA Mode opératoire Evaluation de la réactivité des lactosérums et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Echantillons d hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Mesure de la réactivité vis-à-vis des IgG anti -La et des IgG anti -Lg par ELISA Méthodes statistiques Evaluation de l immunoréactivité des hydrolysats trypsiques ou chymotrypsiques par la technique du Western blot Principe de la méthode Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS Principe Mode opératoire Transfert sur membrane : Mode opératoire

11 SOMMAIRE RESULTATS 1. Evaluation du degré d immunisation des lapins Antigénicité des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques traités aux microondes Réactivité du lactosérum natif Réactivité des lactosérums traités par les micro-ondes Mesure de la réactivité des hydrolysats trypsiques soumis aux rayonnements micro-ondes Réactivité vis-à-vis de la -Lg Réactivité vis-à-vis de l -La Réactivité des hydrolysats chymotrypsiques soumis aux micro-ondes Antigénicité de la -Lg Réactivité vis-à-vis des IgG anti -La Etude de l antigénicité résiduelle des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques sous l influence des MO par le Western blot Antigénicité de la -Lg Antigénicité de l -La DISCUSSION CONCLUSION REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES

12 INTRODUCTION - 0 -

13 INTRODUCTION INTRODUCTION Le lait constitue le premier aliment du nouveau né chez tous les mammifères. Cependant, sa composition varie selon les espèces; les besoins nutritionnels d un nourrisson pendant ses premiers mois sont essentiellement destinés au développement cérébral (Harrington et al., 2002), tandis que ceux d un animal nouveau né, sont consacrés au gain pondéral. De ce fait, le lait le mieux adapté à la physiologie du bébé, reste indéniablement le lait maternel. Mais il arrive que ce dernier soit, pour des raisons diverses, substitué par du lait de vache. Néanmoins, celui-ci ne doit pas être donné au tout petit tel quel car il est trop riche en protéines et en sels minéraux et pauvre en vitamines et en fer (Lissauer et Clayden, 1998). L allergie aux protéines du lait serait essentiellement due aux protéines solubles, en particulier la gplactoglobuline (Wal, 2004). On sait diminuer le caractère allergène du lait par élimination des protéines solubles par ultrafiltration et reconstitution d un lait ne contenant que la fraction caséinique, par dénaturation des protéines par la chaleur ou par hydrolyse enzymatique (Høst et al., 1999). Mais, ces traitements se sont avérés inefficaces, pour une petite partie de la population atopique, à la suite de la persistance de peptides résiduels (Committee on Nutrition, 2000). Pour les enfants allergiques à la g-lg, hormis le lait maternel, seules les formules infantiles hypoallergéniques à base de protéines laitières extensivement hydrolysées, faites d oligopeptides de poids moléculaire inférieur à 1200 Da ou à base d acides aminés libres sont prescrites (De Boissieu et Dupont, 2007). Par contre, pour prévenir les allergies chez les enfants classés à risque (ayant des antécédents familiaux allergiques), deux stratégies sont envisagées : la modification de l allergène ou la modification de la réponse immunitaire de l enfant ayant ingéré l allergène. Pour la première stratégie, l hydrolyse partielle des protéines et le traitement thermique ont été proposés pour déstabiliser la structure des protéines et cliver les épitopes responsables des allergies (Bonomi et al., 2003). Pour la seconde stratégie, l induction de la tolérance orale à l allergène semble être une approche de choix ; l induction de la tolérance orale est une démarche thérapeutique actuelle des allergies alimentaires persistantes. En cas de succès, elle améliore considérablement la qualité de vie des patients (Feuillet-Dassonval, 2008). Plusieurs recherches sont effectuées afin de trouver une solution au problème de l hypersensibilité vis-à-vis des laits dits hypoallergéniques, et plusieurs combinaisons - 1 -

14 INTRODUCTION de traitements sont mises au point dans le but de réduire l antigénicité des laits (Hayashi et al., 1987 ; Dufour et al., 1992 ; Bonomi et al., 1999 ; Bonomi et al., 2003 ;; Izquierdo et al., 2005 ; Penas et al., 2006 ; 2006b ; Izquierdo et al., 2007 ; 2008). Le traitement thermique du lait par les micro-ondes a été étudié et comparé au chauffage conventionnel; la littérature rapporte des taux de dénaturation protéique similaires obtenus avec les deux types de traitements (Villamiel et al., 1996). Les rayonnements micro-ondes combinés à l hydrolyse enzymatique pourraient ils diminuer davantage l immunoreactivité des protéines du lactosérum? Pour répondre à cette question, une étude a été, en premier lieu, réalisée dans notre laboratoire par Salah (2008) afin d évaluer l impact du traitement par les microondes combiné à une hydrolyse trypsique ou chymotrypsique, sur les paramètres biochimiques des protéines du lactosérum bovin. Les résultats obtenus ont montré une diminution de la concentration protéique des lactosérums hydrolysés sous micro-ondes. Notre travail a été entrepris, en continuité de ce qui a été fait précédemment, afin d évaluer l antigénicité résiduelle de ces hydrolysats sous l influence des rayonnements micro-ondes

15 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 3

16 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1. GENERALITE SUR LES LACTOPROTEINES Les protéines du lait de vache sont représentées par 80% de caséines et 20% de protéines du lactosérum. Les protéines dominantes peuvent être électrophorétiquement séparées en quatre caséines hs1, hs2, g et x (Miller et al., 1999). Dans le lactosérum, les deux principales protéines sériques sont la g-lactoglobuline et l h-lactalbumine, représentant respectivement environ 55% et 22% des protéines totales. Les autres protéines, dites mineures, sont la sérum albumine bovine (~7%), les immunoglobulines (~13%) et la lactoferrine (~4%) (Amiot et al., 2002). La fraction protéique restante constitue principalement l azote non protéique et des traces de plusieurs protéines, incluant approximativement 60 enzymes endogènes (Fox, 2003). La structure des protéines du lactosérum est typiquement globulaire et compacte, avec une distribution séquentielle relativement uniforme de résidus polaires, apolaires et chargés. Les protéines subissent un repliement intramoléculaire en raison de la formation de ponts disulfures entre les résidus de cystéines, ce qui entraine un enfouissement de la plupart des résidus hydrophobes à l'intérieur de la molécule. C est pour cela que les protéines du lactosérum, à l état natif, ne s agrègent pas fortement ou n'interagissent pas avec d'autres protéines (Varnam et al., 1994) La 3-Lactoglobuline C est la protéine majeure du lactosérum; elle a un poids moléculaire d environ Daltons et compte 162 résidus d acides aminés dont cinq cystéines; quatre formant deux ponts disulfures (Cys 66-Cys 160, Cys106-Cys119) (Figure 1.) et une possédant un groupe thiol libre (Cys 121) qui à l état natif, est caché par une hélice h. (Amiot et al., 2002; Jouan, 2002; Fox, 2003; Tolkach et al., 2007). La structure moléculaire de la g-lg comprend : 44-52% de feuillets g, 6-10% d hélices h, 8-10% de courbures et 32-35% d enroulements au hasard (Casal et al., 1988; Dong et al., 1996; Qi et al., 1997). La quantité importante de feuillets g serait responsable des interactions entre les monomères, pouvant mener jusqu à l agrégation et la gélification de la protéine (Sawyer et al., 2000). La structure tertiaire montre une petite poche hydrophobe «calice», formée par les feuillets g et qui lui permet de fixer le rétinol et certains acides gras (Amiot et al., 2002; Yada, 2004). 4

17 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 1. Structure moléculaire de la g-lactoglobuline (Protein Data Bank file 1B0O, RCBS). 5

18 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1.2. L 6-lactalbumine C est une métalloprotéine de PM d environ Da (Jouan, 2002) qui représente environ 22% des protéines du sérum. Elle possède deux variants génétiques, le variant B étant le plus présent dans le lait (Amiot et al., 2002). La conformation de l h-la est constituée de 2 domaines; une région d hélices h et une région de feuillets g (Figure 2.), unis par la région liant l ion calcium (Permiakov, 2004). Cette protéine de 123 acides aminés possède 8 cystéines (Pougheon et Goursaud, 2001), sa structure compacte est de ce fait stabilisée par 4 ponts disulfures intermoléculaires (Chrysina et al., 2000) et un cation, soit le calcium, pour qui elle a une haute affinité grâce à un site de liaison spécifique. Elle possède également une portion hydrophobe qui semble être le site de fixation de la galactosyl transférase, laquelle joue un rôle dans la biosynthèse du lactose (Amiot et al., 2002; Jouan, 2002) La sérum albumine bovine et la lactoferrine En plus de la g-lg et de l h-la, le lactosérum contient d autres allergènes mineurs représentés par la sérum albumine bovine (SAB) et la lactoferrine (Lf) (Kotsonis et Mackey, 2002). La sérum albumine du lait, 582 AA, est identique à la sérum albumine sanguine : même composition en acides aminés, même poids moléculaire (66267 Da), même propriétés électrophorétiques et immunologiques (Pougheon et Goursaud, 2001). La SAB possède un groupement sulfhydrile libre ainsi que 17 ponts disulfures qui stabilisent sa structure (Lieske et al., 2005). Grace à sa faculté de liaisons réversibles, elle joue un rôle de transporteur de molécules et ions divers, colorants, médicaments, A.G, métaux divalents (Jouan, 2002) La Lf bovine est une glycoprotéine constituée de 689 résidus d acides aminés avec une structure primaire 69% identique à celle de la lactoferrine humaine (Tanaka, 2007). Elle a un poids moléculaire d environ Da et possède un pont disulfure externe (Cys160-Cys183) que l on ne retrouve pas dans la Lf humaine (Baker et al., 1998). Il a été démontré que la lactoferrine native pouvait induire une réponse IgG non négligeable comparée à la Lf recombinante, cependant seule la protéine native entrainait une réponse IgE (Dearman et Kimber, 2002). 6

19 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 2. Structure de l h-lactalbumine (Bushmarina et al., 2005). 7

20 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 2. ANTIGENICITE DES PROTEINES DU LACTOSERUM 2.1. Réponse immune vis-à-vis des aliments; la barrière immunologique La fonction première de l appareil digestif est de transformer l aliment ingéré en une forme qui pourra être absorbée et utilisée en énergie et comme facteur de croissance. Pendant cette transformation, les antigènes étrangers doivent être neutralisés et interdits de pénétrer dans l organisme proprement dit. La barrière gastro-intestinale utilise à la fois des mécanismes physiologiques et des mécanismes immunologiques pour remplir la fonction de défense (tableau 1.). Cependant, un certain nombre de ces mécanismes sont immatures à la naissance et favorisent ainsi le risque de pénétration des antigènes alimentaires chez le nourrisson (Turberg-Romain, 2003). Dans les conditions physiologiques normales, les protéines alimentaires sont donc largement dénaturées et dégradées du fait de l acidité gastrique et des attaques enzymatiques survenant dans l estomac et l intestin. Dans la plupart des cas, ces attaques détruisent les épitopes immunogéniques et conduisent finalement à une «ignorance immunitaire». Le système immunitaire intestinal comporte plusieurs localisations lymphoïdes bien individualisées: la muqueuse digestive, les ganglions mésentériques et des ilots lymphoïdes régulièrement répartis sur toute la longueur de l intestin. Ces ilots sont groupés dans l intestin grêle où ils constituent les plaques de Peyer ou sont contigus au niveau de l appendice. Les plaques de Peyer (figure 3) comportent trois zones distinctes (Bach et Chatenoud, 2002) : Les follicules lymphoïdes où les stimulations antigéniques y font apparaître des centres germinatifs où se localisent les lymphocytes B en cours de différenciation. Le dôme, situé au dessus du follicule lymphoïde, où l on retrouve des lymphocytes B (LB), des lymphocytes T (LT) et des macrophages. L épithélium de surface qui comporte des cellules spécialisées, les cellules M qui sont particulièrement perméables aux antigènes présents dans la lumière intestinale. Les cellules M sélectionnent et transportent de manière active des particules antigéniques de la lumière intestinale dans la zone du dôme. Des cellules dendritiques dispersées le long de l intestin, au sein de la lamina propria, sont par ailleurs responsables de la surveillance et de l échantillonnage permanent des antigènes solubles présents dans la lumière intestinale (Figure 4.), et de leurs transports au niveau des 8

21 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 1. Barrières digestives à l absorption d antigènes étrangers (Turberg-Romain, 2003) Barrières physiologiques Barrières immunologiques Dégradation des antigènes ingérés dans la lumière intestinale. Acide gastrique et pepsine. Enzymes pancréatiques. Enzymes intestinales. Activité du lysozyme des cellules épithéliales intestinales. Péristaltisme gastrointestinal. Rôle du mucus intestinal (glycocalyx). Présence d IgA sécrétoires spécifiques d antigènes dans la lumière intestinale. Blocage de la pénétration des antigènes ingérés. Présence d IgA et IgG spécifiques. Présence des macrophages intestinaux. Rôle du système réticuloendothélial Composition de la membrane micro-villositaire intestinale. 9

22 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 3. Organisation schématique des tissus lymphoïdes associés à la paroi digestive d après Fortun-Lamothe et Boullier (2004). 10

23 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 4. Prise en charge des antigènes alimentaires présents dans la lumière intestinale et leur présentation au système immunitaire associé à la muqueuse intestinale. Le passage transépithélial des antigènes présents dans la lumière intestinale et leur présentation au système immunitaire du GALT implique trois voies différentes : (1) La capture par les cellules M recouvrant les plaques de Peyer, (2) L échantillonnage direct par les cellules dendritiques de la lamina propria, via des dendrites s étendant dans la lumière intestinale, et (3) (a) Endocytose des antigènes par les cellules épithéliales puis présentation aux cellules T sous-jacentes ou (b) libération d exosomes portant les peptides antigéniques associés aux molécules du complexe majeur d histocompatibilité. Adapté d après Mallegol et al.,

24 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ganglions mésentériques (Mesenteric Lymph Nodes [MLN]) qui drainent la sous-muqueuse intestinale. Une réponse immunitaire spécifique est alors induite, résultant en l activation des cellules T et B présentes (Adel-Patient et al., 2008). Dans les plaques de Peyer se trouvent des cellules T spécialisées qui induisent la commutation des LB immatures porteurs d IgM en producteur d IgA (Charpel et al., 2004). Les IgA sécrétoires représentent une première ligne de défense permettant d éviter le contact des antigènes avec le système immunitaire intestinal. Il a été suggéré que l absence d IgAs, lors des déficits en immunoglobuline A, comme c est le cas chez le nouveau-né, laisse pénétrer dans l organisme de nombreux antigènes (Letonturier, 2007) Immunogénicité, antigénicité et allergénicité L immunogénicité C est l aptitude d une molécule à induire une réponse immune spécifique (Paraf et Peltre, 1991). L immunogénicité est déterminée en partie, par quatre propriétés de l immunogène (Kindt et al., 2008) : Le caractère étranger Pour susciter une réponse immunitaire, une molécule doit être reconnue par le système biologique comme ne faisant pas partie du soi La taille moléculaire Il existe une corrélation entre la taille d une macromolécule et son immunogénicité. Les meilleurs immunogènes tendent à avoir une masse moléculaire approchant Daltons Composition et hétérogénéité chimique Des études ont montré que la complexité chimique contribue à l immunogénicité. Les 4 niveaux d organisation des protéines (I aire, IIaire, IIIaire et IVaire) contribuent à la complexité structurale des protéines et donc affectent leur immunogénicité Sensibilité à l apprêtement et à la présentation de l antigène Le développement des réponses immunitaires humorale ou à médiation cellulaire nécessite l interaction des cellules T et d un antigène qui est apprêté et présenté associé à des molécules du CMH. Les grosses molécules insolubles sont généralement plus immunogènes que les petites molécules solubles, parce qu elles sont plus aisément phagocytées et apprêtées (Kindt et al., 2008). 12

25 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES L antigénicité L antigénicité d'une protéine se rapporte à sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs ou aux paratopes fonctionnels de certaines molécules d'immunoglobulines (Regenmortel, 1988). Celle-ci est différente d une protéine à une autre suivant la qualité et la quantité des épitopes spécifiques qu elle porte (Nentwich et al., 2004). Les protéines ou glycoprotéines doivent avoir un poids moléculaire supérieur à 10 kda, les polysaccharides > 50 kda et les substances ne doivent pas faire partie du «soi» par rapport au système immunitaire en question (Becker et Reese, 2001). La définition des antigènes comme celle des anticorps comporte deux facettes, l une concerne l induction de la réponse immunitaire, l autre sa spécificité, c'est-à-dire la réaction de l anticorps avec l antigène qui a induit sa production. Les molécules de grande taille sont habituellement pourvues de la double capacité de stimuler la production des anticorps et de réagir avec eux (Van Oss, 1994 ; Bach et Chatenoud, 2002). En général, la population d anticorps produits en réponse à un stimulus antigénique particulier est hétérogène. La plupart des antigènes sont complexes du point de vue de leur structure, contiennent de nombreux épitopes différents, et le système immunitaire répond habituellement en produisant des anticorps contre plusieurs épitopes de cet antigène (Kindt et al., 2008) L allergénicité C est la capacité d une protéine (dans la majorité des cas) à susciter une réponse immunitaire particulière dite «allergique», liée à la synthèse d IgE spécifiques (Moneret- Vautrin, 1997). Donc, l immunogénicité et l antigénicité d une protéine particulière qui n implique pas une médiation IgE, diffèrent de son allergénicité où la réponse IgE est nécessaire (Fox et Mc Sweeney, 2003) Epitopes La réactivité antigénique d'un anticorps avec une protéine a lieu dans des parties restreintes de la molécule connues sous le nom de déterminants antigéniques ou épitopes (Van Oss, 1994; Walker et Rolls, 1994). Un antigène particulier peut comporter plusieurs épitopes différents ou des épitopes répétés (Male et al., 2007). 13

26 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Les lymphocytes B reconnaissent un antigène soluble lorsqu il se fixe à leur anticorps membranaire, et les épitopes qu ils reconnaissent sont le plus souvent des sites très accessibles. En général, les régions externes à la surface d une protéine ont plus de chance d être reconnue comme des épitopes, et ces régions sont habituellement composées de façon prédominante par des AA hydrophiles. Les séquences d aminoacides dissimulées à l intérieur d une protéine ne peuvent se comporter en épitopes de cellules B à moins que la protéine n ait été préalablement dénaturée (Kindt et al., 2008). Une des différences majeures entre les cellules B et T concerne le type de l antigène reconnu (Tableau 2.). Tandis que les récepteurs d immunoglobulines des cellules B (BCR) fixent la molécule entière (Parham et Masson, 2003), les récepteurs des cellules T (TCR) ne reconnaissent que des antigènes dégradés en fragments peptidiques de petite taille liés aux molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH) (Van Oss, 1994). Un épitope est un petit peptide comportant le plus souvent 8 à 12 AA ; les acides aminés adjacents sont utiles pour maintenir la configuration de cet épitope, si bien que le déterminant antigénique comprend une vingtaine d acides aminés (Moneret-Vautrin, 1997). Huit à neuf acides aminés constituent un épitope T, base de l'immunogénicité. Les épitopes B ont une taille de 8 à 16 amino-acides (Taylor et Lehrer, 1996). On distingue deux types d épitopes (Figure 5.): Les épitopes séquentiels ou linéaires ou continus, sont formés d une courte séquence d acides aminés localisés en continu sur la chaine peptidique d un antigène. Les épitopes conformationnels, qui sont majoritaires, sont formés par la juxtaposition dans l espace d acides aminés situés à distance les uns des autres dans la chaine peptidique. Dans ce cas, l anticorps ne peut plus se lier si la protéine a été dénaturée (Revillard et al., 2001) Antigénicité de la 3-Lg Ce n est que dans les années 80, que des études plus approfondies portant sur la g-lg ont réellement débuté principalement à cause de ses propriétés allergéniques. 14

27 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 2. Comparaison entre la reconnaissance de l antigène par les Lymphocytes B et T (LB, LT) (Kindt et al., 2008). caractéristiques LB LT Interaction avec l antigène. Liaison à un Ag soluble. Implication du CMH. Nature chimique de l antigène. Implique un complexe binaire (Ac+Ag). Oui. Non requise. Protéines, polysaccharides, lipides. Implique un complexe ternaire (TCR+Ag+CMH). Non. Indispensable à la présentation d antigène. Majoritairement de nature protéique mais certains lipides et glycolipides sont présenté par le CMH. Propriétés des épitopes. Accessibles, hydrophiles, pouvant être séquentiels ou conformationnels. Peptides linéaire interne produit par dégradation de l antigène et liaison au CMH. 15

28 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 5. Représentation schématique de deux anticorps interagissant avec un épitope linéaire et conformationnel. (cubic.bioc.columbia.edu/services/epitome/ ) a. épitope court et continu. Après dénaturation, l épitope séquentiel peut lier un anticorps spécifique. b. Epitope conformationnel situé sur une région spécifique de la structure tridimensionnelle. La dénaturation de cet épitope perturbe l interaction Ag-Ac. 16

29 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Par la suite, plusieurs chercheurs se sont intéressés à son immunoreactivité, à la relation de celle-ci avec les propriétés structurales (Clément et al., 2002). Selon Heinzmann et al., (1999) le clivage des ponts disulfures intra-chaîne et de ce fait une perte de la conformation de la molécule, a peu ou pas d effet sur l immunoreactivité de la protéine. Par conséquent, les épitopes linéaires sont principalement impliqués dans l allergénicité de la protéine (Huang et al., 1990; Selo et al., 1998). Duchateaux et al., (1998) ont montré que les IgG anti g-lg se liaient préférentiellement à la forme native de la protéine, un phénomène qui pourrait être attribué au passage de la g-lg intacte à travers la muqueuse intestinale (Bernasconi et al., 2006). Venien et al., (1997) ont révélé l existence de 38 épitopes présents dans les structures de la g-lg bovine (variant A et B), ovine, caprine, porcine et équine, en utilisant des anticorps monoclonaux. C est à partir d un poids moléculaire de à Da que se trouvent les bons immunogènes (Letonturier, 2007). Cependant, des études sur les laits hypoallergéniques, ont montré que les peptides issus de la g-lg et ayant un poids moléculaire inférieur à 3000 Da demeuraient antigéniques à cause de la persistance de deux épitopes (Puerta et al., 2006). Plusieurs chercheurs ont tenté de déterminer les sites reconnus par les IgG en utilisant le sérum de différents modèles animaux ; les épitopes mis en évidence correspondent aux résidus 26-35, 47-58, et pour les sérums de souris Balb/c et lapins (William et al., 1998). Les régions identifiées par Takahashi et al., (1990), en incluant les AA et , contiennent les épitopes reconnus par les souris utilisées par Williams et al., (1998). Mizumachi et al., (1990) ont quant à eux, identifié six épitopes dont un résidu ( ) jugé important. Des études faites sur le rat Brown norway ont montré que les séquences 1-24, 67-77, 82-92, et étaient IgG réactives (Miller et al., 1999). En utilisant du sérum humain, Jarvinen et ses collaborateurs (2001),ont identifié 6 épitopes antigéniques sur la g-lg (figure 6.) correspondant aux séquences d AA (1-16), (51-64), (67-88), (85-96), ( ), ( ). 17

30 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 6. Représentation schématique des séquences antigéniques de la g-lg. Takahashi et al., (1990) : trait plein noir. Mizumachi et al., (1990) : trait plein vert. Williams et al., (1998) : trait (tiret) rouge. Jarvinen et al., (2001) : AA en bleu. 18

31 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Song et al., (2005) ont localisé sur la g-lg, dénaturée thermiquement, un épitope antigénique correspondant au résidu 66-76, qui serait responsable du maintient de l antigénicité de la molécule dénaturée Antigénicité de l 6-La Il subsiste un désaccord au sujet de l'antigénicité relative des principales protéines du lait de vache (PLV). La contribution des différentes classes d'immunoglobuline vis-à-vis de toutes les PLV dans l allergie au lait de vache n'a pas été suffisamment étudiée (Shek et al., 2005). Une activité antigénique a été démontrée pour l h-lactalbumine de même qu une réactivité croisée avec le lysozyme du blanc d œuf (Moneret-Vautrin et al., 1982).Trois épitopes liant les IgG anti-h-la ont pu être identifiés par Jarvinen et al., (2001); les AA 7-18, 53-62, (Figure 7.). Ces séquences d acides aminés partagent les mêmes sites reconnus par les IgE des patients allergiques, à l exception de la séquence AA Ceci suggère que les épitopes allergéniques de l h-la ne concordent pas totalement avec les épitopes antigéniques, ce qui a été également rapporté par Maynard et al (1997). 19

32 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 7. Représentation schématique des séquences antigéniques de l h-la. Epitopes antigéniques selon Jarvinen et al., 2001 : AA en mauve 20

33 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 3. DIFFERENTS PROCEDES DE REDUCTION DE L ANTIGENICITE DU LAIT DE VACHE Plusieurs traitements ont été suggérés dans le but de réduire l antigénicité des lactoprotéines sériques, incluant des traitements physiques tels que la suppression de la g-lg par ultrafiltration (Olsen et al., 2003), la dénaturation par un traitement thermique (O Connell et Fox, 2001), la fermentation bactérienne (Sütas et al., 1996) et l hydrolyse enzymatique (Ragno et al., 1993) Le Traitement thermique La structure compacte et complexe des protéines globulaires du lactosérum les rend, pour la plupart, beaucoup plus fragiles que les caséines vis-à-vis des températures élevées et des ph extrêmes. Elles se dénaturent à ces ph et aux températures supérieures à 60 C (Fox, 1992). La résistance au traitement thermique des protéines du lait diffère d une protéine à une autre, alors que les caséines sont les plus thermostables, la BSA est la plus thermolabile (Al- Agamy, 2007). Le traitement thermique de la g-lg à ph neutre peut entrainer une dissociation du dimère de la protéine native, un dépliement partiel, une dénaturation ou une agrégation; le degré de ces changements dépend de la concentration de la protéine, du ph, de la température et d autres facteurs. Les principaux mécanismes d agrégations ont lieu grâce à des liaisons hydrophobes ou par l'oxydation de leur groupement -SH en pont S-S et/ou par l'échange de groupements sulfures entre -SH et S-S (Havea et al., 2004). Au-delà de 80 C et pendant seulement 15 secondes, le traitement thermique peut entrainer une perte significative en g-lg suite à une agrégation avec d autres composant du lait (Chen et al., 2005). L h-la possède un grand pouvoir de régénération après le chauffage, ce qui fait d'elle la protéine du lactosérum la plus stable envers les traitements thermiques mais sa résistance peut, toutefois, être affectée par la présence de la g-lg pendant le chauffage (De Wit, 1981). Le traitement thermique est l une des méthodes utilisées pour modifier la réponse antigénique (Ratner et al., 1958; Mc Laughlan et al., 1981 ; Kilshaw et al., 1982 ; Host et Samuelsen, 1988 ; Davis et Williams, 1998 ; Rytkonen et al., 2002 ; Fritsché, 2003 ; Ehn et al., 2004). Plusieurs chercheurs ont étudié l effet du chauffage sur l antigénicité des protéines du lait par des méthodes immunologiques in vitro. Babajimopoulos et Mikolajcik, (1978) ont constaté que le traitement thermique du lait pouvait réduire son antigénicité suite à une perte des épitopes conformationnels (Davis et Williams, 1998) et de ce fait entrainait 21

34 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES moins de réactions allergiques chez certains sujets présentant une allergie au lait de vache. Zeiger, (1990) a estimé que la dénaturation thermique était insuffisante pour abolir l allergie au lait, mais qu une dégradation protéolytique était requise. L allergénicité du lait peut être réduite mais pas totalement éliminée par le chauffage. Cependant, les protéines dénaturées par la chaleur peuvent présenter de nouveaux sites antigéniques, démasqués par le dépliement de la protéine ou générés par des réactions chimiques avec d autres molécules présentes dans le lait (Sharma et al., 2001) L hydrolyse enzymatique L hydrolyse enzymatique des protéines est la meilleure façon de réduire son antigénicité (Heyman, 1999 ; Prieto et al., 2007). En fait, une réduction significative de l antigénicité des protéines du lait a été reportée pour l hydrolyse enzymatique du lactosérum (Nakamura et al., 1993). L hydrolyse acide ou alcaline induit une dégradation sévère des acides aminés avec une diminution de la valeur nutritionnelle. A contrario, la protéolyse enzymatique par des endo- ou exopeptidases permet de préserver les qualités nutritionnelles des acides aminés et peptides produits (Boza et al., 1994) L hydrolyse enzymatique des protéines aboutit à la formation de peptides de différentes masses moléculaires et propriétés immunoréactives. Les produits finaux de l hydrolyse dépendent du type d enzymes ou préparations enzymatiques utilisés, de la durée de l hydrolyse, et des conditions dans lesquelles se déroulent la protéolyse (température, ph, ) (Wrˆblewska et J drychowski, 2005). Mullally et al., (1997) ont reporté que le taux d hydrolyse du lactosérum traité thermiquement était plus important que celui du lactosérum natif. Le taux de protéolyse dépend donc, de la conformation des protéines et le changement de cette conformation induirait une modification du nombre de sites accessibles au clivage (Green et Neurath, 1954; Kella et Kinsella, 1988). Les enzymes utilisées dans ce contexte offrent plusieurs avantages, dont une grande spécificité d action et la capacité de modifier les protéines dans des conditions douces, sans effets indésirables sur les produits. Plusieurs protéases de grade alimentaire sont maintenant disponibles commercialement (Tableau 3.). Elles sont classées en fonction de leur origine (ex: animale, végétale ou microbienne), de leur mode d action catalytique (endo ou exopeptidase) ou des acides aminés impliqués dans leur site catalytique (ex: protéase à sérine ou à aspartate) (Roufik, 2005). 22

35 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Alors que l on considère que la fonction pancréatique exocrine est immature à la naissance (Pasteur-Cerba, 2007), la digestion des protéines chez le nouveau né est essentiellement intestinale. Elle est assurée par des protéases pancréatiques : trypsine et chymotrypsine qui sont détectées au niveau du pancréas fœtal vers 3mois de gestation. Elles sont secrétées à partir de 25 semaines de gestation et leur taux augmente rapidement après la naissance (Saliba et al., 2001). En revanche, l activité de l élastase est faible chez le nouveau-né (Tableau 4). Le ph optimal de la trypsine et de la chymotrypsine se situe entre 7 et 8. La température influence aussi l activité de l enzyme. Les enzymes pancréatiques sont actives à température proche du corps humain, soit entre 37 et 40 C.(Groleau, 2003 ). La trypsine, la chymotrypsine et l élastase sont toutes des protéases à sérine, mais leur spécificité est différente. L hydrolyse d une protéine par ces trois enzymes se fait du côté C terminal du lien peptidique. Cependant, la trypsine est spécifique aux résidus Lys et Arg ((Kim et al., 2007) (Figure 8.). La chymotrypsine préfère les acides aminés aromatiques (Phe, Trp, Tyr), alors que l élastase s attaque aux acides aminés à courte chaîne comme l alanine (Whitaker, 1994). Vu les différences de spécificité entre la trypsine et la chymotrypsine, la composition peptidique des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques de la g-lg diffère considérablement. Le Tableau 5 présente les peptides théoriquement issus de l hydrolyse trypsique de la g-lg. Cette protéine possède 15 résidus Lys et 3 résidus Arg, pour un total de 18 sites de coupures théoriques. Toutefois, un de ces sites de coupure n est pas hydrolysé (Lys ) puisqu il est suivi d une proline qui empêche l accès à l enzyme. Le Tableau 6 47 présente les peptides théoriquement issus de l hydrolyse chymotrypsique de la g-lg. La chymotrypsine catalyse le bris des liens peptidiques du côté carbonyle des résidus Tyr, Phe et Trp. Dans certaines conditions, elle hydrolyse aussi certains liens peptidiques formés des résidus Met et Leu. Au total, 36 sites de coupures théoriques sont possibles, mais l ensemble de ces peptides est rarement observé (Groleau, 2003). 23

36 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 3. Exemple de protéases commerciales utilisées pour l hydrolyse des protéines laitières. van der Ven (2002), Adler-Nissen (1993), Whitaker (1994) et Uhlig (1998). TYPE ET ORIGINE DES PROTÉASES Ser-Protéases NOM SOURCE ph D ACTION SPÉCIFICITÉ B Animale Bactérienne Cys-Protéases Trypsine 7-9 P1: Lys, Arg Chymotrypsine Pancréas 8-9 P1: Phe,Tyr,Trp Élastase porcin & bovin 6-8 P1: Ala Substilisin Carlsberg, Bacillus Spécificité large Alcalase licheniformis P1: surtout les a.a. Substilisin BPN, Bacillus hydrophobes Substilisin Novo amyloliquefaciens 6-10 Végétale Asp-Protéases Papain Bromelain Ficin Papaye Ananas Ficus 5-8 Spécificité large P2: surtout les a.a. hydrophobes Pepsine Porcine, Bovine 1-4 Animale Chymosine Veau 4-6 P1 et P1 : surtout les Mucor pusillus, Chymosine-like a.a. hydrophobes Mucor miehei, 4-6 Endothia parasitica Fongique Préférence pour Glu, Aspergillopeptidase A Aspergillus saitoi 2-5 Asp, Leu Newlase Rhizopus sp. 3-6 Semblable à la pepsine Métal-Protéases Animale Carboxypeptidase A Pancréas 7-8 a.a. en C-terminal, sauf Pro, Arg, Lys Protéase neutre, Bacillus 5-7 P1 : Phe, Leu, Val Bactérienne Neutrase Protéase neutre, Thermolysine amyloliquefaciens Bacillus thermoproteolyticus 7-9 P1 : Ile, Leu, Val, Phe Extraits bruts Végétale Papaine Papaye 5-9 Spécificité large Animale Pancréatine Pancréas 7-9 bovin & porcin Spécificité très large Bactérienne Veron P, Aspergillus oryzae Sumyzyme LP, 4-8 Spécificité très large Biozyme A Mélange d endo- et exo-protéases, Pronase Streptomyces 7-9 actives à ph alcalin griseus Spécificité très large et neutre A- Adapté de van der Ven (2002), Adler-Nissen (1993), Whitaker (1994) et Uhlig (1998). B- P1 et P1 représente la préférence de l enzyme pour les acides aminés (a.a.) en position N- ou C-terminale du lien peptidique hydrolysé. 24

37 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 4. Digestion des protides chez le nouveau-né (Saliba et al., 2001). Enzymes Origine Site d action Activité chez le nouveau-né Trypsine Chymotrypsine Pancréas Intestin Elevée Enteropeptidases Intestin Intestin Elevée Pepsine Estomac Estomac Très basse Elastase Pancréas Intestin Très basse Tableau 5. Peptides issus de l hydrolyse trypsique de la g-lg (Groleau, 2003). Peptides Masse (Da) Peptides Masse (Da)

38 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Figure 8. Représentation schématique de l action des enzymes pancréatiques (Van Dyke, 1989). 26

39 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 6. Peptides issus de l hydrolyse chymotrypsique de la g-lg (Groleau, 2003). Peptides Masse (Da) Peptides Masse (Da)

40 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Dans une étude visant à comparer les profils peptidiques d un hydrolysat trypsique et chymotrypsique de g-lg, Pouliot et al., (2000) ont recensé à peine 19 de ces 36 peptides chymotrypsiques L hydrolyse bactérienne Au cours des procédés de fermentation, les protéines laitières sont hydrolysées par les enzymes des bactéries lactiques. Le système protéolytique des bactéries lactiques se compose de protéases membranaires, qui hydrolysent les protéines du milieu environnant et libèrent des peptides, et de peptidases intra-cytoplasmiques qui dégradent les peptides. Les peptidases peuvent être des endopeptidases (site de coupure intra-chaîne) ou des exopeptidases (site de coupure en extrémité de chaîne). L activité protéolytique des lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son importance dans la fabrication fromagère et le développement d arômes (Bintsis et al., 2003). Le contenu intracellulaire en peptidases est spécifique de chaque souche bactérienne (Kunji et al., 1996). Cependant, plusieurs souches de L. paracasei ssp. paracasei montrent le même profil d activité protéolytique (Bintsis et al., 2003). L activité protéolytique des bifidobactéries a été peu étudiée. Toutefois, elle semble assez faible et inférieure à celle observée avec les lactobacilles (Shihata et Sha, 2000). De nombreuses études mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers fermentés, mais peu d auteurs précisent si cet effet est relié à l hydrolyse des épitopes allergéniques des protéines laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les bactéries lactiques à l origine de la fermentation (Cross et al., 2001). Cependant, une diminution de 99% de l antigénicité de l h-la et de la g-l a pu être observée suite à la fermentation d un lait stérilisé par une association de bactéries lactiques mésophiles et thermophiles (Besler et al., 2001). La diminution de l allergénicité par l hydrolyse bactérienne a également été réalisée de façon indirecte, en mesurant la production d IL-4 in vitro en présence d hydrolysat. Ainsi, Sütas et al., (1996) ont rapporté une suppression de la synthèse d IL-4 par les cellules mononuclées du sang, en présence de caséine hydrolysée par les enzymes intracytoplasmiques de Lactobacillus rhamnosus GG. La diminution de l allergénicité des protéines par l hydrolyse enzymatique constitue une stratégie intéressante pour la prévention des allergies aux protéines du lait de vache. 28

41 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 3.4. La Haute Pression (HP) Durant la dernière décennie, des technologies émergentes tel que le traitement HP appliqué aux aliments, a généré un intérêt grandissant. Ce traitement non thermique peut entrer en compétition avec le traitement thermique conventionnel, pour la réduction de la population microbienne en maintenant les qualités organoleptiques (Prestamo et Arroyo, 2000 ; Prestamo et al., 2000) et en préservant les nutriments thermolabiles tels que les vitamines (Kimura et al., 1994). La haute pression s est avérée un outil non négligeable pour la production d hydrolysats hypoallergéniques comme cela a été démontré par différentes recherches (Dufour et al., 1992 ; Dufour et al., 1995 ; Van Wilige et Fitzgerald, 1995 ; Maynard et al., 1998 ; Bonomi et al., 2003 ; Penas et al., 2005). Plusieurs auteurs ont reporté que la dénaturation des protéines sous haute pression (Botelho et al., 2000 ; Huppertz et al., 2002 ; Hinrichs et Rademacher, 2004 ; Huppertz et al., 2004) facilitait l'accès des protéases aux sites de clivages des protéines (Hayashi et al., 1987 ; Stapelfeldt et al., 1996 ; Maynard et al., 1998 ; Bonomi et al., 1999 ; 2003 ; Penas et al., 2004). Ceci a été confirmé par Penas et al., (2006b) qui ont démontré qu une hydrolyse avec des enzymes sélectionnées sous l influence du traitement HP réduisait très significativement l immunoreactivité des hydrolysats de lactosérum Les micro-ondes Les micro-ondes sont des ondes d énergie électromagnétiques regroupant les longueurs d ondes comprises entre 0,01 et 1,0 m, ce qui correspond à des fréquences qui varient entre et 300MHz (Amiot et al., 2002). Le principe d un traitement micro-ondes repose sur l émission d ondes électromagnétiques dont l énergie est absorbée par les molécules d eau bipolaires et les ions (Ohlsson et Bengtsson, 2001). L élévation de température constatée, est la conséquence de l augmentation de l agitation moléculaire des dipôles et des ions qui s orientent ou se déplacent alternativement à la fréquence imposée par le champ électromagnétique (Margolis et al., 1991). La combinaison de l effet thermique et d une augmentation des forces rotationnelles produite par les micro-ondes sur les liens peptidiques peut catalyser efficacement l hydrolyse de ces derniers tout en préservant l intégrité et la stabilité des acides aminés (Margolis et al., 29

42 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1991). Karmée (2006) a suggéré que la stabilité de l enzyme est meilleure sous micro-ondes que lors d un chauffage conventionnel. Il faut noter que les micro-ondes ont été appliqués dans divers protocoles en rapport avec les sciences biologiques : coloration et décoloration de gels et membranes PVDF ( Nestavy et al., 2002), immunohistochimie et fixation de tissus (Patterson et Bulard, 1980 ; Login et dvorak, 1994 ; Hafajee et Leong, 2004 ; Emerson et al., 2006 ; Temel et al., 2006), caractérisation des lipases (Bradoo et al., 2002 ; Roy et Gupta, 2003). Ces rayonnements ont également été utilisés dans la conservation des aliments en supprimant les organismes parasites comme les charançons dans les farines (Vincent et al., 2000) ou encore les œufs d insectes dans les dattes(reynes et Tabuna, 1996). Dans le domaine de la décontamination bactérienne, des études (Atmaca et al., 1996 ; Salvatorelli et al., 1996) ont montré que les micro-ondes, appliquées dans les mêmes conditions de température qu un chauffage traditionnel, ont un effet bactéricide plus important que ce dernier. Certains auteurs (Dreyffus et Chipley, 1980 ; Khalil et Villota, 1988 ; Kozempel et coll., 1998 ; Tajchakavit et coll., 1998) pensent qu il existe un effet bactéricide non thermique des micro-ondes. Récemment, en dehors de leurs utilisations dans les réactions biologiques, les rayonnements micro-ondes sont utilisés pour assister les réactions d hydrolyse utilisant des enzymes telles que les lipases ou protéases (Carillo-Munoz et al., 1996 ; Nini et al., 2001). Zhu et al., (2005 ; 2006 ; 2006a) ont pu démontrer dans leurs travaux l augmentation de la vitesse d hydrolyse sous l effet des micro-ondes, ainsi qu un meilleur accès des enzymes aux composants ligno-cellulosique de la paille de riz ou de blé. Différentes études sur l effet des micro-ondes dans la réduction de l immunoreactivité des protéines du lait de vache ont été entreprises. Kaddouri et al., (2006) ont démontré une diminution de la réactivité vis-à-vis des IgG anti g-lg et des IgG anti h-la du lactosérum issu d un lait traité par les micro-ondes à différentes puissances, et ont relié cela à une dénaturation et une perte de solubilité des protéines du lactosérum. Izquierdo et al., (2007 ; 2008) ont combiné les rayonnements micro-ondes à une hydrolyse enzymatique des lactosérums. Les résultats qu ils ont obtenu ont montré une augmentation du degré d hydrolyse sous micro-onde accompagnée d une baisse de l antigénicité résiduelle des hydrolysats. Bien que les mécanismes réels des micro-ondes impliqués dans la catalyse des réactions enzymatiques ou organiques demeurent incomprises, l utilisation des micro-ondes en protéomique (Lill et al., 2007) deviendra une technique de routine, et présentera un certain 30

43 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES avantage quant à son utilisation à l échelle industrielle grâce au gain de temps et d énergie (Saxena et al., 2005) Le génie génétique La suppression de certaines parties immunoréactives d une molécule par des procédés biotechnologiques pourrait être une approche intéressante pour contrôler le risque d allergie chez l être humain (Moneret-Vautrin, 1997). Wal (1998) estime que les " aliments nouveaux " apparaissent comme des allergènes potentiels ; de nouvelles techniques de production, ou de transformation, notamment la production de protéines recombinantes par transfert de gènes, peuvent faire apparaître ou rendre biodisponibles des structures immunoréactives ou entraîner des surexpositions à des substances déjà réactives. En 1997, Chatel et al., ont montré que la g-lactoglobuline recombinante, exprimée dans E. coli, à des fins de recherche, possède les mêmes caractéristiques immunologiques que la g-lactoglobuline bovine, allergène majeur du lait de vache, reconnu par plus de 60% des patients allergiques et naturellement présente dans le lactosérum. Plus récemment, Adel- Patient et son équipe (2002) ont mis au point une nouvelle voie d immunisation dite «immunisation génique» pour le traitement de l allergie à la g-lg. Les résultats obtenus ont montré une inhibition d une réponse de type Th2 «allergique».ceci semblerait donc présenter un fort potentiel pour la prévention et le traitement des allergies. Cependant, d autres recherches doivent être menées, notamment sur d éventuels effets secondaires. 31

44 MATERIELS ET METHODES MATÉRIELS ET MÉTHODES 32

45 MATERIELS ET METHODES 1. IMMUNISATION DU MODÈLE ANIMAL 1.1. Animaux Les animaux utilisés lors de notre expérimentation sont des lapins de race Néo- Zélandaise provenant de l Institut d élevage de Lemtar (Sidi Bel Abbes).Il s agit de jeunes lapins des deux sexes pesant en moyenne1,700 Kg, maintenus dans des cages adaptées à la nature de l animal, nourris avec des granulés (STCO, Sig) et abreuvés à L eau de robinet ad libitum. Notre choix s est porté sur cette espèce car elle peut produire des volumes suffisants d antisérums, ce qui la rend idéale pour la production d anticorps polyclonaux à forte affinité (Stills, 1994) Antigènes Pour l obtention d anticorps anti-g-lg et anti h-la, nous avons utilisé des protéines de lait bovin, la g-lactoglobuline (A, B) et l h-lactalbumine (Type ) toutes deux pures et provenant de chez SIGMA (USA) Adjuvants La réponse antigénique est améliorée par l'utilisation d'adjuvants. Dans notre protocole nous avons utilisé l'adjuvant Complet de Freund (ACF) lors de la primo injection et de l adjuvant incomplet (AIF) pour les rappels (SIGMA, USA). Ceux-ci forment, au site de l'injection, un dépôt d'immunogène qui est libéré lentement sur une certaine durée de temps, ce qui a pour effet d'entretenir la stimulation du système immunitaire (Tableau 7) Protocole d immunisation Nous utilisons 18 lapins qui sont répartis en 3 groupes de six individus chacun; le 1 er et le 2 e groupe sont respectivement immunisés à la g-lg et à l h-la, principales protéines du lactosérum. Le 3 e groupe constitue le groupe témoin et par conséquent ne reçoit aucune immunisation. Les solutions immunogènes sont constituées de 2 mg de g-lg ou d h-la pures dissoutes dans 0,5 ml de sérum physiologique (NaCl 9 ) émulsionné avec 0,5 ml d Adjuvant Complet de Freund. 33

46 MATERIELS ET METHODES Suivant la technique utilisée par Walker et al., (1973), le protocole dure 40 jours. Chaque lapin reçoit 1 ml d antigène en solution, injecté en sous-cutané en dix points le long de la colonne vertébrale, soit 100 µl par site d injection. Des rappels sont réalisés Tableau 7. Adjuvants et mécanismes d action (Janeway and Travers, 1999) Nom de l'adjuvant Composition Mécanisme d'action Libération retardée de Adjuvant Complet de Huile en émulsion dans l'eau avec des l'antigène Freund mycobactéries tuées capture facilitée par les macrophages induction de la costimulation. Adjuvant Incomplet de Freund Huile en émulsion dans l'eau Libération retardée de l'antigène capture facilitée par les macrophages. 34

47 MATERIELS ET METHODES au 7 e, 20 e et 30 e jour du protocole selon la même méthode, mais avec une solution antigénique contenant l Adjuvant Incomplet de Freund Prélèvements sanguins Avant toute immunisation, des prélèvements sanguins de 2 ml ont été effectués par la veine marginale de l oreille de chaque lapin (sérum non immun). Au 40 e jour du protocole, les lapins sont sacrifiés après que le sang ait été prélevé à partir de l artère carotide par cathétérisme. Le sang recueilli est laissé coaguler pendant ½ heure à température ambiante puis, il est centrifugé à 3500 tr/min pendant 15 minutes à +4 C; le sérum est ensuite délicatement prélevé, aliquoté puis congelé à -20 C. 2. MÉTHODES D ANALYSES Dans notre étude, nous utilisons différentes techniques immunologiques pour évaluer d une part le degré d immunisation des lapins vis-à-vis de la g-lg et de l h-la et d autre part, pour mesurer l antigénicité résiduelle des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques soumis aux rayonnements micro-ondes Dosage des anticorps IgG sériques par ELISA Pour évaluer le degré d immunisation des lapins contre les antigènes du lait, nous dosons les anticorps sériques IgG anti g-lg et anti h-la, selon un procédé non compétitif par la technique immunoenzymatique ELISA (Adel-Patient et al., 2000) et dont le principe est le suivant : Principe général de la méthode ELISA Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à doser réagissent dans un premier temps avec l antigène immobilisé par adsorption sur une phase solide. Dans un deuxième temps, la quantité d anticorps fixés par l antigène est mesurée à l aide d un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline). Dans le cadre de notre travail, nous utilisons des plaques de micro-titration en polystyrène (NUNC Maxisorb, 96 puits à fond plat), qui permettent d adsorber la plupart des antigènes. Après dépôt de l immunsérum contenant les anticorps spécifiques, la phase solide 35

48 MATERIELS ET METHODES est lavée et on révèle la présence de ces anticorps par l addition d un conjugué qui correspond à des anti anticorps couplés ou non à une enzyme (peroxydase). La dernière étape correspond au dosage de l enzyme marqueur. Cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de molécules d enzymes que l on pourra détecter, dépendra le seuil de sensibilité. Dans notre travail, le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ). Au cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, on ajoute à la solution un chromogène, l orthophènylène diamine (OPD) Mode opératoire Le dosage ELISA des IgG spécifiques anti-g-lg et anti h-la est réalisé selon les étapes suivantes : Dans un premier temps, tous les puits de la microplaque reçoivent 100µl d antigène (g-lg ou h-la) à la concentration de 10µg/ml dissous dans du PBS 1M ph 7,4 dilué au 1/10. Les plaques sont alors incubées pendant au moins une nuit à 4 C. L excès d antigène non fixé est éliminé par 3 lavages successifs de la plaque avec du PBS-Tween 20 (0,05%) à l aide d un laveur automatique (Elx50). Les sites spécifiques sont saturés par le dépôt, dans tous les puits, de 200µl de SAB à 3% dans du PBS 0,01M ph 7,4 lorsque l antigène sensibilisant est la g-lg ou l h-la. La SAB est remplacée par de la gélatine de poisson à 2% dans du PBS ph 7,4 lorsque l antigène sensibilisant est le lactosérum ou la sérum albumine bovine. La plaque est ensuite incubée pendant 1h à 37 C puis rincée 3 fois de suite sous agitation par le tampon de lavage PBS-Tween 20 (0,05%). L opération suivante consiste à diluer les échantillons de sérum à tester au 1/10 ème dans un tampon de dilution (PBS 0,01M/ SAB1% Tween 20 0,1% ph 7). Pour cela, une série de dilution est alors effectuée allant de 10-1 à Puis, un volume de 100µl est déposé dans des puits appropriés. La plaque est alors incubée à 37 C pendant 2 heures, puis lavée 3 fois de suite sous agitation, au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%. Ensuite chaque puits de la plaque reçoit 100 l d anti IgG de lapin couplé à la peroxydase (Sigma), dilué au 1/3000 ème dans du tampon de dilution. La plaque est ensuite incubée pendant 1h 30 minutes à 37 C, suivie d un lavage 3 fois de suite au tampon de lavage PBS-Tween 20 (0,05%). 36

49 MATERIELS ET METHODES 200µl d'une solution contenant un chromogène [l orthophénylène diamine (OPD) : 60 mg dilués dans 20ml de tampon citrate de sodium 0,05M à ph 5,1 ainsi que 30µl de H 2 O 2 ] sont déposés dans chaque puits de la plaque. Une réaction colorée se développe en 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. L'ajout de H 2 SO 4 2N permet de stopper la réaction. L'intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l'aide d'un lecteur (ELx 800). Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans chaque plaque à fin de contrôler la spécificité et la sensibilité de chaque mesure. Les titres en IgG des sérums testés sont exprimés par l inverse de la plus haute dilution de sérum supérieure au bruit de fond Evaluation de la réactivité des lactosérums et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Echantillons d hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques Notre étude porte sur des hydrolysats préparés au Laboratoire de la Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire par Salah (2008). Deux lots de lactosérums bovins ont été respectivement soumis à une hydrolyse trypsiques ou chymotrypsiques (E/S 1%) combinée aux rayonnements micro-ondes à 40 C pendant 5 et 15 mn. Pour déterminer si le traitement combiné a été efficace, deux autres lots ont subit une hydrolyse classique au bain marie à 40 C pendant les mêmes durées Mesure de la réactivité vis-à-vis des IgG anti P-La et des IgG anti O-Lg Dans la 2 ème partie de notre travail, nous nous sommes intéressés à la mesure de l antigénicité résiduelle des lactosérums hydrolysés par la trypsine ou la chymotrypsine sous l influence des micro-ondes. Ces deux enzymes sont les plus communément utilisées pour la fabrication de formules infantiles à base d hydrolysats (Fritsché, 2003). Le principe de la méthode de mesure est le même que celui décrit précédemment. Cependant, il existe une différence qui concerne la nature des échantillons utilisés et le choix de la dilution. En effet, étant donné que le but de notre travail porte sur l action des microondes sur l hydrolyse enzymatique, nous avons mesuré la réactivité des deux protéines cibles ainsi que celle des différents hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques (figure 9) avec une dilution du sérum à Le reste du protocole demeure semblable à celui utilisé pour le dosage des IgG. 37

50 MATERIELS ET METHODES PBS g-lg/ h-la LSN LSNmo+ Tmo5 Tc5 Tmo15 Tc 15 Chmo5 Chc5 Chmo15 Chc15 Blc Tém plat. Figure 9. Représentation schématique de la plaque ELISA «Nunc,Maxisorb» 96 puits à fond LSN: lactosérum natif. LSN/mo: lactosérum natif soumis au MO. Tmo: Trypsine/micro-ondes 5 et 15 mn. Tc: Trypsine classique (bain-marie) 5 et 15 mn. Chmo: Chymotrypsine/micro-ondes 5 et 15 mn. Chc: Chymotrypsine classique (bain-marie) 5 et 15mn. Blc: blanc (tampon de dilution). Tém: sérum de lapins témoins. g / h: sérum de lapins femelles/mâles. 38

51 MATERIELS ET METHODES Méthodes statistiques Au vu des effectifs réduits utilisés dans notre expérimentation, nous avons posé l hypothèse que les variables biochimiques, biologiques et physiologiques (concentrations protéiques, titres sériques en immunoglobulines) mesurées se distribuent selon la loi normale dans la population générale. Dans ces conditions, les moyennes sont comparées à l aide d un test T de Student pour les données appariées et non appariées. Le seuil de signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit 5% Evaluation de l immunoréactivité des hydrolysats trypsiques ou chymotrypsiques par la technique du Western blot L identification d une protéine spécifique dans un mélange complexe de protéines peut être réalisée par une technique connue sous le nom de Western blot; ce nom vient de la similitude de cette méthode avec le Southern blot qui détecte des fragments d ADN et avec le Northern blot qui détecte les ARNm Principe de la méthode Cette méthode s effectue en deux temps; séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE puis transfert sur une membrane inerte «Blot» (nitrocellulose ou PolyVinylidene DiFluoride «PVDF») via un champ électrique. Chaque bande de protéine est identifiée en immergeant la membrane dans une solution d un anticorps polyclonal ou monoclonal spécifique à la protéine à laquelle on s intéresse, et marqué soit par un élément radioactif soit par une enzyme. Les complexes antigène-anticorps qui se forment sur la bande et qui contiennent la protéine reconnue par l Ac, peut être visualisée de plusieurs façons. Les procédés de détection les plus habituellement utilisés emploient des anticorps liés à une enzyme et dirigés contre le complexe antigène(protéine)-anticorps. Après fixation du conjugué enzyme-ac, l addition d un substrat chromogène qui donne un produit fortement colorés et insoluble provoque l apparition d une bande colorées au niveau de l emplacement de l antigène cible Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS Pour séparer les protéines des différents échantillons, nous employons une technique adaptée de la méthode décrite par Laemmli (1970) qui utilise deux gels de composition différente : un gel de concentration à 5% et un gel de séparation à 15% en acrylbisacrylamide (tableau 8). 39

52 MATERIELS ET METHODES Tableau 8. Composition des gels de polyacrylamide- SDS 5% et 15% Solution Gel de concentration 5% Gel de séparation 15% Tris 1M ph 8,8 Tris 1M ph 6,8 Acryl/Bis Acryl 30% - 0,8% Eau distillée -- 0,625 ml 0,830 ml 3,25 ml 3,75 ml -- 7,5 ml 3,5 ml DEGAZAGE SOUS VIDE SDS 10% Persulfate d ammonium 10% Temed 0,050 ml 0,050 ml 0,025 ml 0,150 ml 0,075 ml 0,005 ml 40

53 MATERIELS ET METHODES Principe L électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (en présence du Sodium Dodécyl Sulfate «SDS») est utilisée pour séparer et identifier les protéines en fonction de leurs poids moléculaire. Les protéines subissent un traitement préalable par le SDS (détergent anionique) qui confère une charge négative à la protéine et le g-mercaptoéthanol agent réducteur des liaisons disulfures, contenus dans le tampon d échantillon (tableau 9) Mode opératoire Les gels sont mis dans du tampon de migration (tableau 9) sous une tension de 70 volts pendant 2 heures 30 minutes. Les protéines solubilisées dans le tampon d échantillon sont concentrées dans le gel de concentration (tableau 8) et comme les complexes protéines-sds ont la même charge par unité de longueur (une molécule de SDS pour 2 acides aminés), ils traversent le gel de séparation (tableau 8) sous le champ électrique avec la même mobilité. Cependant, comme ils passent au travers d'un gel de séparation, avec des pores relativement petits, les différents complexes protéines-sds se séparent grâce aux propriétés du tamis moléculaire du gel. Les petites protéines migrent rapidement car elles passent facilement dans les pores du gel, mais les grosses protéines sont retardées. Le bleu de bromophénol, contenu dans le tampon de l'échantillon, n'est absolument pas retardé et indique donc le front de migration électrophorétique. Quand le colorant atteint le bas du gel, l électrophorèse est arrêtée. Après migration des protéines, le gel est démoulé et immédiatement utilisé pour l immunoblot. Pour apprécier la migration des protéines, nous procédons à la révélation des bandes du 2 e gel par une coloration avec du Bleu de Coomassie (qui se fixe sur les protéines au niveau des liaisons peptidiques) et la décoloration avec la solution de décoloration (tableau 10) Transfert sur membrane : Mode opératoire Une fois l'électrophorèse finie, les protéines sont séparées mais restent "emprisonnées" dans le gel de polyacrylamide. Pour révéler la protéine cible (g-lg ou h-la) par les anticorps, il faut détacher les protéines du gel. Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un support immobilisant (membrane de PVDF) (NEN Research, USA). 41

54 MATERIELS ET METHODES Tableau 9. Composition des tampons d échantillon et de migration (SDS-PAGE). Tampon d échantillon Tampon de migration Tris HCl (1M) ph 6,8 6,25ml Glycine 14,4 g g-mercaptoéthanol 5ml Tris 3,3 g Glycerol 10ml SDS 1 g SDS 2,3 g H2O qsp 1000 ml Bleu de bromophenol 0,4% 1ml H2O qsp 100 ml Tableau 10. Composition des solutions de coloration et de décoloration Solution de coloration Solution de décoloration Bleu de coomassie R250 0,2 g Ethanol 96% 90 ml Ethanol 96% 90 ml Acide acétique glacial 10 ml Acide acétique glacial 20 ml Glycérol 10 ml H 2 O distillée 90 ml H 2 O distillée 90 ml 42

55 MATERIELS ET METHODES Les électrodes prennent en sandwich le gel et la membrane de PVDF (Figure 10) préalablement imprégnée de méthanol pendant 1 min, entourés de filtres (papier Whatman) et de scotch-brite imbibés de tampon de transfert (Tableau 11.) afin d'éviter les espaces morts entre le gel et la membrane. Si le gel et la membrane de PVDF n adhèrent pas fortement l'un à l'autre, la migration des protéines dans le gel peut être perturbée. Sous l'influence d'un champ électrique (50 volts pendant 1 heure), les protéines vont migrer de la cathode vers l'anode. A la petite différence qu'ici, les électrodes sont de part et d'autre du gel et non pas dans le plan du gel. Une fois le transfert terminé, la membrane PVDF est saturée avec une solution de PBS Tween20 SAB 3% sous agitation douce pendant 1h à température ambiante ou à 4 c pendant toute une nuit. Après 1h, le PVDF est rincé avec du PBS Tween 20 (0,1%) 3 fois de suite sous agitation pendant 5min. L anticorps primaire (sérum immun) est dilué à raison de 1/20 dans du PBS Tween20- SAB puis ajouté à la membrane et incubé pendant 1h30. Les anticorps qui ne sont pas fixés spécifiquement sont éliminés par 3 rinçages successifs avec du PBS-Tween20 (0,1%) sous agitation pendant 5 min. L'anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Sigma, USA) est dilué à raison de 1/3000. L anti IgG-HRP est ajouté au PVDF puis incubé pendant une heure à température ambiante. Les anticorps qui ne se sont pas fixés sont éliminés par 2 lavages consécutifs de 5 minutes avec du PBS/Tween-20 (0.1 %) et un rinçage final de 15 minutes sous agitation. La révélation est effectuée en recouvrant la membrane avec le substrat chemiluminescent (Tableau 12) pendant 15 minutes à l obscurité. Une fois les bandes révélées, un rinçage à l'eau distillée est effectué plusieurs fois, et en raison de l absence du matériel adéquat pour la lecture de la chemiluminescence, les résultats obtenus sont scannés. 43

56 MATERIELS ET METHODES Figure 10. Représentation schématique du dispositif d immunoblot (électrotransfert). 44

57 MATERIELS ET METHODES Tableau 11. Composition du tampon de transfert (Western blot) Tampon de transfert ph 8,2 Tris ( 25 mm) Glycine ( 192 mm) Méthanol 20% Eau Ultra-Pure qsp 3,025 g 14,4 g 100 ml 1000 ml Tableau 12. Composition de la solution de révélation Solution de révélation OPD Tampon citrate H 2 O 2 30 mg 10 ml 15 l 45

58 MATERIELS ET METHODES RESULTATS 46

59 RESULTATS 1. EVALUATION DU DEGRÉ D IMMUNISATION DES LAPINS L évaluation du degré d immunisation est réalisée par la méthode ELISA qui permet le titrage des IgG spécifiques anti g-lg et anti h-la à partir des sérums de lapins immunisés à ces deux antigènes. Comme le montre la figure 11, le niveau de production d IgG spécifiques anti g-lg et anti h-la est indétectable à J0. Après 40 jours d immunisation, les lapins développent des taux très élevés d IgG spécifiques. Les titres sériques atteignent 1/ ème et 1/ ème respectivement pour les IgG anti g-lg et les IgG anti h-la (p<0,001). 2. ANTIGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS TRYPSIQUES ET CHYMOTRYPSIQUES TRAITÉS AU MICRO-ONDES Dans cette partie expérimentale, notre objectif était d observer l influence des rayonnements micro-ondes combinée à l hydrolyse enzymatique par la trypsine ou par la chymotrypsine sur l antigénicité de la g-lg et de l h-la par une méthode Elisa indirecte Réactivité du lactosérum natif Nos résultats montrent une bonne réactivité des lactosérums natifs vis-à-vis des IgG anti g-lg et anti h-la qui présentent respectivement des titres de (1/ ème ) et (1/ ème ) Réactivité des lactosérums traités par les micro-ondes Concernant la réactivité du lactosérum vis-à-vis des IgG anti-g-lg, nos résultats montrent que ses protéines ont conservé un potentiel antigénique comparable à celui du lactosérum natif malgré le traitement micro-ondes auquel il a été soumis (Figure 12). À contrario, le traitement par les micro-ondes a provoqué une légère augmentation de la réactivité du lactosérum vis-à-vis des IgG anti h-la (Figure13.) par rapport au lactosérum natif (p<0,05). 47

60 RESULTATS log1/titre Tém 3-Lg Tém' 6-La 0 1 J0 J40 J0 J40 Figure 11. Titres en IgG sériques anti g- Lg et anti h-la mesurés par la technique ELISA chez des lapins immunisés à la g-lg (n=6) et à l h-la (n=6). Les valeurs reportées sont des moyennes et leurs erreurs standards. J0 : Titres en IgG avant immunisation. J40 : Titres en IgG après sacrifice des lapins (après 40 jours d immunisation). On note qu à J0, les titres en IgG anti g-lg et anti h-la sont indétectables. Après 40 jours d immunisation, ces taux d IgG spécifiques ont très nettement augmentés. Tém :Témoin de la g-lg. Tém :Témoin de l h-la. P-La : Alpha-Lactalbumine. 48

61 RESULTATS DO 1,5 1 3-Lg 0,5 LSN LSNmo 0 1 Figure 12. Réactivité vis-à-vis des IgG anti-g-lg du lactosérum traité aux micro-ondes comparé au lactosérum natif (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. On note que le traitement du lactosérum par les micro-ondes n a aucune influence sur sa réactivité vis-à-vis de la g-lg. LSN : Lactosérum natif. LSNmo : Lactosérum natif soumis aux micro-ondes. O-Lg : Beta-Lactoglobuline. 49

62 RESULTATS D.O 2 ** 1,5 6-La 1 LSN LSNmo 0,5 * * 0 1 Figure 13. Réactivité vis-à-vis des IgG anti-h-la du lactosérum traité aux MO par rapport au lactosérum natif (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. Il existe une différence très significative entre la réactivité de l h-la et celle des lactosérums, natif et traité aux micro-ondes (p<0,01). Le traitement du lactosérum par les micro-ondes entraine une augmentation significative (p<0,05) de sa réactivité vis-à-vis des IgG spécifiques anti-h-la. LSN : Lactosérum natif. LSNmo : Lactosérum natif soumis aux micro-ondes. P La : Alpha-Lactalbumine 50

63 RESULTATS 2.3. Mesure de la réactivité des hydrolysats trypsiques soumis aux rayonnements micro-ondes Réactivité vis-à-vis de la O-Lg L hydrolyse classique des lactosérums au bain Marie entraine une diminution de l antigénicité de la g-lg. Néanmoins, l application des rayonnements micro-ondes pendant 5 mn combinés à une hydrolyse trypsique a permis une réduction plus prononcée de l antigénicité (Figure 14), et cela est d autant plus significatif si la durée du traitement augmente (15 mn), (p<0,05) Réactivité vis-à-vis de l P-La : L hydrolyse trypsique combinée aux micro-ondes est restée sans effet significatif sur l antigénicité de l h-la par rapport aux lactosérums (Figure 15). Si l on compare la réactivité des échantillons soumis aux micro-ondes avec ceux qui ont subit un traitement conventionnel, nous remarquons une meilleure hydrolyse sous les conditions classiques par rapport aux hydrolysats trypsiques soumis aux micro-ondes pendant 5 min (p<0,05) et 15 min (p<0,01) Réactivité des hydrolysats chymotrypsiques soumis aux micro-ondes Antigénicité de la O-Lg Dans la figure 16, les résultats montrent une baisse de la réactivité de la g-lg et comme pour la trypsine, on peut observer une diminution qui s accentue en prolongeant la durée de traitement de 5 mn (p<0,05) à 15 mn (p<0,01) Réactivité vis-à-vis des IgG anti P-La Le traitement micro-ondes combiné à une hydrolyse du lactosérum par la chymotrypsine n a eu aucune influence sur l antigénicité de l alpha lactalbumine en comparaison avec une hydrolyse conventionnelle (Figure 17). En effet, le bain-marie a permis une meilleure hydrolyse de l h-la (p<0,05) à 15 mn. 3. ETUDE DE L ANTIGÉNICITÉ RÉSIDUELLE DES HYDROLYSATS TRYPSIQUES ET CHYMOTRYPSIQUES SOUS L INFLUENCE DES MO PAR LE WESTERN BLOT Afin de valider les résultats obtenus par l ELISA, nous avons fait appel à une autre méthode immunologique ; le Western-blot ou immunoblotting considéré comme une technique de confirmation (Robert-Gangneux et Tourte-Schaefer, 1999). 51

64 RESULTATS DO 1,5 1 * LSN LSNmo Tmo Tc 0,5 * Temps (min) Figure 14. Réactivité vis-à-vis des IgG anti g-lg des hydrolysats trypsiques traités aux MO pendant 5 ou 15 minutes (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. Le traitement micro-ondes/trypsine pendant 5 mn diminue significativement la réactivité du lactosérum (p<0,05) par rapport à celui soumis à une hydrolyse au bain marie. A 15 mn, il n y a aucune différence significative entre les deux types d hydrolysats. LSN : lactosérum natif. LSNmo : lactosérum traité par les micro-ondes. Tmo : traitement combiné trypsine/micro-ondes. Tc : hydrolyse trypsique au bain marie. 52

65 RESULTATS D.O 2 1,5 LSN 1 LSNmo T mo 0,5 * * ** ** Tc Temps (min) Figure 15. Réactivité vis-à-vis des IgG anti h-la des hydrolysats trypsiques traités par les micro-ondes pendant 5 ou 15 minutes (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. Le traitement aux micro-ondes du lactosérum combiné à une hydrolyse par la trypsine entraine une augmentation non significative par rapport au lactosérum natif. En revanche, on constate une meilleure efficacité des hydrolysats au bain marie (p<0,05) à 5 min et (p<0,01) à 15 min, par rapport aux lactosérums soumis à une hydrolyse non conventionnelle (micro ondes). LSN : lactosérum natif. LSNmo : lactosérum soumis aux micro-ondes. Tmo : traitement trypsine/micro-ondes. Tc : traitement trypsine/bain marie. 53

66 RESULTATS DO 1,5 1 * ** LSN LSNmo CH mo CH c 0,5 * ** Temps (min) Figure 16. Réactivité vis-à-vis des IgG anti g-lg des hydrolysats chymotrypsiques sous micro-ondes pendant 5 et 15 minutes (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. L hydrolyse du lactosérum par la chymotrypsine combiné aux micro-ondes entraine une nette réduction de sa réactivité (p<0,05) par rapport à une hydrolyse classique, et elle est d autant plus significative après 15 mn de traitement (p<0,01). LSN : lactosérum natif. LSNmo : lactosérum soumis aux micro-ondes. CH mo : hydrolysats chymotrypsiques sous micro-ondes. CH c : hydrolysats chymotrypsiques au bain marie. 54

67 RESULTATS D.O 2 1,5 1 LSN LSNmo CH mo CHc 0,5 ** ** Temps (min) Figure 17. Réactivité vis-à-vis des IgG anti h-la des hydrolysats chymotrypsiques traités par les micro-ondes pendant5 et 15 min. (n=6). Les valeurs indiquées sont des moyennes et leurs erreurs standards. L application des micro-ondes lors de l hydrolyse du lactosérum par la chymotrypsine entraine une stabilité de sa réactivité par rapport au lactosérum natif. On remarque également qu après 15 min de traitement la diminution de la réactivité concerne plutôt l hydrolysat classique (p<0,01). LSN : lactosérum natif. LSNmo : lactosérum soumis aux micro-ondes. CH mo : hydrolysats chymotrypsiques sous MO. CHc : hydrolysats chymotrypsiques classiques. 55

68 RESULTATS Après séparation des protéines de nos échantillons par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), celles-ci sont transférées sur une membrane PVDF par un courant électrique puis révélées en suivant le protocole décrit précédemment Antigénicité de la 3-Lg La figure 18 indique les différentes bandes protéiques ou polypeptidiques reconnues par les IgG anti g-lg. On ne note aucune différence entre les bandes du lactosérum traité aux micro-ondes et le lactosérum natif (couloir 2 et 3). Nous pouvons remarquer aussi une diminution de l intensité des bandes correspondant aux hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques irradiés ce qui traduirait une baisse de l antigénicité de la g-lg Antigénicité de l 6-La Le couloir 3 représente le lactosérum soumis aux rayonnements micro-ondes. Comme on peut constater dans la figure 19, la bande protéique est plus intense que celle du lactosérum natif (couloir 2). Il en est de même pour la bande correspondant à l hydrolysat trypsique sous MO par rapport à l hydrolysat classique. On note une antigénicité comparable entre le lactosérum et l hydrolysat trypsique/micro-ondes. Cependant, le lactosérum soumis à l hydrolyse chymotrypsique sous l influence des MO donne une bande moins nuancée (couloir 6) que celle des lactosérums, néanmoins, la méthode conventionnelle a montré une diminution plus marquée. 56

69 RESULTATS Puits1 Puits2 Puits3 Puits4 Puits5 Puits6 Puits7 A KIT LSN LSNmo T Mo Tc CH Mo CH c BLg B KIT LSN LSNmo Tmo Tc CH mo CHc Figure 18. Profils éléctrophorètiques et immunoblots des lactosérums natifs et traités, et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques A : électrophorèse par SDS-PAGE. B : révélation par immunoblotting par les IgG anti g-lg. Puits 1 : kit (Caseine, SAB, g-lg, h-la) Puits 2 : Lactosérum natif. Puits 3 : Lactosérum natif traité aux MO. Puits 4 : Trypsine + MO pendant 15mn. Puits 5 : Trypsine classique (B.M) pendant 15min. Puits 6 : Chymotrypsine +MO pendant 15min. Puits 7 : Chymotrypsine classique (B.M) pendant 15mn. 57

70 RESULTATS Puits 1 Puits 2 Puits 3 Puits 4 Puits 5 Puits 6 Puits 7 66,2 25, , ,4 A 14,2 PM KIT LSN LSNmo T Mo Tc CH Mo CH c a b B P-La Figure 19. Profils éléctrophorètiques et immunoblots des lactosérums natifs et traités, et des hydrolysats trypsiques et chymotrypsiques A : électrophorèse par SDS-PAGE. B : révélation par immunoblotting par les IgG anti h-la. Puits 1 : kit (Caseine, SAB, g-lg, h-la) Puits 2 : Lactosérum natif. Puits 3 : Lactosérum natif traité aux MO. Puits 4 : Trypsine + MO pendant 15mn. Puits 5 : Trypsine classique (B.M) pendant 15mn. Puits 6 : Chymotrypsine +MO pendant 15mn. Puits 7 : Chymotrypsine classique (B.M) pendant 15mn. PM : Poids moléculaire. 58

71 DISCUSSION 59

72 DISCUSSION Discussion Ce travail a été entrepris dans le but d évaluer les effets d un traitement micro-ondes combiné à une hydrolyse enzymatique, sur la réduction du pouvoir antigénique du lactosérum bovin et plus précisément de l h-la et de la g-lg, les deux protéines majeures du lactosérum. Les formules infantiles à base d hydrolysats ont été développées dans le but de réduire les réactions d hypersensibilité vis-à-vis des protéines antigéniques du lait. Cependant, des études sur des hydrolysats partiels et poussés ont démontré que des épitopes immunoréactifs pouvaient persister dans ces derniers(plebani et al., 1990; Sampson et al., 1992; Ragno et al., 1993; Van Beresteijn et al., 1995; Restani et al., 1995, 1996) et que cela pouvait entrainer des réactions adverses chez certains sujets atopiques (Businco et al., 1989; Saylor et Bahna, 1991). En effet, l hydrolyse que subissent les protéines permet de réduire le nombre d épitopes antigéniques et donc le risque de sensibilisation, mais la persistance de peptides de poids moléculaire supérieur à 3500 Da ne permet pas de garantir une totale innocuité en cas d allergie avérée aux PLV (Tounian, 2006). Dans notre travail nous avons, dans un premier temps, déterminé l effet des microondes à 40 C sur la réactivité des lactosérums bovins. Sawyer (2003) a démontré que la dénaturation de la g-lg pouvait débuter à 30 C par une dissociation des dimères en monomères. Ceci est accompagné d'un déplissement évident des zones d'hydrophobicité de la protéine (Cheftel et Lorient, 1982). Or, nos résultats ne montrent aucun changement de réactivité vis-à-vis des IgG anti g- Lg, nous laissant penser qu il n y a pas eu démasquage d épitopes antigéniques sous l influence des micro-ondes. Ceci concorde avec les résultats obtenus lors de l application du traitement haute pression seul sur les protéines du lactosérum où une diminution très minime de la réactivité de la g-lg a été observée (Peñas et al., 2006). En revanche, on note une légère augmentation de la réactivité vis-à-vis des IgG anti h-la probablement liée à l apparition d épitopes initialement masqués dans la structure native sous l influence des micro-ondes, un traitement connu pour affecter la structure des protéines (Izquierdo et al, 2005). Selon des études sur l ADN des plasmides Sagripanti et al., (1987), ont montré que les rayonnements micro-ondes entrainaient une rupture des liaisons covalentes de l ADN. Dans le but de réduire le taux de protéines antigéniques, l hydrolyse enzymatique associée à un traitement conventionnel est la méthode la plus couramment utilisée pour la 60

73 DISCUSSION fabrication de lait partiellement hydrolysé. Dans notre travail, nous avons tenté d utiliser une technique alternative qui consiste à remplacer le chauffage classique par les rayonnements micro-ondes. Depuis quelques années, plusieurs chercheurs ont démontré que les MO augmentaient la vitesse des réactions organiques (Gedye et al., 1986; Giguere et al., 1986; Bose et al., 1990, 1997; Erickson 1998; Lidstrom et al., 2001; Richter et al., 2001; Bose et al., 2002; Larhed et al., 2002). De ce fait, les micro-ondes ont été ainsi utilisés pour accélérer le processus d hydrolyse en quelques minutes versus quelques heures pour la méthode traditionnelle (Pramanik et al., 2002). Les avantages du traitement par les micro-ondes ont également été rapportés dans l accélération de l hydrolyse des protéines (Chen et al., 1987; Chiou et Wang, 1989; Marconi et al., 1995). Une évaluation de la réactivité des hydrolysats trypsique sous micro-ondes et au bain marie est effectuée par la technique ELISA. On remarque une baisse de reconnaissance de la g-lg par les IgG spécifiques pour les deux types d hydrolyse cependant, cette diminution est plus importante dans les échantillons soumis aux micro-ondes pendant 5 minutes. En revanche, si on augmente la durée d exposition à 15 minutes, on n observe aucune différence significative entre les deux modes d hydrolyse. Cette diminution pourrait s expliquer par le fait que les rayonnements micro-ondes ont non seulement entrainé une accélération de l hydrolyse trypsique comme celle démontrée pour le traitement haute pression/trypsine (Van Willige et Fitzgerald, 1995; Stapelfeldt et al., 1996 ; Maynard et al., 1998) mais ont également permis aux enzymes de scinder des régions habituellement inaccessibles avec l hydrolyse conventionnelle. Bohr et Bohr (2000a, 2000b) ont décrit le dépliement et la dénaturation de la g-lg par les micro-ondes, ce qui favoriserait l hydrolyse de la protéine par les protéases (Izquierdo et al., 2008). Une diminution de l immunoréactivité sous haute pression de la g-lg a aussi été constatée par Bonomi et al., (2003). Il en est de même que pour les protéines du lactosérum bovin (Peñas et al., 2006; 2006a; 2006b). Entre 40 et 55 C, la transition de Tanford peut avoir lieu (Rytkönen, 2006), favorisant l ouverture partielle de la cavité hydrophobe de la protéine, ce qui permettrait d expliquer l efficacité de la trypsine (Groleau, 2003). L h Lactalbumine a largement été étudiée ces dernières années pour sa capacité à former le «Molten Globule» (Wijesinha-Bettoni, 2001) qui correspond à un stade intermédiaire entre la forme native et la forme dénaturée comportant une grande partie de la structure secondaire (Dolgikh et al., 1981; Ohgushi & Wada, 1983; Dolgikh et al., 1985). En présence d un ion calcium, l h-la existe sous sa forme native. L holo h-lactalbumine est une 61

74 DISCUSSION forme contenant plutôt deux Ca²+ et l apo h-lactalbumine la forme qui n en contient aucun (Bertrand, 2008). À 37 C, certaines fractions de la protéine sous la forme apo sont dans un état dénaturé et donc plus accessible à l attaque par la trypsine (Permyakov et al., 1991). Le calcium aide à stabiliser la conformation de l h-la et améliore sa résistance aux traitements thermiques. Considine et al., (2007) ont également démontré que l h-la se dénaturait plus lentement que la g-lg à toutes les températures, il en est ainsi pour la digestion trypsique et chymotrypsique qui est ralentie par la présence de calcium dans la structure de la protéine (Hirai, 1992). La réactivité des lactosérums soumis à une hydrolyse trypsique sous bain-marie vis-àvis de l h-la s avère plus importante par rapport au traitement combiné hydrolyse/microondes (5 et 15 mn). Selon notre point de vue, plusieurs hypothèses peuvent expliquer cela: insuffisantes. trypsine. Les durées d hydrolyses combinées aux rayonnements MO ont été les rayonnements MO ont peut être masqué les sites de coupures de la les changements de la structure tridimensionnelle induits par les rayonnements ont probablement démasqué certains épitopes antigéniques. Cependant, pour confirmer ou infirmer ces hypothèses, des études plus approfondies sont nécessaires. Nous avons ensuite déterminé l antigénicité des hydrolysats chymotrypsique au temps 5 et 15 minutes pour les deux protéines citées précédemment. L analyse par ELISA traduit une diminution plus prononcée de la réactivité vis-à-vis de la g-lg des hydrolysats irradiés par rapport aux hydrolysats conventionnels. Dans leurs travaux, Izquierdo et al., (2007) ont obtenus des résultats similaires quant à l utilisation du traitement combinés MO/chymotrypsine pour réduire efficacement l antigénicité de la g-lg et ont relié cela à une augmentation de l affinité enzyme/substrat sous ces conditions. Les hydrolysats chymotrypsiques obtenus sous MO montrent une augmentation de liaisons des IgG spécifiques anti h-la en comparaison avec les hydrolysats classiques. Ceci corrobore les résultats obtenus par Salah (2008), qui indiquent une résistance de l h-la à l hydrolyse sous l influence des micro-ondes. Néanmoins, on remarque qu il n y a pas une 62

75 DISCUSSION diminution notable de la réactivité par rapport aux lactosérums que ce soit pour la méthode classique ou non conventionnelle, ce qui nous laisse penser que le taux d hydrolyse de l h-la n a pas été suffisant probablement à cause de la présence de l ion calcium. Peñas et ses collaborateurs (2006) ont rapporté dans leurs travaux que l h-la n était pas hydrolysée par la chymotrypsine quelque soit la pression appliquée. Izquierdo et al (2007, 2008) suggèrent que les rayonnements micro-ondes n accélèrent pas l hydrolyse de la g-lg par un phénomène thermique étant donné que le traitement conventionnel est lui-même réalisé à 40 c, et que l efficacité des micro-ondes dépend également du choix de l enzyme utilisée. Nous avons comparé alors statistiquement l action des deux enzymes, trypsine et chymotrypsine, sur la réactivité des IgG spécifiques anti h-la et anti g-lg au temps 15 min. nos résultats n ont montré aucune différence significative relative à l utilisation de l une ou l autre enzyme sous micro-ondes. En revanche, l immunoreactivité des deux hydrolysats vis-à-vis de l alpha lactalbumine a été plus importante sous l influence des micro-ondes versus bain-marie. Afin de confirmer les résultats obtenus par Elisa et vérifier l immunoréactivité des bandes protéiques présentes dans les échantillons traités pendant 15min et retenus dans les gels SDS-PAGE, nous avons réalisés un Western-blot avec des sérums immuns obtenus chez des lapins immunisés à la g-lg et à l h-la. Nos résultats montrent l existence d une forte reconnaissance des bandes protéiques correspondant à la g-lg dans les couloirs du kit marqueur ainsi que des deux lactosérums natifs et traités aux micro-ondes. En revanche, on observe une diminution, voire même une absence de résidus reconnaissables par les IgG anti g-lg respectivement dans les hydrolysats chymotrypsiques et trypsiques sous MO. La persistance de produits d hydrolyse immunoréactifs dans la méthode conventionnelle nous permet alors de déduire que les rayonnements MO ont permis aux enzymes utilisées de mieux cibler les sites antigéniques en dévoilant les séquences habituellement cachées lors d un traitement classique (bain-marie ). Dans notre travail, nous avons observé que les IgG dirigés contre l h-la, ont nettement reconnu la protéine cible dans le kit marqueur. Mais si on compare entre les lactosérums natifs et traités par les micro-ondes, on remarquera que la bande h-la du LSN /MO est légèrement plus nuancée que celle du lactosérum natif avec de surcroit, une reconnaissance de deux autres bandes ayant un poids moléculaire supérieur à 23 KDa environ. Une légère bande correspondant à la g-lg est également perceptible, d où l augmentation de la 63

76 DISCUSSION réactivité du lactosérum irradié révélé par ELISA. L hypothèse que nous pouvons émettre est la présence dans ces bandes protéiques d épitopes antigéniques communs identifiés par les anticorps spécifiques. Sharma et al (2001) ont démontré que l h-la et la g-lg possédaient une portion continue identique de 4 acides aminés qui semblerait être responsable de la réactivité croisée entre ces deux protéines. Jarvinen (2001) a démontré que le site antigénique majeur (A.A 5-18) localisé sur l h-la correspondait à une séquence semblable situé dans la g-lg (A.A ). Les bandes correspondant aux hydrolysats sont moins intenses dans les échantillons traités au bain marie que ceux soumis aux micro-ondes, ceci confirme les résultats obtenus par ELISA où l hydrolyse classique a eu une influence sur la réduction de l antigénicité alors que le traitement sous rayonnements micro-ondes tend à l accroitre. 64

77 CONCLUSION 65

78 CONCLUSION Conclusion Le travail présenté dans ce mémoire a permis d évaluer les effets de l hydrolyse trypsique ou chymotrypsique combinée aux rayonnements micro-ondes sur la modification de l antigénicité de la beta lactoglobuline ainsi que de l h-lactalbumine. Nos résultats ont montré une diminution importante de la réactivité du lactosérum hydrolysé par les endopeptidases sous l influence des micro-ondes vis-à-vis des IgG anti g-lg, et cet effet est plus marqué si on prolonge la durée des traitements. En revanche, le traitement aux micro-ondes du lactosérum natif ainsi que des hydrolysats semble accroitre la reconnaissance de l h-la par les IgG spécifiques. A partir de ces résultats, nous concluons que les MO appliqués lors de l hydrolyse enzymatique ont permis un meilleur accès des protéases aux différents sites de clivage de la g-lg. Cette étude nous a également permis de démontrer que les rayonnements micro-ondes augmentent la résistance de l h-la à l hydrolyse et peut être même entraineraient l apparition d épitopes habituellement masqués. Comme perspectives, nous pensons qu il serait utile de : Augmenter la durée du traitement combiné (de 20 à 60 mn). Etudier l effet de ce traitement combiné sur l allergénicité des protéines du lactosérum en utilisant les modèles d allergies valides. Effectuer une étude plus approfondie avec l évaluation de l antigénicité/allergénicité des peptides issus de l hydrolyse combinée aux rayonnements micro-ondes. Et enfin, tester l effet de ces traitements combinés en associant les deux enzymes (Trypsine et Chymotrypsine). 66

79 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 67

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95 ANNEXES

96 ANNEXES NOMENCLATURE DES ACIDES AMINES Cette brochure est réalisée dans le cadre de la préaration d un mémoire de Magistère dont le thème porte sur : L ETUDE DU POTENTIEL ANTIGENIQUE DES PROTEINES DU LACTOSERUM BOVIN APRES HYDROLYSE ENZYMATIQUE TRYPSIQUE ET CHYMOTRYPSIQUE SOUS IRRADIATION AUX MICRO- ONDES. KAZI-TANI AMILA Mémoire de Magistère Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire 84 Université d Oran

97 Nom complet de l'acide aminé Code à une lettre Code à trois lettres Alanine A Ala Arginine R Arg Asparagine N Asn Aspartate ou acide aspartique D Asp Cystéine C Cys Glutamate ou acide glutamique E Glu Glutamine Q Gln Glycine G Gly Histidine H His Isoleucine I Ile Leucine L Leu Lysine K Lys Méthionine M Met Phénylalanine F Phe Proline P Pro ANNEXES Les acides aminés se différencient les uns des autres par leur radical. On peut donc théoriquement faire une infinité d'acides aminés. Cependant, on constate que chez l'homme, comme chez de nombreuses espèces, seuls vingt acides aminés différents sont incorporés dans les protéines lors de la traduction. Leur masse molaire moléculaire moyenne est de 110 Da. Pour plus de commodité, un code international de correspondance à une et trois lettres peut être utilisé pour désigner chacun de ces vingt acides aminés (Source : Sérine S Ser Thréonine T Thr Tryptophane W Trp Tyrosine Y Tyr Valine V Val Les différents acides aminés intégrés lors de la synthèse des protéines 85