Identification des microorganismes par spectrométrie de masse. 1. Identification conventionnelle au laboratoire de microbiologie

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1 Identification des microorganismes par spectrométrie de masse Alain Bizzini Institut de Microbiologie Plan 1. Identification conventionnelle au laboratoire de microbiologie 2. Principes de fonctionnement de l identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF 3. Utilisation pratique 4. Etude prospective CHUV 5. Perspectives et Conclusions 1

2 1 Identification conventionnelle 2

3 3

4 4

5 2 MALDI-TOF Processus d identification Sélection colonie Préparation sur plaque cible MALDI Acquisition du profil au MALDI-TOF Interprétation des données et identification 5

6 MALDI-TOF MS Acceleration Drift Sample cristallized with matrix Electrodes Detector Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Intensity m/z Bruker Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, 1998 Intens. [a.u.] Escherichia coli Bruker m/z 6

7 Intens. [a.u.] 3000 Aspergillus fumigatus Intens. [a.u.] Bacillussubtilis Candida albicans Escherichia coli m/z Bruker Pattern matching Bruker 7

8 1. Echantillons inconnus 2. Match contre database de référence 3. Résultat de l identification 3 En pratique 8

9 9

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13 4 Etude prospective CHUV avril 09 Méthodologie Durant 4 semaines mise en parallèle de toutes les identifications conventionnelles à l espèce (Vitek2, API, ) avec l identification MALDI-TOF 13

14 Méthodologie Durant 4 semaines mise en parallèle de toutes les identifications conventionnelles à l espèce (Vitek2, API, ) avec l identification MALDI-TOF Principe de l id MALDI-TOF: 1. Dépôt direct 2. Si score 2 ok stop 3. Si score <2 Extraction (Acétonitrile/Acide formique) et nouveau dépôt Collectif 1371 identifications conventionnelles à l espèce vs MALDI Valide (score 2): 1278 (93,2%) Non-valide (score <2): 93 (6,8%) 14

15 Collectif 1371 identifications conventionnelles à l espèce vs MALDI Valide (score 2): 1278 (93,2%) Non-valide (score <2): 93 (6,8%) 1278 valides: 1215 concordants à l espèce (88,6% 95,1%) 39 concordants au genre (2,8% 3%) 24 discordants au genre (1,8% 1,9%) Collectif 1371 identifications conventionnelles à l espèce vs MALDI Valide (score 2): 1278 (93,2%) Non-valide (score <2): 93 (6,8%) 1278 valides: 1215 concordants à l espèce (88,6% 95,1%) 39 concordants au genre (2,8% 3%) 24 discordants au genre (1,8% 1,9%) 93 non valides: 61 score 1,7-2 (4,4%) 42 concordant et 19 discordants 32 score <1,7 (2,3%) 15

16 Concordance avec les méthodes phénotypiques parmi 1278 valides à l espèce Gram positif n % id match Staphylococcus aureus % Enterococcus faecalis % Staphylococcus epidermidis % Streptococcus agalactiae % Enterococcus faecium % Streptococcus pneumoniae % Streptococcus pyogenes 9 89% Gram négatif Levures Escherichia coli % Pseudomonas aeruginosa 99 99% Klebsiella pneumoniae 59 97% Enterobacter cloacae 48 60% Proteus mirabilis % Haemophilus influenzae % Klebsiella oxytoca 31 90% Stenotrophomonas maltophilia 30 57% Candida albicans % Candida glabrata 5 100% Concordance parmi 1278 valides à l espèce selon MALDI (score >2) B Gram- (n=723) C Gram+ (n=512) B Gram+ (n=17) C Gram- (n=1) Levures (n=24) Espèce ok Genre ok Discordants 92,4 (669) 4,7 (34) 2,9 (21) 99,2 (508) 0,8 (4) 76,5 (13) 5,9 (1) 17,6 (3) 100 (1) 100 (24) Overall 95,1 (1215) 3 (39) 1,9 (24) 16

17 Concordance parmi 1278 valides à l espèce selon MALDI (score >2) B Gram- (n=723) C Gram+ (n=512) B Gram+ (n=17) C Gram- (n=1) Levures (n=24) Espèce ok Genre ok Discordants 92,4 (669) 4,7 (34) 2,9 (21) 99,2 (508) 0,8 (4) 76,5 (13) 5,9 (1) 17,6 (3) 100 (1) 100 (24) Overall 95,1 (1215) 3 (39) 1,9 (24) Analyse de tous les discordants à l espèce valides (N= 63/1278 4,9%) Discordances s étant corrigées (id conv incorrecte): 7 17

18 Analyse de tous les discordants à l espèce valides (N= 63/1278 4,9%) Erreurs techniques attribuables Inversion isolats : 39/1278 (3,1%) 18

19 Autres études Etude prospective sur l identification directe des hémocultures positives 90% d identification des Bacilles Gram- (n=46) 73% d identification des Coques Gram+ (n=74) Autres études Etude rétrospective sur des souches ayant nécessité un séquençage 16S (n=500) ~60% identifiées 19

20 4 Perspectives et Conclusions Deux principaux systèmes actuellement 20

21 Deux principaux systèmes actuellement species level: 88% (634/720) 79% (568/720) genus level: 97% (695/720) 93% (672/720) Cherkaoui et al., SSM 2009 Abstract P116 Temps de détection et coûts Seng et al., CID

22 Identification dans d autres types de prélèvements Identification hémocultures positives 22

23 Identification pathogènes urinaires Identification cultures mixtes? VITEK ID: Enterococcus sp. MALDI ID: Detected Species log(score) Staphylococcus epidermidis CHB Staphylococcus epidermidis CHB Enterococcus faecalis _CHB Enterococcus faecalis ATCC 7080 THL Enterococcus faecalis 20247_4 CHB Enterococcus faecalis ATCC 29212_CHB Enterococcus faecalis ATCC THL Staphylococcus epidermidis DSM Staphylococcus epidermidis ATCC THL Staphylococcus epidermidis 6b s ESL Données Bruker 23

24 Typage Barbuddhe et al., AEM 2008 Détection de phénotypes de virulence ou d antibiorésistance 24

25 Détection PVL S. aureus Sensibilité 100% Specificité 90.6% PPV 40% NPV 100%. Bittar et al., IJAA 2009 Détection MRSA Majcherczyk et al., FEMS Microbiol lett

26 En conclusion Homologation IVD-CE (mai 2009). Ergonomie en usage de routine. Interfaçage à l informatique du laboratoire. En conclusion L identification des microorganismes par MALDI-TOF est simple, rapide, fiable, économique. L amélioration des techniques et des bases de données conduira à élargir la gamme des identifications possibles. La mise en évidence de caractères de virulence et de résistance va sûrement se développer. 26