L3 BIOLOGIE CELLULAIRE

Transcription

1 L3 BIOLOGIE CELLULAIRE S Première Session (BIO17) BIOLOGIE MOLECULAIRE DE LA CELLULE III Ce sujet et celui de F. André doivent être rédigés sur des copies séparées Sujet de C. Vola et N. Bertrand Durée : 1h, Sans document ni calculette. Les réponses aux questions doivent être précises et courtes (quelques phrases) ; ces critères seront pris en compte dans la notation. Dans cet exercice, on s intéresse au rôle de la Polo kinase 3 (Plk3) dans le cycle cellulaire (adapté de Zimmerman et Erikson, PNAS 2007). 1) Des cellules épithéliales mammaires humaines (MCF 10A), en culture, sont carencées en sérum pendant 72h puis stimulées par addition de sérum (temps 0) ; toutes les 4h après addition de sérum, les cellules sont analysées par FACS (figure 1a) et un extrait protéique total est analysé par Western Blot avec des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines indiquées (figure 1b). Figure 1 Plk1: Polo kinase 1 Erk2 est un standard interne a) Rappelez le principe de l analyse réalisée ici à l aide du FACS. b) A quel stade les cellules carencées en sérum sont elles bloquées? c) A quoi sert l addition de sérum et par quel mécanisme agit il? REPONSES 1 a) 1 point La cytométrie de flux (FACS, Fluorescent Activated Cell Sorter) est une méthode optique pour quantifier des cellules et étudier leur distribution dans le cycle cellulaire ; Les détecteurs de fluorescence permettent d étudier n importe quelle composante de la cellule que l on peut marquer avec une sonde fluorescente. L iodure de propidium par exemple marque l ADN. L intensité de la fluorescence dépend de la quantité d ADN : les cellules contenant 2N chromosomes de DNA sont les cellules en G 1 et les cellules non

2 proliférantes. Les cellules contenant 4N chromosomes de DNA sont en G 2 ou en mitose. Entre ces deux valeurs, on trouve les cellules en phase S. Résultat type d une analyse du cycle cellulaire par FACS 1 b) 1 point Les cellules carencées en sérum sont bloquées en G0 1 c) 2 points Présence de facteurs de croissance dans le sérum ; La transition de l état de repos vers la prolifération est dépendante de l action de facteurs mitogènes ou facteurs de croissance. La liaison du facteur de croissance à son récepteur transmembranaire provoque une cascade de signaux intracellulaires : activation d une petite GTPase, Ras, qui conduit à l activation de la cascade MAP Kinase et enfin à l activation du gène de la protéine Myc, qui est un facteur de transcription. Myc déclenche la transcription du gène de la Cycline D. En présence de cycline D, le complexe Cycline D / Cdk 4 peut se former et être activé. En absence de facteurs de croissance, la Cycline D n'étant plus synthétisée, la cellule se retrouve sans complexe Cycline D / Cdk4 actif. La cellule retourne alors en G0. PASSAGE DU POINT DE RESTRICTION 2) Des cellules humaines HeLa sont synchronisées par un double blocage par la thymidine : un excès de thymidine inhibe la ribonucléotide réductase qui convertit les ribonucléotides en désoxyribonucléotides, ce qui bloque les cellules en début de phase S. Puis, on lève le blocage par un changement de milieu (0h). Aux temps indiqués, les cellules sont analysées par FACS (figure 2a) et les protéines cellulaires sont analysées par Western Blot (figure 2b).

3 a Figure 2 b Que conclure quant à l expression de Plk3 au cours du cycle cellulaire? Vous justifierez votre réponse en tenant compte des résultats obtenus au 1) et au 2). REPONSE 2 4 points Dans les cellules MCF10A (fig1), la quantité de Plk3 augmente et atteint un pic en G1, environ 8h après la stimulation par le sérum, avant que le taux de cyclin E1 soit au maximum (12h). La Mitose se produit à 24 28h (basé sur la proportion de cellules avec un contenu de 4NDNA) Dans les cellules Hela (fig2), synchronisées en début de phase S, la Mitose se produit 8 10h après la levée du blocage, au moment du pic de Cyclin B1 ; Plk3 est maximum à 14 16h, en même temps que la Cyclin D1 donc en phase G1. Ces résultats démontrent que le taux de la protéine Plk3 est régulé au cours du cycle cellulaire ; elle est exprimée en phase G1, ce qui suggère un rôle possible de Plk3 pendant cette phase du cycle 3) Les cellules MCF 10A sont infectées par des virus exprimant des RNAi : 1 virus contrôle (puro.1) et 1 virus exprimant un RNAi dirigé contre l ARNm de Plk3 (Plk3 1601). La même expérience que celle de la figure 1a est réalisée aux temps indiqués (figure 3a). La figure 3b est une analyse en Western Blot des extraits protéiques des 2 cultures, au temps 0 et après 8h l ajout de sérum.

4 Figure 3 a) Quel est le but de l expérience 3b? Expliquez son résultat. b) Quelle conclusion pouvez vous formuler quant à la fonction de Plk3 dans le cycle cellulaire? REPONSES 3 a) 1 point L expérience 3b a pour but de vérifier l efficacité du RNAi ; en effet après infection par le virus contrôle, la protéine Plk3 est présente après 8h de stimulation mais elle n est pas détectée après infection par le virus Plk qui exprime un RNAi dirigé contre Plk3 3 b) 2 points Les résultats de la suppression de Plk3 par RNAi suggèrent que Plk3 est nécessaire en G1 pour passer le point de restriction et rentrer en phase S. Les cellules qui ont déjà passé ce point de restriction complètent leur cycle normalement mais sont incapables d initier un nouveau cycle 4) Les cellules MCF 10A sont infectées avec le virus contrôle puro 1 (1) ou le virus Plk (2) et synchronisées par une carence en sérum ; 8h après l addition de sérum on analyse les protéines par Western blot avec les anticorps indiqués (figure 4a) et les ARN indiqués par RT PCR (figure 4b) a 1 2 b Figure 4

5 a) Par quel mécanisme Plk3 participe t il au contrôle du cycle cellulaire? b) Donner un modèle intégrant vos connaissances et les résultats obtenus dans cette étude sur le rôle de Plk3. Vous intègrerez dans ce modèle des hypothèses sur les voies de régulation de l expression de Plk3 ainsi que des hypothèses sur les régulations impliquées dans votre conclusion du 4a. 4 a) 4 points La suppression de Plk3 par le RNAi n a pas d effet sur l expression de cycline D1 : on détecte la même quantité d ARNm et de Protéine après infection par le virus contrôle et le virus Plk Même résultat pour l ARNm de cycline E1 ; en revanche on ne détecte plus de protéine Cycline E1 ; ce résultat suggère que Plk3 régule le taux de Cycline E1 par un mécanisme post transcriptionnel. 4 b) 5 points Plk3 étant une kinase, on peut faire l hypothèse qu elle contrôle la stabilité de la protéine Cycline E1 et l empêche d être dégradée, soit directement en la phosphorylant, soit indirectement en activant par phosphorylation une autre protéine activatrice de Cycline E1 (comme Cdc25A parex.). Or la Cycline E est nécessaire pour l entrée des cellules en phase S (voir poly cours 3) La Plk3 est synthétisée pendant la phase G1 ; on peut supposer que son expression est sous le contrôle des facteurs de croissance et que c est par ex. une cible de myc. On peut proposer le modèle suivant : Synthèse de Plk3