3. Cinétique enzymatique

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1 3. Cinétique enzymatique 3.1 Introduction aux enzymes Une enzyme est un catalyseur biologique qui augmente la vitesse d une réaction par plusieurs ordres de grandeur en diminuant son énergie libre d activation, sans être elle-même affectée. Certains enzymes sont extrêmement spécifiques et ne fonctionneront que sur un seul et unique réactif (substrat); d'autres ont un large spectre et fonctionnent sur une structure partagée par de nombreuses molécules qui peuvent toutes lui servir de substrat. Une enzyme agit comme catalyseur en se liant au substrat et facilite sa réaction en stabilisant son état de transition vers un produit spécifique: Substrat(s) enzyme Produit(s) La majorité des enzymes sont des protéines ou des glycoprotéines. Les sites actifs des enzymes contiennent souvent des composantes chimiques (organiques ou inorganiques), autres que des acides aminés (ex. Fe 2, Mn 2, Zn 2 ou Mg 2, biotine, vitamines B), qui sont essentielles 110 pour l activité catalytique. La partie protéique d une enzyme est l apoenzyme et la partie non protéique est le cofacteur ou la coenzyme: aloenzyme = apoenzyme cofacteur Les cofacteurs ou coenzymes se lient de façon transitoire à l apoenzyme. Un groupement prosthétique - cofacteur lié de façon covalente à l enzyme. Par exemple, l oxydase d acide D-aminé catalyse la réaction suivante: 3 -C(R)-C oxydase d'acide D-aminé R-C-C Cette enzyme monomère est constituée d un apoenzyme polypeptidique et d une coenzyme rédox, le dinucléotide d adénine flavine (FAD), qui est lié de manière non-covalente à l apoenzyme (constante d association de 3.6 x 10-6 M): Enzyme(FAD) Substrat Enzyme(FAD 2 ) Produit Enzyme(FAD 2 ) 2 Enzyme(FAD) Réaction nette: Substrat 2 Produit C 2 C P P C 3 C 3

2 Classification des enzymes Selon les réactions catalysées, les enzymes peuvent être classées dans six grandes catégories: 1. xydoréductases- qui catalysent des transferts d'électrons et de protons d un donneur à un accepteur 2. Transférases- qui catalysent les transferts de groupements 3. ydrolases- qui catalysent des réactions d'hydrolyse (coupure des liens C-C, C-, C- et autres par de l eau) 4. Lyases- qui catalysent l'addition de groupes à des liens doubles ou l'inverse 5. Isomérases- qui catalysent le transfert de groupes dans une même molécule pour produire des formes isomères (ex. conversion d'un acide aminé L en acide aminé D) 6. Ligases- qui forment des liens C-C, C-S, C- et C- lors de réactions de condensation couplées à l'utilisation d'atp 112 omenclature Chaque enzyme est assignée un code à quatre chiffres par la Commission des Enzymes (EC) de l union International de Biochimie de Biochimie Moléculaire: om de l enzyme (EC W.X.Y.Z) EC- système numérique de la commission des enzymes W- indique la réaction catalysée (1-6) X- indique le substrat général (ou groupe de substrats) impliqué Y- indique le substrat spécifique ou la coenzyme Z- le numéro de série de l enzyme Ex. oxydase de glucose EC

3 Définition de l activité enzymatique Il est difficile de mesurer la quantité d enzyme en unités de masse ou de concentration molaire; l activité enzymatique est défini en terme de vitesse de réaction. L unité international (I.U.) est le montant d enzyme requis pour convertir 1-µmol de substrat en produit dans 1 min à une température et p spécifiés (ex. p 7.0 et 25 C) et sous des conditions de saturation du substrat: I.U. = 1-µmol substrat consommé/min L activité spécifique d une enzyme est l activité catalytique par unité de masse de protéine (I.U./mg d enzyme solide) Le taux de roulement («turnover number» en anglais) exprime l activité catalytique en terme d unités par mol d enzyme pure (au lieu de mg de protéine) Les enzymes en chimie bioanalytique Détection et quantification des enzymes: - Des taux anormaux d enzymes dans le plasma sanguin indiquent des problèmes métaboliques. - Les essais enzymatiques sont des méthodes efficaces pour évaluer la qualité des aliments et pour vérifier l efficacité des processus de stérilisation et de pasteurisation. Applications analytiques: - essais immuno-enzymatiques, électrodes à enzymes, enzymes immobilisées - Les enzymes constituent des outils analytiques importants; elles offrent des méthodes sensibles et sélectives pour l identification et quantification des biomolécules (substrats, activateurs, inhibiteurs), ainsi qu une amplification catalytique de l analyte. 115

4 3.3 ature du site actif Le «site actif» d une enzyme est la région tridimensionnelle qui se lie au substrat. Les sites actifs sont des cavités de caractère non polaire et dans lesquelles les substrats s insèrent. L eau est normalement exclut du site actif lorsque le substrat est lié, sauf si elle est un réactif. Le site actif consiste d'au moins deux parties fonctionnelles, qui peuvent ou non être voisines sur la chaîne polypeptidique (si non, la structure tertiaire les amène près l'une de l'autre): -le site de reconnaissance du substrat est constitué de certains acides aminés qui sont associés avec l orientation du substrat, et donc, avec la spécificité de l enzyme -le site catalytique est constitué des résidus qui sont directement impliqués dans la formation et rupture des liens chimiques. Ces résidus sont souvent localisés dans le fond de la cavité, et dans la majorité des cas, possèdent des chaînes latérales ioniques ou réactives (ex. is, Lys, Cys, Ser, Asp, Glu). 116 Deux modèles pour expliquer la spécificité des enzymes: Clé-serrure: la forme du site actif est complémentaire à celle du substrat Substrat a b Enzyme c Complexe enzyme-substrat Forme induite: l enzyme change sa conformation lors de la liaison du substrat. Substrat a b Enzyme c Complexe enzyme-substrat 117

5 3.4 ature des interactions substrat-enzyme Les substrats sont liés aux enzymes par des interactions faibles: constantes d association de 10-2 à10-8 M et G d interaction entre -3 et -12 kcal/mol (vs. -50 à -110 kcal/mol pour des liens covalents). La liaison du substrat au site actif implique souvent de nombreuses liaisons non-covalentes de types - van der Waals - électrostatiques - ponts hydrogènes Ces 3 types de liaisons non-covalentes diffèrent dans leurs contraintes géométrique, force et spécificité. De plus, elles sont profondément affectées (de manière différente) par la présence d eau. 118 Interactions électrostatiques La force d une interaction électrostatique est donnée par la loi de Coulomb: F= q 1 q 2 /r 2 D. Une interaction électrostatique est plus forte dans le vide (où D=1) et plus faible dans l eau (où D=80). Un substrat chargé négativement peut former un lien électrostatique avec la chaîne latérale des résidus Lys, Arg et is, ainsi qu avec l amine terminale d une chaîne polypeptidique si, dûs à leurs pk a s, ces groupements sont chargés positivement au p du milieu. Un substrat chargé positivement peut interagir avec les résidus Asp et Glu, ainsi qu avec un carboxylate terminal. - environnement non-polaire - milieu aqueux 119

6 Ponts hydrogènes Les ponts hydrogène dans des systèmes biologiques sont entre des hydrogènes liés à des oxygènes ou azotes et des atomes d oxygène ou d azote. Distances des ponts hydrogène: 2.63 à 3.10 Å Energies de liaison: 3 à 7 kcal/mol liaison forte liaison faible Les acides aminés peuvent formés une variété de ponts hydrogène; 11 des 20 acides aminés peuvent former des ponts hydrogène à travers leurs chaînes latérales (donneurs ou accepteurs d hydrogène). mileu non-polaire Une caractéristique importante d un pont hydrogène est son sens directionnel. La spécificité des interactions enzymesubstrat résulte des ponts hydrogène qui sont hautement directionnels et de la forme du site actif qui exclut les molécules n ayant pas une forme complémentaire. mileu aqueux 120 Interactions van der Waals L interaction de van der Waals est due à une force attractive non-spécifique entre deux atomes qui sont séparés par 3 à 4 Å. L énergie de liaison pour une paire d atomes est de l ordre de 1 kcal/mol (interaction faible). Une interaction efficace de type van der Waals entre un substrat et une enzyme peut seulement avoir lieu si leurs formes sont complémentaires du point de vue stérique. (D après L. Stryer, Biochemistry, W. Freeman, 1981) 121

7 Une spécificité résulte d une possibilité de former simultanément un grand nombre de liaisons van der Waals entre le substrat et l enzyme. Les répulsions entre les atomes qui sont plus proches de la distance de contact de van der Waals sont aussi important que les forces attractives pour la spécificité d interaction. De plus, des molécules non-polaires s agrègent (interactions hydrophobes) dans l eau due à une augmentation d entropie associée aux molécules d eau libérées. Une partie importante de l énergie de liaison d un substrat à une enzyme provient de l association des régions non-polaires du substrat avec ceux du site actif. 122 La chymotrypsine: un exemple d enzyme La chymotrypsine catalyse l hydrolyse de liens peptidiques; elle coupe les liens peptidiques du côté du carbonyle des résidus aromatiques (Trp, Tyr, ou Phe) et elle peut aussi, plus faiblement, faire de même après Leu, Ile et Met (avec une affinité décroissante dans l'ordre cité). Elle peut aussi agir avec une très faible affinité après is. R 1 C R 2 2 R 1 C 3 - R 2 L'enzyme compte trois chaînes polypeptidiques (A, B et C) reliées entre elles par des liens disulfures. Le site d'attache du substrat dans la chymotrypsine consiste en une région ressemblant à une crevasse bordée d'acides aminés hydrophobes. La conformation de cette crevasse permet à ces acides aminés hydrophobes d'interagir avec les chaînes latérales hydrophobes de Trp, Tyr et Phe présentes dans les substrats. Les petites chaînes latérales hydrophobes (comme celle de Val ou de Ala), de même que les chaînes latérales hydrophiles (toutes celles qui sont polaires) ne permettent pas les liaisons non-covalentes nécessaires à la liaison au site actif de l'enzyme. 123

8 Taux de roulement par site actif: 100 molécules/s Facteurs affectant l activité enzymatique 1. Effet de la température Une augmentation de la température: - augmente la vitesse de la réaction chimique - augmente la vitesse de dénaturation de l enzyme (une protéine), diminuant ainsi son activité catalytique La somme de ces deux effets donne une courbe caractéristique de l activité enzymatiquetempérature qui passe par un maximum, montrant ainsi l'existence d'une température optimale. (D après D.J. olme,. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 125

9 2. Effet du p Les enzymes sont très sensibles aux variations du p et fonctionnent bien sur une gamme limitée du p. Effet du p sur l activité de la lactodéshydrogénase p 7.4 Les mesures de nombreuses activités enzymatiques en fonction du p donnent des courbes qui passent par un maximum, montrant ainsi l'existence d'un p optimum. Le p peut agir sur plusieurs facteurs : - l'ionisation des résidus de l enzyme et du substrat et/ou du produit - la structure tertiaire des protéines et donc la stabilité de l'enzyme - la liaison du substrat à l'enzyme - l'activité catalytique de l'enzyme Activité (A) Activité catalytique vs. p (B) Activité mesurée à p 7.4 après incubation de l enzyme pendant 1 h à différents p s p (D après D.J. olme,. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) Effet de la concentration du substrat Pour une quantité fixe d enzyme: - À faible concentration du substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration du substrat. - À des concentrations de substrat élevées, la vitesse de réaction est indépendante de la concentration du substrat et tend vers une valeur constante (vitesse maximale). Le choix de la concentration du substrat est une considération importante dans le développement des essais enzymatiques. (D après D.J. olme,. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 127