Rapport de stage. Des colloïdes Janus aux micronageurs autonomes

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1 Ecole Normale Supérieure de Lyon Département Sciences de la Matière Laboratoire Physique de la Matière Condensée et nanostructures Groupe Liquides aux Interfaces Rapport de stage Avril - Juillet 2006 Des colloïdes Janus aux micronageurs autonomes Stagiaire : Palacci Jérémie, DSM, 4 e année ENS Lyon Maitres de stage : Lydéric Bocquet, Professeur, UCBL Cécile Cottin-Bizonne, Chargée de Recherche, CNRS Laboratoire de la Matière Condensée et Nanostructure ; Université Lyon 1 ; CNRS, UMR 5586 Domaine Scientifique de la Doua, Bâtiment Léon Brillouin 43 Boulevard du 11 novembre 1918, F Villeurbanne cedex France Tel : +(33) (0) Fax : +(33) (0) lpmcn@lpmcn.univ-lyon1.fr

2 Je remercie le Laboratoire de la Matière Condensée et Nanostructures et son directeur J.L. Barrat ainsi que Lydéric Bocquet de m avoir permis de faire ce stage de M2 au sein de l équipe Liquides et Interfaces. Un chaleureux merci à Lydéric pour s être rendu disponible Un grand merci à Cécile, Lydéric et Christophe pour leur gentillesse et leur aide. Cécile, pour son aide permanente, et sa patience à ce qu un jour de mes mains malagiles naissent peut être des trésors d orfèvrerie! Lydéric, pour son encadrement, sa disponibilité, et les explications théoriques quand tout cela me dépassait un peu (!) et sa capacité à rendre la physique amusante. Enfin Christophe, pour son aide et sa bonne humeur, et sans qui la condensation de Bose-Einstein 2D me serait encore totalement inconnue, alors qu aujourd hui à défaut de la comprendre je peux me targuer de la connaître. Je tiens également à remercier Michel et Hervé pour leurs petites mains expertes qui fabriquent et réparent tout! Remerciements chaleureux à mes co-bureaux, Samuel, qui doit malgré tout prendre garde à ne pas devenir autiste, et Benjamin pour sa patience et ses conseils avisés. Puisse t il un jour se souvenir de deux prénoms. Enfin merci à l ensemble des doctorants, des techniciens et des stagiaires du laboratoire pour avoir contribué à la si bonne ambiance du groupe. Voilà, si tous ces remerciements sont sincères, ils n en sont pas moins temporaires, ce n est pas un adieu, mais un à tout de suite. On rempile pour 3 ans, pour mon plus grand plaisir, un grand merci à tous et en route pour l aventure. 1

3 Table des matières 1 Introduction 4 2 Transport aux interfaces Phénomènes d électroosmose et d électrophorèse Vitesse d électro-osmose Vitesse d électrophorèse d un colloïde micrométrique Phénomènes de difusioosmose et diffusiophorèse Vitesse de diffusio-osmose Vitesse de diffusiophorèse d un colloïde micrométrique Mouvement self-phorétique et micronageurs autonomes Micronageurs autonomes : principe et bases théoriques Caractérisation expérimentale et état de l art Caractérisation expérimentale Etat de l art Obtention et Dynamique de Nageurs Autonomes 11 4 Obtention de colloïdes Janus : voie enzymatique Greffage d enzymes sur une Surface Contraintes sur l enzyme à greffer en surface Choix de l enzyme : l Horseradish Peroxydase (HRP) Greffage d une enzyme sur une surface Greffage par adsorption Greffage covalent à l aide de linker Protocoles Expérimentaux de greffage de la HRP Protocole expérimental pour le Greffage Covalent de la HRP Test à l ABTS Protocole expérimental pour l adsorption de la HRP Résultats expérimentaux En adsorption En greffage covalent Conclusion sur l obtention de Janus par voie enzymatique Obtention de colloïdes Janus : voie chimique Choix du catalyseur solide : la Zeolite ZSM La Zéolite [1] La zéolite ZSM5 acide La réaction catalysée : estérification de l éthanol par l acide acétique Protocole de test des ZSM5 et résultats expérimentaux Vérification de l activité catalytique des ZSM5 en conditions douces pour l estérification de l ethanol avec l acide acétique Fabrication de ZSM5 Janus et vérification de leur résistance à la sonication Etude de la dynamique des micronageurs Janus Suivi de ZSM5 et détermination du coefficient de diffusion Résultats expérimentaux Interprétation Conclusion 27 Bibliographie 27 2

4 A La double couche électrique 30 B Vitesse de diffusio-osmose. Notations et calculs développés. 32 C Obtention d un gradient linéaire statique de concentration et dynamique diffusiophorétique de colloïdes 34 C.1 Principe du système à 3 canaux en gel C.2 Réalisation expérimentale C.3 Résultats expérimentaux D Analyse X d un échantillon de ZSM5 Janus, couche de 124 nm or 38 E Confinement des colloïdes et diffusion 2D 39 F Etude de la dynamique des micronageurs Janus : protocole expérimental 41 3

5 1 Introduction Avec le désir de miniaturisation galopant s est développée la microfluidique, c est à dire la mise en place de canaux microniques permettant un contrôle des écoulements à ces échelles [2] et la recherche de micromoteurs. Cette mise à l échelle des écoulements pose cependant un certain nombre de problèmes pratiques et théoriques majeurs : la résistance hydrodynamique explose avec la réduction des échelles ; la transformation de l énergie basée sur des systèmes conventionnels (moteur-réservoir) est très défavorable ; la capacité de mélange de macromolécules par mécanisme diffusif (colloïdes micrométriques par exemple) est drastiquement réduite en microcanaux puisque la longueur caractéristique de mélange de 2 solutés est l = h 2 U/D [3], où h est la largeur du canal, U la vitesse du fluide dans ce dernier, et D le coefficient de diffusion de l espèce considéré. Avec des colloïdes micrométriques, cette longueur de mélange atteint usuellement 1m en microcanaux, ce qui rend tout mélange impossible à réaliser en pratique à ces échelles... Si par conséquent une mise à l échelle des méthodes macroscopiques s avère inefficace pour mettre en mouvement des macromolécules micrométriques, un certain nombre de nouveaux phénomènes deviennent cruciaux grâce à l importance des effets surfaciques sur les effets de volume à ces échelles. L enjeu de ce stage est donc de créer du mouvement en utilisant les phénomènes de surface qui deviennent prédominants avec l accroissement du ratio S/V aux petits échelles (S étant la surface et V le volume). Ces mécanismes prennent leur source dans l interaction soluté-surface qui est différente de l interaction soluté-solvant. Il s agit des mécanismes osmotiques (lorsque le fluide est en mouvement par rapport à une surface fixe), ou phorétiques (à l inverse la surface d une macromolécule est en mouvement dans le fluide) trouvant leur source dans l application d un gradient macroscopique [4]. L origine de ces gradients peuvent être multiples : gradient de potentiel lorsqu est appliqué un champ électrique (on parle alors d électro-osmose/phorèse) ou gradient de concentration en différentes espèces (diffusio-osmose/phorèse)... Dans le cadre de ce stage, nous nous sommes concentrés sur les aspects diffusio qui sont relativement méconnus. Comme on le verra dans la partie 2.2, l application d un gradient de concentration interfacial génère une vitesse, et le transport interfacial un mouvement macroscopique. Dans le cadre de ce travail, les gradients de concentration interfaciaux seront obtenus à l aide de réactions chimiques. Au delà de la compréhension des mécanismes phorétiques et osmotiques, encore méconnus et peu étudiés aujourd hui, le développement de micronageurs passifs qui utilisent des moteurs surfaciques pour se déplacer pourrait éclairer la dynamique de systèmes actifs biologiques encore mal compris aujourd hui : motilité cellulaire, chemotaxis [5, 6]... Deux voies sont alors à explorer : l étude du phénomène de diffusio-phorèse qui constitue en soi un sujet de recherche puisque le sujet est encore largement méconnu ; l obtention de micronageurs en appliquant ces mécanismes interfaciaux au développement de micromoteurs surfaciques Après avoir présenté ces mécanismes, nous chercherons à leur apporter des preuves expérimentales à l aide de deux systèmes développés lors du stage : un système tri-canal en gel qui aura pour but d étudier la diffusiophorèse de colloïdes micrométriques. N ayant eu le temps de caractériser expérimentalement cette axe de travail, puisqu aucune mesure expérimentale n a encore été faite, la description de ce système expérimental, son principe et les difficultés expérimentales posées ont été mis en annexe des colloïdes Janus, c est à a dire traités différemment sur les deux moitiés dont on va voir qu un comportement de micronageurs autonomes est attendu [7]. Les résultats, partiels, et les difficultés expérimentales rencontrées seront données au fur et à mesure du rapport. 4

6 2 Transport aux interfaces Il s agit de créer à l aide d une modification de la surface un gradient qui conduira à une vitesse interfaciale (et qui servira de conditions aux limites hydrodynamiques) et à un transport à l interface. Rappelons rapidement pour éviter tout confusion dans la suite que l on parle de déplacement phorétique lorsqu une particule est en mouvement par rapport au fluide et d osmose lorsque le fluide est en mouvement par rapport à une paroi fixe. Nous commencerons par traiter qualitativement le cas de la vitesse d électro-osmose (EO) afin de nous forger une intuition des phénomènes à la base des mouvements de type phorétiques ou osmotiques. Les résultats seront alors étendus au cas de diffusioosmose, et diffusiophorèse au coeur de mon stage. Les calculs développés de ces derniers phénomènes sont donnés en annexe. 2.1 Phénomènes d électroosmose et d électrophorèse Fig. 2.1 Vitesse d électroosmose. κ est l inverse de la longueur de Debye. La surface est ici chargée négativement. Ceci provoque la formation d une double couche contre ions-ions, qui écrante l intéraction electrostatique. Cette inhomogénéité spatiale provoque un transport interfacial sous l effet de l application d un champ électrique sur ce milieu neutre mais déformable. Ceci conduit à une condition aux limites non nulle à l interface. Considérons un fluide, supposé incompressible et de viscosité η en volume, qui occupe le demi-espace y > 0 au-dessus d une surface plane placée en y = 0 fixe dans le référentiel considéré. La surface est plane est spontanément chargée et possède un potentiel de surface V 0 qui provoque un arrangement des ions à son contact en double couche, afin de minimiser l énergie d interaction d épaisseur de l ordre de la longueur de Debye λ d = κ 1 (voir annexe A, [8]) Vitesse d électro-osmose Le fluide étant neutre, la densité volumique de charge est telle que { = 0 si y λd ρ e = 0 si y < λ d Appliquons maintenant un champ électrique extérieur macroscopique E, il va exercer une force volumique F = ρ e E seulement dans la double couche électrique et mettra cette dernière en mouvement à la vitesse v EO (qui d un point de vue macroscopique pourra apparaître comme la condition limite de glissement pertinente pour décrire le problème). La longueur de Debye étant très faible devant les dimensions macroscopiques, on peut assimiler cette force volumique à une contrainte surfacique σ E/surf ρ e λ d E. L équation de Maxwell-Gauss donne ρ e V 0 2. λ d Le profil de vitesse étant plat à l extérieur de la double couche électrique, à la vitesse v EO, et la vitesse étant nulle à la paroi (condition de non glissement), on a un cisaillement du fluide sur une épaisseur λ d, et donc une contrainte visqueuse σ visq ηv EO λ d. 5

7 A l équilibre la contrainte due au champ électrique et la contrainte visqueuse s équilibrent, on en déduit σ visq = ηv EO = σ λ E/surf d v EO = ɛv 0E η Ce dernier résultat est à comparer au résultat de Schmoluchovski v EO = ɛζe η [8] où ζ est le potentiel zeta de la surface. On retrouve donc qualitativement ce résultat et il apparaît ici clairement comment l intéraction du soluté avec la surface solide va lui permettre de mettre en mouvement le fluide à la vitesse v EO sous l effet d un gradient de potentiel électrique, on parle alors d électro-osmose. Avec E 1 v/cm, et un potentiel ζ 25mV, on obtient dans l eau des vitesse de l ordre du micromètre par seconde Vitesse d électrophorèse d un colloïde micrométrique En considérant que la surface est celle d un colloïde, le raisonnement précédent permet de déterminer la vitesse d électro-phorèse (EP) en l application d un champ électrique extérieur. La surface plane considérée est alors la surface de particules, par exemple des colloïdes micrométriques semés dans le fluide, ce dernier étant alors considéré au repos dans le référentiel d étude. Les colloïdes se déplaceront alors dans le fluide pour les mêmes raisons que l on vient de voir mais avec la vitesse d électrophorèse V EP = V EO. On peut noter que ces phénomènes osmotiques et phorétiques prennent leur essence même dans l existence de surfaces et d interface puisque leur origine réside entre une interaction différente entre des espèces du fluide (ici double couche électrique) et la surface et ces mêmes espèces dans leur solvant en volume. 2.2 Phénomènes de difusioosmose et diffusiophorèse L origine du mouvement est ici l existence d un gradient de concentration à la surface. Ce dernier peut induire le mouvement du fluide par rapport à la surface (diffusioosmose) ou au contraire le déplacement d une particule solide, colloïdale par exemple, dans un fluide au repos (diffusiophorèse). La possibilité qu un gradient de concentration puisse provoquer un mouvement n est pas quelque chose de tout à fait intuitive a priori Vitesse de diffusio-osmose En effet, un raisonnement hâtif serait de dire que puisque la pression osmotique est liée à la concentration d une espèce par P osmo = k B T C(x, z), un gradient de concentration selon x conduira à un gradient de pression osmotique, i.e une force osmotique et donc un mouvement dans la direction parallèle à la plaque. Ce genre de mécanisme n est absolument pas surface-dépendant et ne requérait pas de réduction des échelles. Cependant cette force osmotique ne peut rien déplacer en volume puisqu elle est liée à la pression (mécanique) du fluide, et contrebalancée par cette dernière pour aboutir à l équilibre mécanique et donc l absence de mouvement : Fig. 2.2 Vitesse de diffusio-osmose. p(x, z) k B T c(x, z) = p 0 k B T c 0 (x) où p 0 est la pression dans le liquide loin de la paroi, c 0, la concentration volumique dans le fluide. Le soluté et la surface intéragissent au travers d un potentiel U(x, z) : potentiel de Van der Waals, ou 6

8 potentiel électrostatique écranté par les ions du milieu. Ce potentiel est à courte portée et ce n est que près de la paroi, là où l interaction de la surface avec le soluté n est pas négligeable que la distribution spatiale de ce dernier est non uniforme et la pression osmotique non équilibrée. Avec des conditions aux limites de non glissement et de contrainte nulle à la paroi, on obtient la vitesse du fluide, vitesse de diffusio-osmose : v DO = k BT η ΓLdc 0 dx avec Γ une longueur qui mesure l excès de soluté à proximité de la paroi et L une longueur qui mesure la portée de l interaction du potentiel. Ces deux longueurs sont de nature microscopique ( du nanomètre à un micron suivant les cas)puisque le potentiel d interaction surface-soluté est à courte portée. On définit la mobilité osmotique du couple soluté-surface comme étant le coefficient de proportionnalité entre la vitesse et la force (force généralisée) qui provoque cette vitesse. Le moteur étant ici l application d un gradient de concentration, la mobilité osmotique est µ = k BT η Le développement des calculs et les précisions de notations sont données dans l annexe B. Dans le cas d un soluté chargé et dans le cadre de l approximation de Gouy-Chapman (voir annexe B), les longueurs d excès et de portée de l interaction sont calculables exactement et de l ordre de longueur de la longueur de Debye λ d. On obtient alors avec l B = (8πλ 2 D c 0) 1 la longueur de Bjerrum (voir A.6) : ΓL (2.1) v DO = k BT 8πηl B ln(c 0 ) = D DO ln(c 0 ) (2.2) Il apparaît donc un coefficient de diffusion effectif comme moteur de la diffusion-osmose indépendant de la taille du colloïde et qui donc devrait résister à une miniaturisation. Cette robustesse à la mise aux petites échelles est caractéristique de ces phénomènes. Supposons que l on ait un gradient de concentration linéaire selon la direction x d un soluté à 10 2 mol.l 1 dans un canal de largeur h = 200 µm, connaissant la viscosité de l eau η = 10 3 Pa.s, la longueur de Bjerrum l B et la température T = 300 K on peut donner un ordre de grandeur de la vitesse de diffusio-osmose v s 1, 2 µm.s 1 dans le sens opposé du gradient de concentration. Notons au passage que D DO 2, m 2.s 1 correspond au coefficient de diffusion d une particule de diamètre 1,9 nm. Dans le cas d un ion et d un contre ion de coefficients de diffusion différents, et avec un potentiel d interaction plus compliquée avec la surface, la vitesse de diffusio-osmose reste formellement analogue à l expression B.7 mais avec un coefficient de diffusion effectif D DO d expression nettement plus complexe (voir équation B.8) mais du même ordre de grandeur Vitesse de diffusiophorèse d un colloïde micrométrique En considérant que la surface est celle d un colloïde, le raisonnement précédent permet de déterminer la vitesse de diffusio-phorèse (DP) due à un gradient de concentration d une espèce. La surface plane considérée est alors la surface de particules, par exemple des colloïdes micrométriques semés dans le fluide, ce dernier étant alors considéré au repos dans le référentiel d étude. Les colloïdes se déplaceront alors dans le fluide pour les mêmes raisons que l on vient de voir mais avec la vitesse de diffusiophorèse V DP = V DO. On peut montrer que si l on met des colloïdes micrométriques dans une solution présentant un gradient de soluté s, ils présenteront, du fait de leur vitesse de diffusiophorèse, un mouvement diffusif avec un coefficient de diffusion effectif D eff D2 DP D s 7 D s

9 X Fig. 2.3 Canal présentant un gradient de concentration selon la direction X. Les traits noirs latéraux sont les bords du canal. Le gris symbolise la solution contenant des sels. Des colloïdes fluorescents sont ensemencés dans cette solutions saline. Leur diffusion, mesurée par le déplacement de l interface en microscope de fluorescence, est remorquée par la diffusion des sels et donc fortement amplifiée où D s est le coefficient de diffusion à l équilibre du soluté (donné par la loi de Stokes-Einstein) et D DP, le coefficient de diffusion effectif donné par l équation B.7 et dû à la DP. En effet, C s C s /l où l D s t. La diffusion des colloïdes peut être mesurée en utilisant des colloïdes fluorescents et en mesurant le déplacement de l interface place selon X en fonction du temps. On a alors d après ce qui précdède, en notant X la position de l interface (voir figure 2.3) dx dt = D DP logc s D DP 1 Ds t Une intégration donne immédiatement X D DP Ds t, et le déplacement quadratique moyen donne un mouvement diffusif avec le coefficient de diffusion D eff précédent. On voit immédiatement que l on obtient une amplification très importante du coefficient de diffusion grâce à ce mécanisme car des particules micrométriques diffuseront aussi efficacement que des particules de 1.2 nm. La dynamique des macromolécules est amplifiée par le rôle de remorqueur du soluté très mobile. Le gain est de l ordre de 1000 et a bien entendu un grand intérêt pratique aux échelles microfluidiques améliorant considérablement la dynamique de mélange aux petits échelles. 8

10 3 Mouvement self-phorétique et micronageurs autonomes. 3.1 Micronageurs autonomes : principe et bases théoriques Nous considérons ici le mouvement d origine self-électrophorétique de colloïdes micrométriques dit «micronageurs» : le colloïde créera grâce à une réaction chimique à sa surface un gradient d une grandeur intensive dans le fluide à son voisinage (température, concentration d un soluté ou autre). L aptitude de cette réaction a créer un gradient et à modifier le milieu à son contact sera quantifié par son coefficient d activité surfacique α. Par exemple, dans le cas de diffusiophorèse, ce coefficient d activité surfacique est la vitesse de réaction par unité de surface du colloïde permise par la réaction chimique à son contact De plus pour que le micronageur ne se retrouve pas à «court de carburant»lors de son mouvement, il faut que l activité surfacique du colloïde soit due à l interaction avec le milieu extérieur mais ne consomme pas de ressources présentes sur celui ci : une réaction catalysée pour laquelle le catalyseur est sur le colloïde et les réactifs dans le milieu de déplacement est par exemple tout à fait adaptée. Il en résulte (voir chapître 2) que le colloïde sous l effet d un mécanisme phorétique acquiert une vitesse phorétique donnée pour essentielle dans l observation expérimentale de mouvement autonome d objets sièges de réaction catalysée (self diffusiophorèse) [9] ou de mouvement de fluide près d une surface présentant une activité catalytique (self diffusioosmose)[10]. Golestanian et al [11] ont montré que dans le cas d un mouvement d origine diffusiophorétique, la vitesse du micronageur est v DP αµ/d où α est le coefficient d activité surfacique (création ou consommation de soluté), µ la mobilité phorétique (définie et égale à la mobilité osmotique de surface, définie comme la réponse en vitesse suite à l application d un gradient de concentration, µ = k BT η ΓL, positive ou négative suivant le détail des interactions soluté-surface (α et µ sont tous deux a priori des grandeurs locales) et D le coefficient de diffusion d équilibre du soluté. Il apparaît de plus sur ce résultat un point très intéressant : à géométrie et pattern donnés, la vitesse de self diffusiophorèse est indépendante de la taille R du micronageur. A la différence des forces volumiques (diélectrophorèse...) qui donnent des vitesses R 2, ce résultat confère au phénomène une grande robustesse à la miniaturisation. Les auteurs ont étudié le cas d un colloïde sphérique Janus (voir figure 3.1) c est à dire vérifiant les conditions suivantes : { (α+ ; µ + ) si 0 < θ < π 2 (α(θ); µ(θ)) = (α ; µ ) si π 2 < θ < π où θ est la latitude déterminée par rapport à e z. La solution analytique est V SDP = 1 8D (α + α )(µ + + µ )e z Fig. 3.1 Colloïde sphérique de type Janus : les 2 moitiés de la sphère ont une activité surfacique opposées : un hémisphère crée une espèce que l autre hémisphère consomme. En revanche la mobilité surfaciques µ est uniforme sur la sphère. Les flèches pointillées correspondent au flux de c (opposé au gradient de concentration), les flèches blanches la vitesse de glissement correspondante du fluide sur la sphère. La flèche en gras noir est opposée à ce glissement et donne la direction de la vitesse résultante de la sphère dans le fluide. On voit qu une brisure de symétrie de l activité chimique en surface α + α est indispensable au mouvement du micronageur. Cela suggère que l on peut créer des micronageurs self-phorétiques à l aide d une anisotropie d activité surfacique, chimique, de surface. Cette dernière pouvant être créée par une anisotropie de la réaction chimique à la surface du colloïde par exemple obtenue par un patterning de la surface du colloïde avec une espèce chimiquement réagissante. 9

11 3.2 Caractérisation expérimentale et état de l art Caractérisation expérimentale D après les résultats de [11], on pourrait penser qu en cas de succès, des micronageurs Janus se déplaceront en ligne droite avec la vitesse de self diffusiophorèse V SDP et qu une observation au microscope de ces colloïdes permettra de voir si certains d entre eux ont un mouvement directionnel ou non. En fait ce n est pas le cas car ces sphères Janus sont également soumises en plus de leur diffusion translationnelle (D trans k B T/ηR) à de la diffusion rotationnelle D rot k B T/ηR 3 où R est le rayon de la sphère Janus. A la condition que le champ de concentration relaxe plus rapidement que la temps typique de rotation (R 2 /D << 1/D rot où D est le coefficient de diffusion du soluté créé ou consommé par le micronageur), les changements de direction aléatoire des faces Janus couplée au mouvement de self diffusiophorèse renforce la diffusion translationnelle du colloïde : D eff = D trans + 1 6D rot V 2 SDP (3.1) Cette augmentation du coefficient de diffusion devrait être mesurable pour des vitesse de quelques µm/s avec des Janus micrométriques. Dans le cadre de ce stage, c est la mesure et la comparaison des coefficients de diffusion statistiques de 2 populations distinctes l une non Janus, l autre Janus qui nous permettra de dire si nous avons réussi à mesurer de la self diffusiophorèse et à provoquer le mouvement autonome de micronageurs. Un autre point important est à souligner : ce renforcement du coefficient de diffusion fait intervenir l activité chimique surfacique de la particule. Il est donc majeur que celle ci soit la plus grande possible, nous garderons cela à l esprit au moment de la recherche de bons candidats pour être ces micronageurs Etat de l art Pour l instant les dispositifs expérimentaux de micronageurs sont peu nombreux [12], [13]. De plus, pour l intégralité des micronageurs existant jusqu à alors, l activité chimique est due à un dépôt de platine qui catalyse la dismutation de l eau oxygénée. Si cette réaction redox a l avantage de la simplicité et de la robustesse, elle présente l important défaut de dégager du gaz (O 2 et H 2 ). Il est bien évident que cela peut rentrer en compétition avec la self diffusiophorèse et rend l interprétation du mouvement particulièrement discutable. Néammoins, ces systèmes ont présenté une dynamique particulière avec une vitesse interprétée comme electroosmotique de quelques micromètres par seconde. Nous allons d autres voies catalytiques permettant développer des particules Janus catalysant des réactions ne dégageant pas de gaz. Nous venons de voir comment les phénomènes aux interfaces peuvent avoir d importantes conséquences sur le mouvement de particules micrométriques. Nous allons lors de ce stage chercher à y apporter des preuves expérimentales grâce à l étude de deux systèmes : Un système tri-canal en gel qui aura pour but d étudier la diffusiophorèse de colloïdes micrométriques mis dans un gradient de soluté et de déterminer par la mesure du coefficient de diffusion si la DP a bien lieu et si elle conduit bien à la mesure d un coefficient de diffusion effectif très supérieur à celui d équilibre. Des colloïdes Janus, c est à a dire traités différemment sur les deux moitiés dont on va voir qu un comportement de micronageur autonome est attendu. L étude de ces deux systèmes a comporté un grand nombre de difficultés expérimentales, et le premier système n a pour l instant abouti a aucune mesure expérimentale concrète : le système est fabriqué mais un défaut de conception nous interdit de le connecter au milieu extérieur pour l instant. L étude du système tri-canal (principe, conception et difficultés expérimentales) a donc été mise en annexe. Néammoins, l approfondissement de cette piste reste une étude d un intérêt majeur qui devra être conduite par la suite lors de ma thèse. 10

12 Obtention et Dynamique de Nageurs Autonomes Comme nous l avons vu dans la partie 3, il est nécessaire à l obtention de micronageurs autonomes de fabriquer des colloïdes micrométriques Janus ie dissymétriques et dont l une des faces est le siège d une réaction qui produira un gradient thermique si la réaction n est pas athermique, de concentration si le courant total diffusif n est pas nul... De plus, les micronageurs étant autonomes, ils ne sauraient transporter avec eux le carburant nécessaire à leur déplacement et les réactions à la surface doivent donc être catalytiques et avec la dissymétrie liée à la présence ou non à la surface du catalyseur. Comme nous l avons vu précédemment, cette anisotropie du coefficient d activité surfacique peut être obtenue par une anisotropie de la réaction chimique. Cette anisotropie peut être obtenue en formant des particules Janus, c est à dire avec une hémisphère catalysant une réaction chimique α + 0 et l autre hémisphère dont l autre face ne présente aucune activité chimique α = 0. Deux voies afin d obtenir de telles particules Janus ont été explorées lors de ce stage : 1. Voie enzymatique : les catalyseurs sont des enzymes, ils doivent être fixés de manière sélective sur une moitié de la microparticule. 2. Voie chimique : on utilise alors des catalyseurs solides, servant habituellement en catalyse hétérogène chimique. Il est alors nécessaire d annuler leur activité catalytique sur une de leurs faces. 11

13 4 Obtention de colloïdes Janus : voie enzymatique Afin d obtenir des particules Janus, j ai tout d abord considéré une voie enzymatique en rendant réactivement active une moitié de la surface de colloïdes commerciaux. Pour cela, nous désirons greffer de manière sélective des enzymes, macro-protéines, de poids supérieur à la dizaine de kg/mol, et dont le rôle est de catalyser des réactions biologiques, à leurs surfaces. Toutefois avant de penser greffer des enzymes sur une moitié seulement de colloïdes micrométriques, il était nécessaire de s assurer que la fixation était bien spatialement spécifique. Nous avons donc travaillé dans un premier temps sur des surfaces planes de verre de quelques centimètres (lamelles epaisses de biologistes), de différents matériaux (verre ou silicium), traitées ou non et avec différents enzymes, ceci afin de tester plus facilement le protocole avant de le mettre à l échelle microscopique et d épaisseur de traiter différemment les deux hémisphères de colloïdes micrométriques. 4.1 Greffage d enzymes sur une Surface Deux solutions sont envisageables afin de fixer des enzymes sur une surface : soit de l adsorption, soit un greffage covalent Contraintes sur l enzyme à greffer en surface Il nous faut dans un premier temps choisir une enzyme à greffer sur nos surfaces que ce soit covalemment ou par adsorption. Elle devra respecter un certain nombre de contraintes, particulières, parfois saugrenues du point de vue des biologistes : 1. Elle devra si possible être peu coûteuse et bien documentée dans la littérature. 2. Elle devra pouvoir se fixer de manière spécifique sur certaines surfaces. 3. Elle devra former sur cette surface une monocouche contrôlée en densité et stable dans le temps. 4. Elle devra former une monocouche dense, et enzymatiquement très active. En effet, d après 3, la vitesse de déplacement des Janus est proportionnelle au coefficient d activité enzymatique α. Ce dernier est homogène à des m 2 s 1 c est à dire σk où σ est la densité surfacique de greffage de l enzyme sur la surface (en m 2 ) et k la constante de réaction (en s 1 ). 5. Elle devra résister à la sonication, c est à dire une agitation dans un bain à ultrasons. Ceci est un point rarement abordé par les biologistes et dans la littérature. Ce point est d importance majeure pour la suite de notre point de vue car suite à la synthèse des particules Janus, il y a des risques qu elles coagulent si elles sont légèrement solvophobes (ce qui est le cas des protéines qui sont hydrophobes) lors du stockage. Il faudra par conséquent soniquer les solutions contenant les colloïdes Janus pour les disperser juste avant expérimentation afin de mesurer le coefficient de diffusion d un Janus et non un coefficient biaisé d un agglomérat de Janus Cette agitation avec ultrasons, en apportant de l énergie aux enzymes, leur permet d explorer de nouvelles conformations spatiales, et donc de modifier la géométrie de leur chaîne. L activité enzymatique ayant pour base la complémentarité clé-serrure, ces changements conformationnels conduisent à une perte d activité enzymatique, partielle ou totale. La sonication peut donc être analogue à une dénaturation thermique des enzymes. Il faudra donc manier avec parcimonie la sonication avec ces particules Janus-enzymatiques, et essayer de trouver une enzyme résistante de ce point de vue là aussi. Ce point est sans doute le plus mal documenté dans la littérature car il est très peu exploré par les biologistes et devra être testé par nos propres soins. 6. Elle devra évidemment être stable dans le temps : pas de dénaturation thermique à l ambiante trop rapide, pas de sensibilité exacerbée au milieu extérieur, ou de besoin impérieux de milieu stérile. 12

14 7. La réaction catalysée ne devra pas avoir pour produit une espèce gazeuse, car si tel était le cas on se retrouverait avec un système analogue à celui de Paxton et al [12], [9] générateur de bulles lors de son déplacement, ce qui rend le déplacement des micronageurs relativement discutable. 8. Enfin, elle devra catalyser au moins une réaction conduisant à des produits colorés ou fluorescents afin que l on puisse trancher sur la spécificité spatiale de la réaction Choix de l enzyme : l Horseradish Peroxydase (HRP) Dans le cadre de ce stage, afin de remplir au maximum les contraintes ci dessus, nous avons décidé de travailler avec l enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) (P6782, Sigma) 1. Peu coûteuse et très bien documentée dans la littérature, cette enzyme, en présence de péroxyde d hydrogène H 2 O 2, oxyde un très grand nombre de substances pouvant céder un proton H + selon la réaction 4.2. Il s agit d une monochaîne polypeptidique de glycoprotéine présentant quatre ponts disulfide et constituée à 18% de carbohydrate (galactose, arabinose, xylose, fructose, fucose, mannosamine et galactosamine) [14]. Son poids moléculaire est de 44kDa [15], dont le ph optimal d activité est de 6 à 6.5 mais qui conserve 84% de son activité à ph 7.5 [16]. 2. De plus, il s agit d une petite enzyme : son poids moléculaire est faible et ses dimensions sont celles d un parallèlépidèque rectangle de 4.0 nm x 6.7 nm x 11.7 nm de rayon de giration de 2.65 nm [17]. Ceci facilitera une bonne densité de greffage. Des mesures ellipsométriques et d AFM [17] montrent que la densité à saturation de la monocouche «quasi dense»de HRP adsorbée sur du silicium est de Γ = molécules/cm 2, soit une aire par enzyme de 2.93 nm 2 en accord avec d autres résultats expérimentaux disant que les HRP se mettent sur leur «petit coté», c est à dire la face de 4 nm x 6.7 nm adsorbée sur le substrat. Ces mesures permettent de mesurer la présence ou non des enzymes mais ne permet pas de déterminer si elles sont enzymatiquement actives ou non. Des mesures complémentaires pour déterminer les taux d activité et les vitesses de réactivité conduites à l air de spectrophotomètre UV-visible ont conclu que 78% des HRP en surface sont actives (par greffage covalent) [18]. D autres auteurs ont conclu que la HRP adsorbée en surface perd 50% de son activité enzymatique [17] ou jusqu à 93% [19], ceci dû aux réorganisations spatiales de sa chaîne dues à la proximité du substrat. 3. La vitesse de réaction pour cette enzyme est k cat = 4658 µmol min 1 µmol 1 enzyme [20] soit avec la densité surfacique précédemment citée, et en considérant que 25% des enzymes seulement sont actifs, cela revient à 80 réactions par enzyme actif et par seconde. Sera-ce suffisant pour la suite, nous le verrons. 4. Elle a l avantage de bien résister à la sonication [21]. 5. De plus, cette enzyme se trouve être assez pérenne puisque 81.5% de HRP adsorbée est encore active après 45 jours [18]. 6. On pourrait craindre la dismutation de l eau oxygénée en présence de HRP mais celle ci n est pas observée [22], et il n y pas à craindre les dégagements de O 2 et H 2 vus par Paxton avec la dismutation de l eau oxygénée sur platine. 7. Enfin, il existe un grand nombre de réactifs commerciaux dont le produit de la réaction avec l eau oxygénée en présence de HRP est dans le visible ou l UV. Nous avons travaillé avec de 2,2 -AZINO-BIS(3-ETHYLBENZTHIAZOLINE-6-SULFONIC ACID) (ABTS, A1888, Sigma) qui présente une bonne sensibilité de test ainsi qu un changement de couleur de l incolore au vert. L autre raison du choix de ce réactif est son utilisation dans [17] pour des tests qualitatifs de présence de HRP à la surface de wafer de silicium et analogues à ceux que nous voulons réaliser, c est à dire vérifier la présence d enzyme à la surface du substrat patterné. De plus, avec le réactif ABTS il n y a pas de dégagement gazeux. Il y a cependant quelques inconvénients à utiliser la HRP auxquels il faudra prendre garde lors de son utilisation : la HRP etant à la base du système de défense de nombreux organismes : elle oxyde en présence d H 2 O 2 les organismes ennemis, elle doit être manipulée préférentiellement en milieu relativement stérile sinon elle peut être lysée par les bactéries du milieu. De plus, elle catalyse la réaction d oxydation par de l eau oxygénée mais peut être empoisonnée par des quantités trop 13

15 (a) (b) Fig. 4.2 (a) Réaction générale d oxydation de l espèce AH 2 par l eau oxygénée en présence de HRP. (b) Chaîne peptidique à la base de l activité catalytique de la HRP importantes de cette dernière. La vitesse de réaction augmente linéairement avec la concentration en H 2 O 2 (cinétique de réaction d ordre partiel 1 pour l eau oxygénée) pour des concentrations appartenant à [1µM; 54µM] mais empoisonnement et inactivation de la HRP pour les conditions suivantes sont observées [H 2 O 2 ] > 0.5mM ou que [H 2O 2 ] [AH] > 1.3 [19]. 4.2 Greffage d une enzyme sur une surface Greffage par adsorption Il existe quelques règles empiriques à l adsorption d enzymes sur une surface même si elles doivent être maniées avec précaution : les protéines sont plutôt hydrophobes, elles se lieront donc préférentiellement à ce type de surfaces. Néammoins, en s adsorbant sur le support, elles se déforment et peuvent donc modifier la géométrie de leur chaîne. Leur activité enzymatique étant basée sur le principe «clé-serrure», il apparaît qu il y aura un compromis à trouver entre une adsorption efficace et une inactivation trop importante des enzymes. De plus, les protéines étant amphipiles, chargées (de manière non triviale), et déformables, de même que les surfaces peuvent être plus en moins chargées en fonction du ph et de la concentration du sel, il faut bien être conscient que toute prédiction a priori est discutable et ne saurait se soustraire à une vérification et un contrôle expérimentaux. L adsorption permet de greffer des enzymes de manière très simple mais possède tout de même quelques défauts majeurs : elle est assez difficilement contrôlée, il sera en effet difficile de fixer sélectivement sur une face ou une certaine zone, parce que les enzymes ont tendance à s adsorber partout : ayant une chaîne protéique extrèmement longue, elles possèdent un très grand nombre de sites de reconnaissance de géométrie différents et il est très difficile qu aucun d entre eux n ait une affinité particulière avec le substrat. Le greffage par adsorption d enzymes sur une surface bien que largement connu des biologistes reste un problème difficile et délicat Greffage covalent à l aide de linker Le greffage covalent permet un lien assez fort entre la protéine arrimée et le substrat grâce à une molécule intermédiaire. Il est basé sur l affinité des thiols (R-SH) avec l or : si l on met en contact une solution 1 mm de thiols sur de l or, ou du verre recouvert d une couche de quelques dizaines de nm d or (Au [1 ;1 ;1] qui se forme spontanément suite à l évaporation d une électrode d or sur du verre), il se forme spontanément après quelques heures une Monocouche Auto Assemblée de thiols (SAM, Self Assembled Monolayer), dense et régulière dont la fonction S-H s est fixé covalemment dans la couche d or avec une liaison d environ 30 kcal/mol [23]. Si l on prend maintenant une solution millimolaire d amino-alcanethiol NH 2 -R-SH (où R est une chaîne d alcanes), une SAM se développera 14

16 également laissant un tapis dense (Γ molécules/cm 2 [23]) de fonctions aminées à la surface de notre surface d or. A l aide d un «cross-linker», il reste alors à faire la jonction entre l enzyme qui possède un grand nombre de fonctions aminées NH 2 et le tapis de fonction amine de la SAM. Ce «cross-linker»doit de plus être suffisamment grand, rôle de «spacer», pour que la protéine puisse s y fixer sans être gênée par la surface d or (gène stérique) ou s y adsorber (intéractions de Van der Waals ou électrostatiques). L amino-thiol utilisé est la cystéamine hydrochoride (30078, Fluka) (voir formule développée 4.3). La tête NH 2 affleure alors à la surface, il reste à la greffer à l enzyme à l aide d un spacer. Nous avons utilisé comme spacer la carboxymethylamilose HCOO-R-COOH (CMA, C4947, Sigma, formule déposée) comme dans le protocole Biacore [24]. La CMA est tout d abord activée à l aide d EDC et NHS, puis mise au contact de la plaque d or greffée de cystamine. Il y a alors linkage comme on peut le voir sur le schéma 4.4, avec 1 la chaîne alkyle de la CMA et 2= SH-CH 2 -CH 2 de la cystéamine. La même étape est ensuite reproduite avec une autre fonction COOH de la CMA et une fonction NH 2 de l enzyme HRP. La résistance des SAM et de ce linkage à la sonication Fig. 4.3 Formule développée de la cystéamine Fig. 4.4 Schéma bilan du protocole de greffage covalent par activation et cross-linking de CMA-NHS étant non traitée par la littérature, il nous faudra vérifier. Le but était alors de faire des «pattern»d or sur des surfaces de verre, de greffer sur ces patterns l enzyme et de le mettre en contact d un réactif test, du type test «ELISA», qui doit changer de couleur lorsqu il donne son produit. 4.3 Protocoles Expérimentaux de greffage de la HRP Protocole expérimental pour le Greffage Covalent de la HRP Une surface de verre est soniquée dans l isopropanol (Sigma) 15 min à 2 reprises puis séchée à l azote. Elle est alors recouverte dans un évaporateur d une couche d adhésion de 5 nm de chrome, et de 30nm d or selon un pattern, réalisé par ombrage, de lignes alternativement or et verre. La plaque est alors mise dans une solution de cystéamine millimolaire pendant quelques heures (3 à 12 heures selon les expériences) [23]. La SAM se constitue en deux temps : en quelques minutes elle est constituée puis il lui faut quelques heures (régime diffusif) pour s homogénéiser et réduire ses défauts. La plaque est alors abondamment rincée à l aide de tampon PBS (ph 7.4, Fluka), puis stockée dans ce tampon si nécessaire. On active alors la CMA (1ml 10 mg/ml) par 1 ml de EDC 0.4 M, et 1 ml de NHS (0.1M) (protocole biacore [24]). L activation est faite pendant 1 minute puis le mélange est versé sur la plaque pendant 15

17 une dizaine de minutes. La plaque est alors abondamment rincée au tampon PBS puis réactivée de la même manière. Une solution de HRP 50µg/ml dans du tampon PBS (Ph=7.4, pour lequel l enzyme présente plus de 80% de son activité enzymatique optimale) à laquelle est ajoutée 10 µl de H 2 O 2 à 35% (Fluka) est mis en contact de la plaque pendant quelques heures. La plaque est de nouveau abondamment rincée au tampon PBS, et stockée dans ce dernier jusqu au test Test à l ABTS Le test est constitué par une solution d ABTS préparée dans du tampon PBS selon le protocole recommandé par le fabricant (Sigma). La solution d ABTS pour le test doit être utilisée dans l heure en raison d une dégradation spontanée. La solution initalement incolore-jaune devient vert menthe en présence de HRP et d eau oxygénée. Ce changement de couleur est l indicateur de présence de HRP dans le milieu. La plaque greffée est changée de verrerie pour éviter toute enzyme adsorbée sur le verre et abondamment rincée au tampon PBS et mise en contact avec une solution d ABTS. Cette solution d ABTS préalablement est testée en injectant quelques µl de HRP dans un eppendorf d ABTS juste avant contact avec la plaque et en vérifiant que la solution vire bien au vert. Le système est alors observé afin de voir s il apparaît une teinte verte spécifiquement sur les zones dorées ou non. Lorsque celles ci apparaissent, la plaque est abondamment rincée au PBS, puis soniquée dans ce dernier pour tester la résistance de la SAM et du greffage des enzymes. Un certain nombre de tests de greffage covalent ont été réalisés avec une autre enzyme : la phosphatase alkaline (PA, Sigma) qui lyse un groupement phosphate. Le protocole de greffage est rigoureusement le même. Le réactif de test est la PnPP, incolore, qui devient en présence de PA, PnP + P, jaune Protocole expérimental pour l adsorption de la HRP Ce protocole est largement inspiré de [17] qui a testé l adsorption de la HRP sur une surface hydrophile de silicium. Un morceau de silicium est soniqué dans l isopropanol (Sigma) 15 min à 2 reprises puis séché à l azote. Il est alors mis au contact d une solution de HRP 50µg/ml dans du tampon PBS (Ph=7.4, pour lequel l enzyme présente plus de 80% de son activité enzymatique optimale) pendant 6h. En effet il a été montré dans [17] qu au delà, la densité d adsorption de la HRP sur le silicium n augmente plus. De même, le choix de la concentration de HRP 50 µg/ml est dû à une saturation de la densité surfacique aux concentrations plus élevées. Le choix du silicium est motivé par le fait que cela est fonctionné pour [17] mais s explique par le fait que la surface état hydrophile et la HRP hydrophobe, l adsorption peut se faire sans trop de déformation et donc perte d activité enzymatique de la HRP. Une partie des tests a donc été conduite sur des morceaux de silicium propre hydrophile, ou des plaques de verre lavées dans les mêmes conditions et hydrophiles. Les résultats étant les mêmes pour le verre et le silicium, nous ne préciserons pas forcément sur quel substrat les tests ont été réalisés. La plaque est de nouveau abondamment rincée au tampon PBS, et stockée dans ce dernier jusqu au test. La plaque est alors changée de verrerie pour éviter toute enzyme adsorbée sur le verre et mise en contact avec une solution d ABTS faite dans du tampon PBS. Cette solution est testée juste avant contact avec la plaque en volume en injectant quelques µl de HRP et en vérifiant que la solution vire bien au vert. 4.4 Résultats expérimentaux En dépit de nombreux tests, il a été extrêmement difficile de trancher sur la spécificité ou non du greffage des enzymes sur les surfaces que cela soit par adsorption ou greffage covalent. 16

18 4.4.1 En adsorption Nous n avions pas à disposition de spectrophotomètre pour cause de panne de ce dernier, le test était donc de voir verdir la solution. Ceci est extrêmement difficile à dire en regardant les plaques. Aux temps courts (de l ordre de la minute), le greffage n étant qu en surface, il n y a pas suffisamment de produit pour verdir la solution. Aux temps plus longs (quelques heures), il semble y avoir une coloration de la solution mais un témoin préparé dans les mêmes conditions mais non greffé de HRP présente la même coloration : l ABTS n est pas stable à l ambiante et se dégrade tout seul en son produit vert à l air (le fabricant conseille de s en servir dans l heure suite à sa fabrication). Stocké à plus basse température, c est l activité enzymatique qui devient paralysée. On ne peut donc malheureusement rien dire sur la présence ou non de HRP adsorbée En greffage covalent Il apparaît sur les plaques greffées de PA des tâches jaunâtres après contact avec la PnPP. Cela tend à faire penser qu il y a de l enzyme greffée. Cependant ces tâches ne recouvrent pas du tout l intégralité de la zone d or, et il en existe également sur le verre. Après sonication de 15 minutes, le test est de nouveau réalisé et les observations sont les mêmes. De fait, même «simplement»adsorbées les protéines semblent bien arrimées à la surface. De fait, l adsorption des protéines sur le verre hydrophile est suffisamment efficace pour tuer tout espoir de greffage spécifique sur des surfaces... Nous avons reconduit plusieurs fois ces deux types d expérience, et devant la difficulté de les conduire (greffage multi-étape à «l aveugle», sans moyen de contrôle de vérifier si chaque chose est bien greffée), les difficultés de trancher, l adsorption non sélective très importante des protéines (qui va jusque rendre très difficile le lavage de la verrerie utilisée, lavée à 60 C au micron 90 et soniquée avant de pouvoir être réutilisée sans enzymes greffées), et les précautions relatives aux espèces biologiques pas forcément très faciles à mener dans un environnement inadapté : contrôle de la température, milieu stérile dû à la lyse de la HRP en milieux souillés, sensibilité exacerbée au ph, nous avons préféré écarter cette voie d obtention de Janus... De plus, une caractérisation fine de l adsorption demandait l accès à des installations spécifiques qui quand elles n étaient pas en panne (spectrophotomètre du LPMCN), risquaient d être souillées puisque des protéines pouvaient s adsorber sur leurs surfaces, avec de grandes difficultés à les désorber. De plus, l aspect surfacique même de ces traitements rend les signaux spectrométriques difficiles à obtenir puisqu ils seront obtenus sur une surface et non en volume et donc par essence faibles. S il existe des méthodes, spectrophotométrie par réflexion attenuée du PCML (Lyon I), le cristal de germanium de l installation risquait d être rendu inutilisable à cause de protéines adsorbées ce qui a rendu la manipulation impossible. 4.5 Conclusion sur l obtention de Janus par voie enzymatique Parce que l adsorption non spécifique était difficilement controlable et la caractérisation des surfaces nécessitait un appareillage complexe et de pointe, cette voie d obtention de micronageurs autonomes nous est apparue peu adaptée pour ce que nous souhaitions réaliser. Suffisamment complexe pour être un sujet d étude à part entière, elle ne nous est pas apparue suffisamment fiable pour espérer ensuite une analyse statistique pertinente. En effet, l obtention de ces micronageurs autonomes est pour nous une première étape dans ce que nous souhaitons réaliser, la seconde qui devrait se faire lors de la thèse est de regarder les comportements collectifs (organisation, transition de phase dynamique...) d une assemblée dense de micronageurs. Cela ne peut se faire qu à la condition que les micronageurs soient relativement aisément synthétisables et robustes dans le temps et au milieu. Peu convaincu par la capacité à réaliser ces exigences de fiabilité statistique par voie enzymatique et par les résultats des test qualitatifs, nous avons décidé de ne pas persévérer dans cette voie et n avons pas cherché à caractériser de manière plus qualitative les enzymes greffés car de tels outils de caractérisation sont alors complexes et lourds à mettre en place. 17

19 5 Obtention de colloïdes Janus : voie chimique Devant la difficulté que nous avions à réaliser des Janus par voie enzymatique, qui était la voie initialement prévue, nous avons cherché à développer une autre voie de synthèse de ces colloïdes particuliers. L idée a alors été la suivante : au lieu de prendre un colloïde commercial inerte et de lui greffer sur une moité seulement des enzymes catalytiquement actives, n est il pas possible de trouver une «particule»qui présente une activité catalytique et dont on masquerait l activité sur une moitié? Le masquage d une moitié se faisant alors par évaporation à partir d une électrode d une couche d un matériau à déterminer sur une monocouche de ces colloïdes déposée sur du verre, l autre moitié étant dénuée de la couche évaporée par simple ombrage. En effet, des essais ont été réalisés, par C. Cottin- Bizonne, qui ont conclu à la possibilité de fabriquer selon ce principe des Janus à partir de colloïdes de verre de 3 µm recouverts d une couche d or sur une face. Nous nous sommes alors orientés vers les techniques développées par les chimistes de catalyse hétérogène solide-liquide, le catalyseur, solide, catalyse une réaction dans un réacteur contenant les réactifs de la réaction, liquides et miscibles. Le choix de ce catalyseur solide est soumis à un certain nombre de contraintes afin d espérer créer des Janus et pouvoir trancher si ce sont bien des micronageurs autonomes. La réponse à cette dernière question sera apportée par la mesure du coefficient de diffusion, qui conformément à la section 3 se verra modifié par l autopropulsion des Janus, si elle existe et est suffisante. 1. Le catalyseur solide doit être idéalement de taille micrométrique. En dessous, son observation et son tracking seront optiquement difficiles, au dessus les effets de surface sont moins cruciaux et seront donc moins facilement observables. 2. Le catalyseur devra être d un matériau de densité compatible avec le milieu réactionnel, i.e. il ne devra pas sédimenter trop rapidement et irréversiblement même si l on observe de la diffusion 2D lors de nos expériences. 3. La «poudre»du catalyseur devra être géométriquement régulière et monodisperse. En effet, le coefficient de diffusion d une particule dépend de sa géométrie et de sa taille. Par conséquent, il ne faut pas avoir qu une variabilité géométrique empêche de trancher sur la différence de coefficient de coefficient de diffusion entre une population de colloïdes Janus, et une population de colloïdes non Janus. 4. Tout comme pour les Janus enzymatiques, il est important que l activité du catalyseur soit la plus grande possible. En effet, la vitesse de self diffusio-phorèse étant proportionnelle à cette dernière, il faut pour améliorer l effet prendre un catalyseur le plus efficace possible. Toutefois, cet aspect ne sera pas forcément très facile à déterminer a priori : en effet, les chimistes catalystes aiment à déterminer ces coefficients d activité mais dans le cadre de leurs études, le catalyseur est introduit dans des réacteurs sous pression (quelques centaines d atmosphères), chauffés (souvent vers 500 C), et agités à grandes vitesses. Ces conditions sont bien entendues hors propos pour notre étude puisque que le chauffage même sera extrêmement périlleux car il sera alors difficile d éviter l écoulement convectif qui viendrait masquer les effets attendus. Pour des raisons encore plus évidentes, l agitation est elle aussi proscrite. Si dans nos conditions douces, l activité catalytique est bien entendue beaucoup plus faible que sous la maltraitance des spécialistes de la catalyse, cela n est pas forcément problématique. Nous étudions des phénomènes locaux et ne sommes donc pas à la recherche d un haut niveau de rendement volumique. 5. La couche évaporée sur le catalyseur ne doit pas partir à la sonication mais ne doit pas non plus lier les grains de catalyseur entre eux après sonication, ni les empêcher de la plaque sur laquelle elle a été évaporée. 6. La réaction catalysée ne doit pas produire de gaz car ceci rendrait ambigüe le mécanisme de propulsion des micronageurs (self diffusio-phorèse ou propulsion à réaction?). Nous nous sommes alors focalisés sur la réaction que nous voulions catalyser et qui vérifierait la contrainte 18

20 précédente. Nous n avons pas trouvé de réaction redox qui n avait ni produits ni réactifs gazeux. En revanche, la classe des réactions sous catalyse acide nous est apparue particulièrement riche et ne créant pas de bulles. Nous nous sommes alors focalisés sur les catalyseurs acides. 5.1 Choix du catalyseur solide : la Zeolite ZSM5 La détermination du catalyseur solide utilisé a été précédée d une recherche bibliographique afin de déterminer un candidat crédible pour l objectif qu on lui assignait. Ces recherches ont abouti à la découverte de la «zéolite»comme catalyseur solide acide efficace qui a de plus l avantage d être étudiée [25, 26]à quelques pas du LPMC à l IRCE (Institut de Rechercher sur la Catalyse, Université Lyon I). Le nom de zéolite est un nom générique et il en existe un très grand nombre de sortes. Nous développerons par la suite le type spécifiquement utilisé mais nous en donnerons préalablement quelques propriétés générales La Zéolite [1] Ce catalyseur se présente sous la forme d une poudre blanche de grains principalement de silice et d inclusions de différentes sortes selon que l on désire une activité catalytique acide ou basique. La présence d aluminium est à la base de son caractère acide : certains atomes de silice soient remplacés par de l aluminium (ratio variable qui modifiera l acidité de la zéolite ainsi que sa forme) de valence plus importante. Un traitement acide permet alors de fixer des H + à l emplacement des lacunes. L électroneutralité des grains leur interdit alors de perdre ce proton qui résistera alors à la mise sous vide, à l agitation tout en conférant à la poudre un caractère de catalyseur acide. Il est à noter enfin que ces zéolites sont des matériaux microporeux qui adjoint à ce caractère acide explique leur activité catalytique : ils contiennent un très grand nombre de canaux de quelques Angströms de rayon qui les parcourent et qui eux aussi contiennent un grand nombre de protons disponibles en augmentant considérablement la surface effective puisque la surface catalytique représente 200 fois la surface géométrique externe du grain, à la condition de franchir sous forme thermique ou mécanique l énergie nécessaire au dépassement de la barrière d adsorption dans le matériau. Dans notre cas, cette capacité à passer la barrière sans agitation et sous température raisonnable reste la grande inconnue et seules les expérimentations permettront de voir si la zéolite garde bien une activité catalytique en conditions douces La zéolite ZSM5 acide Nous avons finalement décidé d utiliser une zéolite ZSM5 acide de rapport Si/Al=50 synthétisée et calcinée par Alain Tuel (IRCE Lyon) et qui est considérée comme un catalyseur acide efficace. Elles possèdent les caractéristiques suivantes, en reprenant la numérotation des contraintes de la partie 5 : 1. Les grains de ZSM5 sont de petits pavés de 500nm nanoporeux, c est à dire contenant un très grand nombre de canaux internes faisant des pores de 8 Angtroms de rayon à la surface du grain. Nous aurions préféré des grains plus gros rendant l observation au microscope plus aisée mais les zéolites plus grosses sont de type Y ou A et ne présentent pas de caractère acide. De plus pour limiter les passages de barrière d adsorption et de confinement des espèces à l intérieur des pores [1], il faut des pores de la plus grande taille possible. Avec ces pores, les ZSM5 Si/Al=50 représentent un bon compromis caractère acide-taille de pore. 2. Constitués majoritairement de silice de densité 2, les grains de zéolite sont plus denses que l eau mais l écart de densité reste suffisamment raisonnable pour qu il y ait diffusion. 3. Les grains sont relativement monodisperses en taille. La transformée de Fourier de la 5.1 (a) présentant un grand nombre de zéolites ZSM5 donne une taille entre 330 et 555 nm. En revanche, la géométrie des grains apparaît clairement plus aléatoires (voir photo 5.1). Une autre source de complication comme on le verra par la suite est la formation de multiplets de grains. 19

21 4. Des e tudes ont montre que le ration Si/Al=50 est convenable pour une bonne activite catalytique bien que non optimal (le maximum est autour de Si/AL 20) [1][27]. Cependant, les ZSM5 e tant hydrophiles, leur activite catalytique peut se retrouver empoisonne e par la pre sence d eau dans le milieu qui enveloppant le grain interdit son acce s aux re actifs. Un taux Si/Al e leve (50) en les rendant moins hydrophile re duit les risques d empoisonnement du catalyseur en milieu aqueux [1] ce qui sera important pour la suite. 5. Il sera de pose sur le grain diffe rents mate riaux. Toutefois il est quasi certain qu un de po t de silice sur ces grains faits majoritairement de silice aura une excellente adhe sion. 6. Nous avons choisi de catalyser en milieu acide une re action d este rification qui ne donne pas d espe ces gazeuses. 7. L este rification est la re action : alcool + acide carboxylique ester. (a) (b) Fig. 5.1 (a) Photo MEB de zeolite ZSM5 apre s sonication et dorage a l or de 20nm pour favoriser le contraste. L e chelle est indique e en bas a gauche. On voit que les grains sont de taille relativement monodisperse (de l ordre de 500nm). En revanche leur ge ome trie apparaı t clairement plus ale atoire. On peut de ja observer une tendance des grains a s agglome rer. (b) Transforme e de Fourier de la photo pre ce dente apre s traitement. On note l apparition d une longueur privile gie e (halo lumineux sur la TF). La ge ome trie circulaire est due a l isotropie de l orientation des ze olites de pose es ale atoirement avant leur observation au MEB. Le cercle est peu marque a cause de la dispersion ge ome trique et de taille des ZSM5 ainsi qu a la pre sence de multiplets qui ge ne rent d autres fre quences spatiales et augmente le bruit de fond de l image. D apre s cette figure et compte tenu de l incertitude de lecture assez grande, la taille des ZSM5 est dans l intervalle (330 nm ; 555 nm). Photos MEB faites sur JEOL 840 de l INSA LAMCOS. TF re alise e sous Image J La re action catalyse e : este rification de l e thanol par l acide ace tique Nous avons choisi de catalyser une re action d este rification car il s agit de l une des re action catalyse es en milieu acide les plus simples et fiables. Rappelons rapidement qu il s agit d une re action equilibre e, c est a dire que la re action inverse existe, il s agit de la re action d hydrolyse de l ester. La pre sence d eau est donc si possible a re duire. De fait son rendement a l e quilibre thermodynamique n est pas de 100% tre s lente, elle a lieu spontane ment (thermodynamiquement favorise e) a tempe rature ambiante et en l absence de catalyseur mais sa vitesse est tre s faible. Nous avons choisi un alcool et un acide carboxylique faiblement ramifie s : la minimisation de la ge ne ste rique favorise le rendement [28]. Pour des raisons de cou t, de facilite d obtention et de rendement nous avons choisi la re action e thanol + acide ace tique ace tate d e thyle. Le produit de la re action 20

22 a l odeur du dissolvant de vernis à ongles. Aucun test simple n existant pour la vérification de la présence de cet ester, les prétests qualitatifs ont été faits en vérifiant ou non la présence de cette odeur de dissolvant dans les différents échantillons test (!). 5.2 Protocole de test des ZSM5 et résultats expérimentaux Les ZSM5 ont une activité catalytique acide connue des chimistes. Son efficacité à catalyser des réactions d estérification a été démontrée [27] dans des conditions dures. Il reste maintenant à tester si cette activité existe encore dans nos conditions douces. Une fois convaincus que l activité catalytique acide est préservée dans nos conditions, nous chercherons à fabriquer des colloïdes ZSM5 Janus, et à vérifier leur robustesse à la sonication. Enfin, tout ceci étant confirmé, il sera mesuré le coefficient de diffusion d une population de ZSM5 non Janus, et de Janus afin de voir si l on observe le mécanisme de self diffusio-phorèse Vérification de l activité catalytique des ZSM5 en conditions douces pour l estérification de l ethanol avec l acide acétique Nous avons tout d abord voulu vérifier que les ZSM5 avaient bien une activité catalytique vis à vis de l estérification de l éthanol par l acide acétique. Protocole (test qualitatif) : nous avons préparé 5 tubes contenant chacun 6 ml d éthanol Et-OH et 6 ml d acide acétique CH 3 COOH purs (liquides miscibles). Les tubes contiennent de plus : 1. Quelques mg ( 30 mg) de ZSM5. Ce tube est conservé à température ambiante (T 24 C). 2. Idem mais ce tube est conservé à l étuve (T 45 C). 3. Quelques gouttes d acide sulfurique 1M, le catalyseur recommandé pour la catalyse acide des réactions d estérification. 4. Idem mais ce tube est conservé à l étuve (T 45 C). 5. Rien, il s agit du tube témoin. La réaction d estérification devant avoir lieu spontanément mais étant très lente sans catalyseur, on vérifie ici que l ester obtenu ne s est pas formé spontanément sans l aide du catalyseur. L ester d acétate d éthyle formé étant à chaîne carbonée courte, il est miscible dans le mélange éthanolacide acétique. Il faut réaliser un «relargage», c est à dire le mélanger à une solution d eau saturée en chlorure de sodium (320g/l), pour le rendre insoluble et voir apparaître une éventuelle flaque d ester. Au bout de quelques minutes, la ZMS5 qui avait été dispersée préalablement en soniquant a sédimenté. La poudre de zéolite sédimentée étant relativement compact, cela a pour conséquence une réduction importante de la surface de contact avec le milieu réactionnel et donc du rendement de la réaction catalysée. Après 24h, les 5 tubes sont relargués chacun dans 20 ml d eau salée et laissés à décanter. Le protocole de test qualitatif est alors visuel et olfactif : on regarde s il y a présence ou non d une flaque d ester, moins dense, à la surface du tube, et on cherche l odeur de dissolvant de vernis à ongles. Cette odeur est assez facile à déterminer car la flaque d ester même d épaisseur infime et non visible fait bouchon aux émanations d acide acétique qui sinon sont extrêmement présentes et désagréables : odeur extrêmement piquante de vinaigre concentré. Résultats : les résultats sont les suivants : Tubes 1 et 2, on sent un odeur persistante de dissolvant de vernis à ongles. Le tube 1 présente une très léger teinte piquante. Pas de flaque d esters visible. Tubes 3 et 4, l odeur de dissolvant est évidente. Une épaisse flaque ( 2-3 ml) est visible à surface. Elle est encore plus importante pour le tube 4, conservé à 45 C. L odeur de vinaigre est indécélable. Tube 5, l odeur de vinaigre est très désagréable! Pas la trace de flaque ou d odeur d ester. Ces tests sont renouvelés une autre fois afin de confirmer les résultats. De plus, pour éviter la sédimentation des ZSM5 sur les 24h de la manipulation, le tube 2 est refait et mis dans une étuve à 37 C avec une agitation permanente légère (plateau agitateur de biologiste) évitant la sédimentation. L odeur de dissolvant est alors plus importante. 21

23 Grâce à ces prétests qualitatifs, nous avons été convaincus que la ZSM5 gardait bien une activité catalytique pour l estérification en conditions douces. Les résultats étant probants, nous n avons pas cherché à développer de quantification plus précise : en effet nous ne cherchons pas à obtenir un bon rendement catalytique, seuls des gradients locaux sont nécessaires. De plus, compte tenu de ce faible rendement volumique, les techniques de quantification s avèraient extrêmement compliquées : les quantités sont trop faibles pour permettre un dosage de l acide acétique restant et en déduire la quantité d ester, il aurait donc fallu utiliser des techniques de spectroscopie Haute Résolution que nous n avions pas à disposition Fabrication de ZSM5 Janus et vérification de leur résistance à la sonication Maintenant que l activité catalytique des zéolites ZSM5 est confirmée à température ambiante, pression ambiante et sans agitation, la prochaine étape est de recouvrir une moitié des grains. En effet, les protons H + catalytiques des ZSM5 étant dans des canaux de 8 angströms, on espère qu une couche de quelques nanomètres d or ou de silice sur une moitié permettra de tuer l activité catalytique sur cette face. Ces ZSM5 Janus devront de plus résister à la sonication indispensable pour les disperser avant mesure de leur coefficient de diffusion. Protocole : Fig. 5.2 Protocole d obtention des ZSM5 Janus. La zéolite (ronds noirs) est dispersée dans l éthanol. 1 : elle est sédimentée pour éliminer les grosses saletés puis centrifugée pour changer le solvant et purifier la solution de zéolite. 2 : une goutte de zéolite est déposée sur une plaque de verre en monocouche. Le solvant est évaporé. 3 : la plaque de verre est mise dans l évaporateur et bombardée d un matériau (or ou verre). L ombrage rend une seule hémisphère coiffée d un chapeau du matériau (en jaune sur le schéma). 4 : la plaque de verre est mise dans l éthanol et soniquée pour décoller les Janus et les disperser. Purification des ZSM5. La ZSM5 en poudre donnée par A.Tuel étant préparée sans précautions particulières de propreté, une phase préalable de purification est nécessaire. Une masse de 0.70 mg est pesée et mise dans un eppendorf de 10 ml d éthanol pur (le solvant n est pas l eau pour éviter tout risque d empoisonnement du catalyseur [1]. De plus l éthanol étant très volatil, il s évapore rapidement ce qui facilitera le dépôt sur des plaques). Le mélange est vortexé puis soniqué 1min. Il est ensuite mis à sédimenter 3 minutes afin de permettre aux plus grosses saletés de sédimenter. Le surnageant est alors retiré à l aide d une pipette, sans agitation, et en laissant le fond de culot dans le tube, mis dans une série d eppendorf de 2 ml puis mis à centrifuger 1 minute à 5000 rpm. Les eppendorfs sont sortis sans agitation de la centrifugeuse, et le solvant surnageant est pipeté à 90% et jeté. Le fond de culot de chaque eppendorf est mis en commun afin de constituer le concentré purifié de ZSM5 et mis de côté. Préparation des Janus. Le concentré de ZSM5 est mis à soniquer 15 min à 60 C. Une plaque de verre est mise à soniquer dans l isopropanol dans les mêmes conditions puis séchée à l azote. Une goutte du concentré est alors posée sur la plaque de verre et mise à évaporer sous hotte (l utilisation d éthanol accélère cette phase et minimise les risques d empoussièrement). La plaque est alors observée au microscope (Leica, éclairage en transmission avec objectif 63x à immersion à huile) afin de vérifier que l on a déposé une monocouche de ZSM5 (voir photo 5.3). En effet, le dépôt se faisant par bombardement de la plaque par des atomes arrachés à une électrode, seules les zones ombrées ne sont pas recouvertes. Une monocouche régulière est à la base de l obtention réussie de particules Janus. Des multicouches conduirait à un mélange de ZSM5 Janus et non Janus, ces deux population étant indiscernables au microscope optique, cela conduirait à un biais de la détermination statistique du coefficient de diffusion mesuré qui serait un mélange des deux coefficients. 22

24 Si la monocouche est re ussie, la plaque est mise dans l e vaporateur et bombarde e d atomes d une e lectrode d un mate riau a de terminer (or, chrome ou silice) et selon l e paisseur de notre choix. Nous avons re alise des de po ts d or de 124 nm afin de pouvoir ve rifier au MEB (en donnant un bon contraste) que l on a bien des colloı des Janus ZSM5 par cette me thode de de po t par e vaporation sur monocouche de ZSM5 que l on arrive a de coller des plaques de verre et a disperser dans l e thanol par sonication sans pour autant abı mer le de po t me tallique. Ensuite, la me thode valide e, nous re aliserons des de po ts de silice de 10nm dont on sait que l affinite sur les ZSM5 faites de ce mate riau est tre s bonne afin d obtenir des particules Janus utilisables mais que l on ne pourra ve rifier au MEB du fait de l absence de contraste entre la calotte et le colloı de faits du me me mate riau. Les ZSM5 avec de po ts sont alors de colle s des plaques par sonication de 15 min a 60 C et disperse s dans l e thanol par la me me me thode. Les ZSM5 Janus avec un de po t d or sont alors observe s au MEB (JEOL 840, INSA, LAMCOS) avant et apre s sonication pour voir la qualite du de po t et sa re sistance apre s de po t sur une feuille d aluminium. Une sonde Analyse X dont est e quipe e ce MEB a e galement e te utilise e pour dresser une cartographie des e le ments en fonction de leur emplacement spatial afin de ve rifier la pre sence ou non des calottes d or. Fig. 5.3 Plaque de verre recouverte de ZSM5 avant de po t d or. On voit bien que les colloı des sont principalement en monocouche. Observation faite au microscope optique Leica 63x a immersion a huile. Re sultats expe rimentaux Nous avons regarde au MEB les plaques avec 124 nm d or sur les ZSM5. Les photos issues du MEB ainsi que de la sonde X sont pre sente s en annexe D. Des zones apparaissent fortement lumineuses sur les photos (cf photo D.1 (a)). On pourrait penser que cela montre la pre sence d une couche d or (e mettant un grand nombre d e lectrons et par conse quent lumineux sur une image MEB), mais les proble mes d ombrage et de contraste sont nombreux dans cette microscopie et cette brillance ne permet en aucun cas de trancher a priori. Il nous a donc fallu utiliser la sonde a analyse X dont est e quipe e le microscope e lectronique. Les cartographies des e le ments Al, Si et Au sont visibles sur les photos D.1 (b), (c) et (d). On voit une corre lation nette entre les zones fortement lumineuses et la pre sence d or, ceci permet d affirmer que les zones tre s lumineuses sur l image sont bien dues a la pre sence d or et non a un effet d ombrage. L e paisseur importante d or de pose e l a e te pour faciliter l analyse de la sonde X. Finalement gra ce a cette analyse, nous voyons que l on a bien des colloı des Janus que l on peut de coller de la plaque de verre et soniquer sans endommager leur calotte d or. Malheureusement nous ne pouvons utiliser de Janus avec une calotte d or, et a forciori avec une telle e paisseur d or. En effet l or est environ dix fois plus dense que la silice. Par conse quent, me me une couche mince d une dizaine de nanome tres d or fera 20% de la masse du colloı de nu, ce qui biaisera sa diffusion rotationnelle (par effet culbuto) et donc son coefficient de diffusion [7]. Si par contre, maintenant que l on a valide notre me thode de synthe se de Janus, on remplace cette couche d or par une couche de me me e paisseur de silice, le biais introduit est beaucoup plus faible, c est donc avec une couche de verre qu ont e te teste s les colloı des Janus Etude de la dynamique des micronageurs Janus Suivi de ZSM5 et de termination du coefficient de diffusion Comme l a montre l e quation 3.1, les me canismes diffusiophore tiques devraient conduire a une amplification du coefficient de diffusion des colloı des ZSM5 Janus. Il s agit donc de le de terminer avec une pre cision suffisante pour de terminer si le caracte re Janus de colloı des modifie ou non leur coefficient de diffusion. Les ze olites sont laisse es se dimenter environ une heure avant d e tre tracke es. Leur profondeur fluctue alors autour de leur profondeur de se dimentation lg issue de la compe tition entre la gravite et l agitation thermique ( voir annexe E). 23

25 Ce dernier a été déterminé par imagerie de colloïdes à l aide d un microscope optique et suivi individuel à l aide d une routine Matlab de tracking par suivi individuel et détermination du centre des colloïdes (http ://physics.georgetown.edu/matlab/). Dans un premier temps, l algorithme détermine tous les maxima de l image i qui représentent les colloïdes à tracker. Il détermine alors leur centre. La même procédure est appliquée à l image i + 1. L algorithme définit la trajectoire d un colloïde en ne considérant que les maxima à une distance en dessous d une borne supérieure donnée par l utilisateur. Cet algorithme ne peut donc fonctionner qu en solutions diluées, sinon il est incapable de reconstruire les trajectoires. Une moyenne glissante et un ajustement linéaire du déplacement quadratique moyen d une assemblée de colloïdes sur différents films permet de déterminer le coefficient de diffusion. Nous avons parfois fait usage d un ajustement quadratique lorsque la convection n était plus négligeable afin de discriminer écoulement de mouvement brownien. Les coefficients sont issus de la concaténation de différents films de 1000 images mettant en scène des colloïdes indépendants. Le temps sur lequel diffuse un colloïde Janus est de τ a 2 /D 0.4s. Par conséquent, une mesure sur seulement quelques secondes représente déjà un déplacement quadratique moyen très important pour le colloïde et permet d extraire un coefficient de diffusion fiable de la régression linéaire. Les Janus considérés ici possèdent un chapeau de silice de 12 nm. Les protocoles de préparation des cellule d observation et de fit sont plus longuement développés dans l annexe F Résultats expérimentaux Les systèmes suivants ont été étudiés : 1. ZSM5 dans l eau : il s agit lors de ces mesures de mesurer le coefficient de diffusion des ZSM5 dans un liquide de viscosité connue et de le comparer aux valeurs données par l équation de Stokes Einstein. 2. ZSM5 dans un mélange acide acétique-éhanol (50%-50% en volume) : le but est alors de mesurer le coefficient de diffusion de non Janus dans un mélange anhydre, donc sans empoisonnement des ZSM5, en espérant augmenter l activité catalytique avec les deux réactifs de l estérification purs. 3. ZSM5-Janus dans un mélange acide acétique-éhanol : idem ci dessus mais avec des colloïdes Janus afin de comparer les résultats. 4. ZSM5-Janus dans un mélange eau-acide acétique-éhanol (respectivement 92%, 4%, et 4% en volume). x <r²> (m²) 1 6 x y = 1.8e 12*x + 7.2e t (s) Fig. 5.4 Déplacement quadratique moyen < r 2 >=< x 2 + y 2 > en fonction du temps suite à une moyenne glissante sur 132 trajectoires de 80 points pour la solution 2 acide acétique-éthanol sans colloïdes Janus. On voit que la moyenne glissante perd en fiabilité pour les points de poids statistique moindre. Le coefficient de diffusion est déterminé par un fit linéaire des 26 premiers points. La diffusion étant observée à 2 dimensions, D vaut un quart de la pente de la droite. La fenêtre représente un inset de la zone fittée. 24

26 Une des principales difficultés lors du tracking est que les colloïdes ne défocusent pas lors du suivi, en effet leur profondeur fluctue autour de la longueur de sédimentation l g. L objectif étant à fort grossissement et grande ouverture numérique, cela conduit à une profondeur de champ faible ( 1 µm). Les colloïdes focusent et défocusent donc suivant leur position ce qui conduit à une alternance blanc-noir de leur aspect. L algorithme de tracking mesurant des maxima ou des minima, cela pose problème. Celui ci a été partiellement levé avec l utilisation d objectifs de phase qui réduit fortement cet effet de clignotement. Un autre problème est qu en dépit d une sonication importante, il y a souvent des colloïdes dimérisés. Cela biaise bien entendu la mesure du coefficient de diffusion, et il faut éviter de les tracker. Néammoins, ceci étant extrêmement difficile à déterminer déjà à l oeil puisque parfois le deuxième colloïde est caché sous l autre (comme un bouchon de pêche), il l est encore plus de l automatiser et de la voir lors du tracking. Nous avons essayé le plus possible de marginaliser ces erreurs. Le tracking des ZSM5 dans l eau pure n a pas posé de problèmes particuliers. Nous sommes alors passés au tracking dans le mélange 2. Il s est alors posé un problème inattendu : alors que la solution colloïdale aqueuse est stable plusieurs jours, dans le mélange de l estérification les colloïdes s adsorbent en quelques minutes sur le verre. Cela rend très difficile le tracking puisque très peu de colloïdes bougent. De plus le mélange étant très volatile, il est très difficile de supprimer les fuites et les courants convectifs. Nous avons donc essayer différents moyens de clore les cellules utilisées, et essayer de réduire les surfaces de fuite. Nous avons finalement utilisé des tubes en verre (borosilicate) parrallèlépipédiques de 100µm de côté scellés à la cire de parafine qui donnaient les résultats les plus probants avec à la fois une adsorption réduite et une convection réduite. Le tracking du mélange 3 a été réalisé selon la même méthode mais le dépouillage en raison du grand nombre de colloïdes adsorbés n a pu se faire, l algorithme n a pas réussi à en suivre même un nombre restreint : contraste faible, et clignotement important. De plus un grand nombre de colloïdes semblent avoir une très grande jupe autour d eux visible à l aide d objectifs à contraste de phase. Le verre avec lequel on a recouvert les ZSM5 se détacherait il moins bien que l or utilisé pour les prétests? Des observations MEB seront nécessaires pour trancher mais n ont eu le temps d être conduites complètement. Nous avons donc mis de coté ce mélange afin d aller plus avant. En raison de l échec avec la solution 3, et afin d avoir malgré tout une idée de la capacité de notre méthode à donner des nageurs autopropulsés nous avons essayé d obtenir un mélange dans lequel l adsorption des colloïdes n est pas problématique. On a donc réalisé des mélanges eau-acide acétiqueéthanol jusqu à ce que l adsorption n ait plus lieu. Le mélange 4 a évité l adsorption et a permis la mesure d un coefficient de diffusion. La barre d erreur a été estimée en regardant l écart type moyen d une mesure divisé par la racine du nombre de mesures faites. On obtient des mesures de coefficients de diffusion à ±0.05m 2 /s. Les coefficients de diffusion mesurés dans les différents cas sont récapitulés dans le tableau D 1 D 2 D 3 D m 2 /s m 2 /s NA m 2 /s Tab. 5.1 Coefficients de diffusion obtenus pour les mélanges définis précédemment. 1 : ZSM5 dans l eau ; 2 : ZSM5 dans un mélange acide acétique-éthanol (50%-50% en volume) ; 3 : ZSM5-Janus dans un mélange acide acétique-éthanol (50%-50% en volume) ; 4 : ZSM5-Janus dans un mélange eau-acide acétique-éthanol (respectivement 92%, 4%, et 4% en volume). Après fit linéaire, une courbe typique de fit est montrée en annexe F. La barre d erreur sur la mesure du coefficient de diffusion est de ± 0.05 m 2 /s Interprétation Les résultats obtenus pour les coefficients de diffusion soulèvent un certain nombre de questions auxquelles nous allons essayer de tenter de donner une explication. Tout d abord, le coefficient D 1 obtenu est largement inférieur à ce que l on attend d après l équation de Stokes Einstein pour des colloïdes de cette taille dans l eau, et est beaucoup plus proche de ceux obtenu expérimentalement pour des colloïdes de 1µm [29]. Cela est il une preuve que tous nos colloïdes 25

27 sont dimérisés? Ensuite, l adsorption des zéolites dans le milieu réactionnel est impressionnante. Elle est sans doute due à l absence d écrantage des intéractions electrostatiques en milieu organique. Néammoins le fait qu il faille aller jusque des solutions aqueuses à plus de 90% pour réduire l adsorption est étonnant et pose le problème de l activité catalytique puisque la zéolite ZSM5 devrait être sensible à un empoisonnement à l eau réduisant son activité catalytique et donc son coefficient d activité surfacique... Enfin, et sans doute le plus important pour nous, il y a bien une augmentation sensible du coefficient de diffusion entre les mélanges 1 et 4 (+24%), cela est il comme espéré une conséquence de la self électrophorèse à la surface de nos Janus? Ou un simple artefact dû à une importante modification de la viscosité du mélange eau-acide acétique-éthanol par rapport à celui de l eau? En effet η etoh = mpa.s et η ac ac = 1.53 mpa.s et η eau = 1 mpa.s, de fait en considérant en première approximation que la viscosité du mélange est le barycentre des viscosités, on obtiendrait une viscosité du mélange de 0.99 mpa.s, ce qui ne représente qu un pourcent de variation de viscosité. Toutefois, ce moyen de déterminer la viscosité est grossier et Il faudra réaliser des tests supplémentaires pour trancher... 26

28 6 Conclusion Nous avons donc commencé à explorer un certain nombre de pistes lors de ce stage afin d apporter des preuves expérimentales des mécanismes diffusio phorétiques. Nous n avons pour l instant que principalement mis en place les protocoles et les dispositifs expérimentaux qui seront nécessaires à l exploration du mouvement des micronageurs. Par manque de temps, nous n avons pu tester le mélange eau-acide acétique-éthanol (respectivement 92%, 4%, et 4% en volume) avec des colloïdes non Janus qui nous sera indispensable pour trancher. Le système tri-canal en gel semble un excellent candidat pour démontrer les mécanismes diffusio phorétiques appliqués à des colloïdes remorqués par les sels puisqu il permettra d éliminer les écoulements convectifs. Les tests préliminaires n ont pu être conduits car la connectique d alimentation n a pu être mise en place, un nouveau système expérimental est en cours.. La large étude de systèmes pouvant conduire à des micronageurs autonomes a conduit a deux voies distinctes : une activité catalytique d origine biologique (enzymatique) ou chimique. De nombreux essais sur l obtention de micronageurs par voie enzymatique, qui était la voie définie avant le stage, a abouti à une impasse relative du point de vue de ce que l on cherchait pour nos expériences : l adsorption est trop peu sélective et la mise en place expérimentale trop complexe, difficile à vérifier et peu pérenne pour espérer avoir des populations fiables de micronageurs et espérer des comportements collectifs, dont l étude constituera le second volet de ma thèse. Nous avons alors développé une alternative par voie chimique à l aide de catalyseurs hétérogène solide. Le protocole expérimental menant à l obtention de micronageurs éventuels à été complètement développé durant le stage, avec le candidat qui nous a semblé le plus apte : la zéolite ZSM5 (Si/Al=50). Après caractérisation par MEB, nous avons pu faire leur suivi optique par microscopie afin de mesurer leur coefficient de diffusion qui permet de trancher sur leur comportement de micronageurs autonomes ou non. Les premiers résultats sont non conclusifs : les ZSM5 s adsorbant dans un milieu contenant les réactifs de la réaction catalysée purs, il faut travailler en solution aqueuse. On aboutit à une augmentation de diffusion de 24% du coefficient de diffusion pour les Janus dans un mélange modifié de 8% mais cet écart pourrait être dû à une modification de la viscosité du mélange qui irait dans ce sens même si une rapide estimation semble écarter cette solution. Des tests supplémementaires de particules non Janus dans ce même milieu seront nécessaires. Les mesures réalisées ne permettent pour l instant pas de trancher sur le succès ou non d utiliser la zéolite comme micronageur autonome. Nous avons travailler à voir que certaines voies a priori intéressantes se révèlent périlleuses pour l obtention de micronageurs fiables telle que leur obtention par voie de greffage enzymatique..de plus, nous avons principalement mis en place les outils qui nous permettront de trancher rapidement cette question à la rentrée, et nous permettent de savoir quelles pistes approfondir (mélange réactionnel, type de couverture (or, verre). Enfin,De plus, ces résultats s inscrivent dans un contexte brulant : ce champ d étude est un sujet actullement très dynamique puisque les premiers micronageurs émergent [13], de même la recherche sur l obtention de particules janus bifonctionnalisées de toutes sortes suit un véritable essor [30, 31]. Tout cela ne rend l approfondissement de notre voie, nouvelle, d obtention de micronageurs autonomes que plus excitant à creuser! 27

29 Bibliographie [1] A. Corma. State of the art and future challenges of zeolites as catalysts. Journal of Catalysts, 216, [2] A.D. Strook G.M. Whitesides. Flexible methods for microfluidics. Physics Today, [3] Abecassis B. Phoretic mixing and focusing of macromolecules in microchannels. Communication interne, [4] A.Ajdari L. Bocquet. Giant amplification of interfacially driven transport by hydrodynamic slip : Diffusio-osmosis and beyond. PHYSICAL REVIEW LETTERS, (96), [5] J. Adler C. Li. Escherichia coli shows two types of behavioral responses to osmotic upshift. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 175(9), [6] H.Berg T. Pitta. Self-electrophoresis is not the mechanism for motility in swimming cyanobacteria. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 177(19), [7] R. Golestanian T. B. Liverpool A. Ajdari. Propulsion of a molecular machine by asymmetric distribution of reaction products. PHYSICAL REVIEW LETTERS, [8] Anderson. Colloid transport by interfacial forces. Ann. Rev. Fluid Mech, 21, [9] W.Paxton et al. Chemical locomotion. Angew. Chem. Int. Ed., [10] W.Paxton et al. Catalytic micropumps : Microscopic convective fluid flow and pattern formation. JACS, [11] Tanniemola B. Liverpool Ramin Golestanian and Armand Ajdari. Designing phoretic micro- and nano-swimmers [12] W.Paxton et al. Catalytically induced electrokinetics for motors and micropumps. JACS, [13] Anthony J. Ryan Tim Gough Reza Vafabakhsh Ramin Golestanian Jonathan R. Howse, Richard A.L. Jones. Self-motile colloidal particles : from directed propulsion to random walk. PHYSICAL REVIEW LETTERS, [14] L.M. Shannon et al. J. Biol. Chem., 241, [15] K.G. Welinder. Eur. J. Biochem., 96, [16] D. Stephan D. Schomberg, M. Salzmann. Enzyme Handbook 7, [17] A.F. Naves, A.M. Carmona-Ribeiro, and D.F.S. Petri. Immobilized horseradish peroxidase as a reusable catalyst for emulsion polymerization. Langmuir, 23(4) : , [18] E. Gomez J. Bastida A.M. Hidalgo M. Gomez J.L. Gomez, A. Bodalo. Immobilization of peroxidases on glass beads : An improved alternative for phenol removal. Enzyme and Microbial Technology, 39, [19] V.C.B. Martins J.M.S. Cabral T.D. Gibson L.P. Fonseca V. Vojinov, A.M. Azevedo. Assay of h2o2 by hrp catalysed co-oxidation of phenol-4-sulphonic acid and 4-aminoantipyrine : characterisation and optimisation. Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic, [20] N ; Mahmoudi A ; Rahimi H ; Moosavi-Movahedi A A Nazari K / Esmaeili N / Mahmoudi A / Rahimi H / Moosavi-Movahedi Nazari, K ; Esmaeili. Peroxidative phenol removal from aqueous solutions using activated peroxidase biocatalyst. Enzyme and Microbial Technology, 41, [21] Mohammad H. Entezari and Christian Petrier. A combination of ultrasound and oxidative enzyme : sono-biodegradation of phenol ;. Applied Catalysis B : Environmental, 53(4) : , [22] G. A. Williams M. B. Arnao F. G. Canovas M. Acosta A. N. P. Hiner, J. Hernandez-Ruiz. Catalase-like oxygen production by horseradish peroxidase must predominantly be an enzymecatalyzed reaction. Archives of Biochemistry and Biophysics, 392, [23] Jennah K. Kriebel Ralph G. Nuzzo G. M. Whitesides J. Christopher Love, Lara A. Estroff. Selfassembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev, [24] Biacore sensor surface handbook. 28

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31 A La double couche électrique Il est possible d expliciter le potentiel d interaction U(y) avec la surface, dans le cas par exemple d un soluté complètement dissocié en solution aqueuse tel N acl. Considérons une surface solide plane plongée dans une solution aqueuse électrolytique. Spontanément cette surface acquiert une charge ; ce phénomène peut s expliquer par le relargage d impuretés, l adsorption d espèces chargées ou la dissociation de groupes ionisables. Par exemple une surface de verre plongée dans l eau pure présente une surface chargée négative, électriquement homogène à l échelle du nanomètre, à cause de la présence de groupe Si OH ou Si O Si à l interface. Les ions du milieu se réorganisent alors pour venir se placer en vis à vis de la surface chargée et former une couche chargée de signe opposée appelée double couche électrique. Cette couche trouve son importance dans le fait qu elle écrante la charge de surface et fixe ainsi la portée des interactions électrostatiques dans le milieu. C est donc un problème majeur que de connaître la distribution des ions au voisinage de la paroi. Celle-ci nous est donnée par la théorie de Gouy-Chapman. On garde la même géométrie que précédemment : une surface plane chargée uniformément placée en y = 0 baigne dans une solution électrolytique occupant le demi-espace y > 0 ; pour simplifier les ions seront supposés ponctuels et monovalents. L équation de Poisson nous donne la relation entre le potentiel électrique V (y) et la densité de charge ρ (supposés variables continues) par : V = d2 V dy 2 = ρ ɛ (A.1) où ɛ = ɛ 0 ɛ r est la permittivité diélectrique du milieu supposée constante (ɛ 0 celle du vide, ɛ r 80 la permittivité relative de l eau à température ambiante). L approximation de la théorie Gouy-Chapman consiste en une approximation de type champ moyen, c est-à-dire ici à ignorer les fluctuations de V et ρ pour ne prendre en compte que leur valeur moyenne. On néglige donc les corrélations entre ions ainsi que les interactions ions-solvant. A l équilibre thermique les densités d ions positifs c + et négatifs c suivent alors l équation de Boltzmann : βev (y) c ± = c 0 e (A.2) où c 0 est la concentration en ions loin de la paroi, la même pour les cations et les anions, β = 1/k B T. On trouve alors facilement la densité de charge en ions ρ = e(c + c ) = 2ec 0 sinh(βev ) (e la charge élémentaire), que l on réinjecte dans l équation (A.1) pour obtenir l équation de Poisson- Boltzmann : d 2 V dy 2 = 2ec 0 sinh(βev ) ɛ qui donne l évolution du potentiel électrique V (y) au voisinage d une paroi chargée. (A.3) Par la suite nous caractériserons les propriétés diélectriques du milieu par la longueur de Bjerrum l B = e 2 /(4πɛk B T ) à laquelle se compare les effets de l agitation thermique avec ceux des interactions électrostatiques. Dans l eau à température ambiante pour des ions ponctuels monovalents l B 0, 7 nm. L équation (A.3) se réécrit sous la forme : βe d2 V dy 2 = 8πl Bc 0 sinh(βev ) (A.4) 30

32 Cette équation peut être linéarisée lorsque l on fait l approximation de Debye-H ckel ev k B T et admet la solution suivante en supposant le potentiel nul à l infini : V (y) = V 0 e κy (A.5) où V 0 est le potentiel de la surface et κ 1 est la longueur de Debye, longueur caractéristique de la double couche électrique ; effectivement le potentiel est écranté sur une distance λ D = κ 1. λ D est strictement équivalent à la longueur λ U que nous avons évoquée précédemment : elle fixe la portée de l interaction. Nous verrons par la suite que λ D donnée ci-dessous est la grandeur fondamentale dans le phénomène de diffusio-osmose : λ D = (8πl B c 0 ) 1/2 (A.6) Pour un sel monovalent à une concentration centimolaire en solution aqueuse λ D 3 nm. Revenons brièvement sur l hypothèse de champ moyen : les interactions ions-solvant. Ces dernières étant de type Van der Waals, à portée et amplitude très petites devant les interactions coulombienne ions-surface, il était justifié de les négliger ; les corrélations entre ions. En volume, la distance caractéristique ion-ion d ii est de l ordre de c 1/3 0 5, 5 nm pour un électrolyte centimolaire et près de la surface de l ordre de (c s 0 ) 1/2 où c s 0 désigne la densité surfacique d ions. On peut l estimer en considérant la double couche comme un condensateur plan (d où son nom) de capacité surfacique C = ɛ/λ D. La différence de potentiel appliquée est V 0 si on considère que le potentiel s amortit très vite [8]. Ainsi (c s 0 ) 1/2 = ɛv 0 /eλ D 1/2 3, 7 nm en prenant V 0 = 50 mv (c est l ordre de grandeur pour une surface de verre). Dans tous les cas d ii > l B sous nos conditions ce qui signifie que les ions sont davantage sensibles à l agitation thermique qu aux interactions mutuelles électrostatiques. Notre hypothèse de départ était donc justifiée. L étude de la double couche électrique sous les hypothèses que nous avons formulé nous a permis de déterminer la distribution des ions au voisinage de la paroi chargée et le potentiel électrique qui en découle. Ainsi nous avons tous les éléments pour connaître l énergie d interaction électrostatique ions-surface U(y) et sa portée λ D. 31

33 B Vitesse de diffusio-osmose. Notations et calculs développés. Cas général Il nous faut formuler les équations hydrodynamiques et les résoudre pour déterminer complètement la diffusio-osmose. Considérons un fluide, supposé incompressible et de viscosité η en volume, qui occupe le demi-espace y > 0 au-dessus d une surface plane placée en y = 0 (figure B.1). Pour simplifier nous allons étudier le cas d un soluté neutre à la concentration volumique c 0 dans le fluide. On note U(y) le potentiel d interaction entre le soluté et la surface. Dans la limite d une solution diluée, à l équilibre thermique la distribution du soluté est donnée par la distribution de Boltzmann. D autre part nous avons évoqué le fait qu une condition Fig. B.1 Vitesse de diffusio-osmose. nécessaire au phénomène de diffusio-osmose est l inhomogénéité de la concentration en soluté. On se donne donc un gradient de concentration dc 0 /dx dans la direction x. Si ce gradient est appliqué sur une distance grande devant la portée de l interaction U(y) (qu on notera λ U ), la concentration c et la pression p s équilibrent dans un temps plus court que le temps de relaxation du gradient. Ainsi [8], [4] : c(x, y) c 0 (x)e U(y) k B T (B.1) y p(x, y) + c(x, y)( y U(y)) = 0 (B.2) En combinant ces deux équations (B.1) et (B.2) on obtient alors l équation d équilibre osmotique : p(x, y) k B T c(x, y) = p 0 k B T c 0 (x) (B.3) où p 0 est la pression dans le liquide loin de la paroi. Ainsi on vient de montrer qu un gradient de concentration en soluté en volume est responsable près de la paroi (là où le potentiel d interaction est ressenti) d un gradient de pression. Ce même gradient de pression s équilibre avec les forces de viscosité (équilibre hydrodynamique) : x p(x, y) = y (η y v x ) (B.4) avec v x la vitesse du fluide. De manière évidente on voit ici que le gradient de concentration en soluté est responsable d une augmentation de la vitesse. On comprend donc comment et pourquoi l inhomogénéité de la distribution du soluté est nécessaire pour une mise en mouvement du fluide. Et puisque le phénomène n est possible qu à partir du moment où le soluté ressent cette l interaction, c est-à-dire près de la surface sur une épaisseur de l ordre de λ U (cf. équations (B.1) et (B.2), on comprend également que l interaction soluté-surface revêt une importance majeure. On intègre deux fois (B.4) en utilisant la condition aux limites classique v x (y = 0) = 0 et la condition aux limites y v x (y = λ U ) = 0. On extrapole cette dernière en y = 0 en supposant λ U très petit, définissant ainsi une vitesse de glissement effective du fluide que l on indice par s en référence au glissement (slip en anglais) : 32

34 v s = k BT η ΓLdc 0 dx (B.5) avec Γ une longueur qui mesure l excès de soluté à proximité de la paroi et L une longueur qui mesure la portée de l interaction du potentiel : Γ = + 0 [(e U(y) k B T 1]dy L = 1 Γ + 0 y[(e U(y) k B T 1]dy (B.6) Conséquences sur la vitesse de diffusio-osmose Nous avons vu que l amplitude de cette vitesse dépend entre autre des paramètres Γ et L. Ceux-ci sont typiquement de l ordre de λ D, ce qui montre encore une fois l importance de la longueur de Debye [8]. On peut alors réécrire la vitesse de diffusio-osmose avec D DO un coefficient de diffusion effectif en fonction de la longueur de Bjerrum : v s = k BT 8πηl B ln(c 0 ) = D DO ln(c 0 ) (B.7) Supposons que l on ait un gradient de concentration linéaire selon la direction x d un soluté à 10 2 mol.l 1 dans un canal de largeur h = 200 µm, connaissant la viscosité de l eau η = 10 3 Pa.s, la longueur de Bjerrum l B et la température T = 300 K on peut donner un ordre de grandeur de la vitesse de diffusio-osmose v s 1, 2 µm.s 1 dans le sens opposé du gradient de concentration. Notons au passage que D DO 2, m 2.s 1 correspond au coefficient de diffusion d une particule de diamètre 1,9 nm. Enfin remarquons que pour un soluté chargé, tel NaCl, il y a de plus certaines corrections à prendre en compte : le potentiel d interaction avec la paroi chargé est différent dans le cas d un soluté neutre par rapport à un soluté chargé. L expression de U(y) est plus compliquée ; dans le cas d un sel chargé NaCl, le soluté est l association de deux espèces Na + et Cl qui ont des coefficients de diffusion proches mais légèrement différents ce qui conduit à un terme supplémentaire dans l expression de la vitesse. La vitesse de diffusio-osmose s écrit alors [8], [4] : v s = k BT η [ ln(1 γ 2 ) β DΨ] 2πl B ln(c 0 ) (B.8) où Ψ est le potentiel Zeta (ζ) normalisé par k B T/e, γ = tanh(ψ/4) et β D = (D + D )/(D + + D ) mesure la différence de diffusivité entre anions et cations. Précisons que le potentiel Zeta est une grandeur mesurable, définie comme étant la valeur du potentiel électrique dans le fluide au niveau du plan de cisaillement où la vitesse s annule. Pour le verre plongé dans l eau ζ 50 mv. Certes l expression (B.8) est différente de la forme (B.7), mais elle reste du type v s = D DO ln(c 0) où D DO est un coefficient de diffusion effectif du même ordre de grandeur que D DO, ce qui justifie l étude de v s pour un soluté neutre : D DO = k BT η [ ln(1 γ 2 ) β DΨ] 2πl B (B.9) 33

35 C Obtention d un gradient linéaire statique de concentration et dynamique diffusio-phorétique de colloïdes Comme on vient de le voir dans la section 2.2.2, des colloïdes présents dans une solution présentant un gradient de sel se déplaceront non pas de manière purement diffusive mais avec une composante de la vitesse d origine diffusio-phorétique dans le sens du gradient de sel : v DP = D DO ln(c 0 ) où D DO >>D C. Ce phénomène a été observé avec une marche de concentration en sel à l aide d un système double canal : un canal d acheminement de sel de concentration fixée est mis au contact d un canal d acheminement en colloïdes en z=0 [3], [29]. Toutefois, puisque le gradient de concentration est alors concentré à l interface, le mouvement des colloïdes se fait sur une zone tout à fait restreinte et il est alors mesuré un déplacement de l interface. Pour remédier à cela et rendre l effet plus visible, il faut créer un gradient maîtrisé de concentration et spatialement étendu. Afin de rendre la mesure de la composante d origine diffusio-phorétique de la vitesse des colloides plus précise et facile, un gradient linéaire de concentration semble le plus adapté. En effet, la vitesse sera alors constante le long du gradient et une mesure en différents points sera possible ce qui facilitera considérablement la détermination de la vitesse par rapport à un «heavyside»de concentration, comme cela est le cas pour les configurations double canal. Une méthode couramment utilisée en microfluidique pour faire des gradients linéaires de concentration est la méthode de dilution multiple mise au point par Whitesides et al [32]. Cette méthode aboutit certes à un gradient de concentration linéaire contrôlé (la pente est modifiable avec la concentration des solutions mères) et stable dans le temps mais repose sur un écoulement : les différentes solutions filles de concentration proches sont réinjectées dans un «gros»canal microfluidique. Ces gradients linéaires sont donc par construction soumis à un courant convectif d écoulement qui peut fortement nuire à la mesure d un effet fin comme celui attendu grâce à la diffusion-phorèse des colloïdes (même si la composante diffusio-phorétique de la vitesse est attendue transverse au canal car colinéaire au gradient et la composante convective dans le sens de l écoulement). Ils rendent de plus le suivi optique à fort grossissement des colloïdes particulièrement périlleux puisqu ils sortent rapidement du champ d observation. Pour pallier les limites de ces systèmes à dilution multiple qui posent également des problèmes de suivi aux biologistes qui veulent étudier le phénomène de chemotaxis (capacité qu ont certaines bactéries à se déplacer dans le sens par le gradient de certains sels [33]), des systèmes microfluidiques à 3 canaux en gel ont été développés. Ces canaux présentent de tels gradients de concentration linéaire mais ne nécessitent pas d écoulement dans le canal d intérêt pour fonctionner. C.1 Principe du système à 3 canaux en gel Afin d obtenir un gradient linéaire de concentration en sel sans écoulement, nous avons mis en place un système microfluidique à 3 canaux en gel d agar inspiré de [34], [35]. Ce système microfluidique est composé ainsi (voir C.1 (a)) : 1. Un canal d approvisionnement en sel où s écoule une solution salée de concentration fixée constante égale à C 0 (à gauche sur le schéma). 2. Un canal de vidange où s écoule en permanence de l eau pure et de concentration saline nulle (à droite sur le schéma). 3. Entre ces deux canaux le canal d intérêt présentant le gradient de concentration dans lequel nous pourrons ensuite introduire colloïdes ou cellules afin d étudier leur mouvement en présence du gradient. 4. Entre ces 3 canaux, la matrice est faite de gel d agar. Les deux canaux latéraux sont soumis à un écoulement permanent, en concentration saline à C 0 pour G et d eau pure pour D grâce une arrivée de solution à une extrémité et un tuyau de vidange à l autre extrémité. Par conséquent les concentrations en sel des canaux de droite (D) et gauche (G) sont constantes et stationnaires. Le canal médian est lui rempli initialement d eau pure filtrée contenant 34

36 G D 400µm-250µm gel agar sens écoulement (a) (b) Fig. C.1 (a) Système 3 canaux en gel. La zone bleue représente la matrice de gel. Le canal G est approvisionné constamment en sel de concentration C 0. Le canal D est approvisionné en eau pure. Le canal central est le canal d intérêt. Il présente le gradient linéaire de concentration en sel mais ne présente pas d écoulement. Les colloïdes mis dans ce canal médian avant sa condamnation devraient se déplacer par diffusio-phorèse. (b) Sur cette image, il est introduit de la fluoroscéine (sel fluorescent) plutôt qu une solution saline simple dans le canal G, de l eau pure circulant dans le canal D. Intensité de fluorescence pour les 3 canaux après 10 minutes en unités arbitraires. (b) Profil d intensité extrait de (a). Le profil de concentration apparaît bien linéaire. Les très légers décrochements visibles correspondent au passage gel-eau. La diffusion n est que quasi libre, on voit ici que l on a légère accumulation de fluorescence en aval du gel et que par conséquent la fluoroscéine diffuse légèrement moins bien dans le gel (ici d agarose) que dans l eau. Figure extraite de [35]. les colloïdes dont on voudra mesurer la vitesse de diffusio-phorèse puis «condamné» : l eau ne s y écoulera pas. La matrice du système 3 canaux est un hydrogel (gel composé majoritairement d eau) poreux aux ions salins. La différence de concentration en sels entre les différents canaux qui peuvent «communiquer»grâce à la matrice de gel va provoquer un flux de sel entre les différents canaux d origine purement diffusif et sans écoulement de liquide d un canal vers l autre. Avec un tel système, les concentrations dans le canal d approvisionnement G en sel et dans le canal de vidange D étant stationnaires (grâce au renouvellement permanent du fluide dans ces 2 canaux) et sachant que les sels diffusent dans le gel d agar, on se retrouve donc à résoudre le problème de diffusion suivant (équation de diffusion stationnaire) pour le canal du milieu sans écoulement (et donc sans terme de transport convectif) C = 0 avec les deux conditions aux limites nécessaires pour boucler le problème qui sont les deux concentrations en sel des canaux G et D : C G = C 0 et C D = 0 La concentration en sel dans le canal médian est donc linéaire à gradient constant (voir fig. C.1 (b)) avec les conditions aux bords G et D qui prennent en compte la chute de concentration par diffusion à travers le gel (chute elle aussi linéaire lorsque le canal est en situation stationnaire). Ce dispositif a déjà été utilisé avec succès par [34], [35] pour obtenir un gradient de concentration linéaire dans le canal médian. Il faudra simplement prendre garde à ce que le soluté diffuse quasi librement dans la matrice de gel, c est à dire que la taille des pores du gel soit grande devant la taille du soluté (maillage lâche). Si l on met alors une solution dénuée des sels que l on utilise dans le canal G mais contenant des colloïdes dans le canal du milieu et qu on le condamne, c est à dire que l on coupe l arrivée et la sortie de tout liquide pour ce canal, ces colloïdes en l absence de tout gradient auront un comportement brownien peu marqué en raison de leur taille de quelques micromètres, c est à dire un coefficient diffusif «faible». En revanche lorsque l on créera le gradient de concentration en sel dans ce canal grâce à un écoulement dans les canaux G et D, le soluté jouera le rôle de remorqueur (voir section 2.2.2) et il en devrait y avoir une vitesse de diffusio-phorèse transverse, colinéaire au sens du gradient de sel pour les colloïdes présents dans le canal d intérêt et un coefficient de diffusion apparent très grand devant celui donné par la relation de Stokes-Einstein à l équilibre. 35

37 C.2 Réalisation expérimentale Les microcanaux sont moulés à partir d un masque négatif photolithographié. Le gel utilisé est un hydrogel d agar 5% en agar (appelé E406 dans l industrie agro-alimentaire et obtenu à l aide d algues rouges) et 95% d eau pure filtrée. Le mélange est alors agité et chauffé au bain marie. Au bout de quelques minutes il franchit sa température de gélification et le mélange de trouble devient transparent. Cette concentration est obtenue en faisant une solution d agar à 2% agitée et chauffée pour transiter vers sa phase gel dont on laisse ensuite l eau s évaporer partiellement pour atteindre une concentration de 5%. En revanche avec des concentrations initiales plus grandes en agar (entre 3 et 5% en masse) la température de gélification devient trop élévée et le gel prend en masse même sous agitation et chauffage avant même son moulage... Cette concentration de l hydrogel a été choisie afin que la taille des pores du gel soit très grande devant celle des sels et ne nuise pas à leur diffusion par conséquent quasi libre dans le gel tout en maintenant une certaine rigidité à la matrice de gel dans laquelle va être moulé le circuit microfluidique. Avec une telle concentration en agar, les pores font une taille entre 50 et 75 nm [36], ce qui est très grand devant la taille des ions tout en offrant au gel une bonne résistance mécanique. Puisque la diffusion des ions est attendue comme quasi libre, la matrice de gel pourra alors être d épaisseur supérieure à la profondeur des canaux sans nuire aux conditions aux limites et au gradient de concentration. Par conséquent, afin d améliorer la résistance mécanique des microcanaux moulés en gel nous avons réalisé des films de gel de 1mm d épaisseur. Cette diffusion libre n est attendue qu à la condition que le gel d agar n intéragisse pas électrostiquement avec les ions de sel qui diffuseront au travers. D après la littérature, ceci est le plus souvent le cas mais dans certains cas particuliers avec des espèces très chargées (morceaux d ADN), il peut arriver que le gel intéragisse ce qui met bien entendu à mal l hypothèse de diffusion libre. Il faudra voir dans le cas de notre système si la diffusion est bien libre. Les canaux fabriqués font 120 µm de profondeur. En revanche différents jeux de largeurs de canaux et de gel entre les canaux ont été réalisés afin de faire varier la pente du gradient en concentration (qui est en 1 2l+L où L est la largeur du canal médian et l est largeur de gel entre 2 canaux. Nous avons réalisé des masques avec les dimensions suivantes [L,l] (en microns) : [400, 250], [400, 125], [300,250], [300, 125]. Protocole : Afin de contrôler l épaisseur du film de gel réalisé, un cadre (ou «spacer») de 1mm de polydiméthylsiloxane (PDMS), polymère plastique assez souple et résistant, est mis autour du circuit microfluidique à mouler. Afin de faciliter le démoulage, les bords du cadre sont biseautés. Une goutte de 1ml de la solution d agar liquide est alors déposée sur le «positif»des canaux à l intérieur du spacer. Une plaque de verre hydrophile de 170 microns est alors déposée sur le cadre et est maintenue pressée 2 minutes afin de permettre à l agar de gélifier en prenant la forme des canaux. Le système (matrice de gel moulée ; spacer ; plaque de verre) est alors démoulé d un seul tenant, ce qui est crucial pour éviter des fuites par la suite. La plaque de verre mise est alors retirée et une nouvelle plaque de verre hydrophile est posée sur l autre face (au contact des canaux moulés). Elle est posée face vitrée sur la plaque métallique du montage C.2. Une plaque de plexiglas est alors posée délicatement sur le tout et des vis sont serrées pour permettre l étanchéité du système. Le système est hydraté en permanence car toute déshydratation provoquera une contraction du gel et des fuites désastreuses pour la suite. Il reste alors à faire la connectique afin de permettre l écoulement dans les canaux G et D et injecter les colloïdes dans le canal médian. C.3 Résultats expérimentaux Le montage permettant le serrage uniforme et l étanchéification du canal a été fait durant le stage. Il a ainsi été permis après moulage d y mettre des canaux. Malheureusement nous ne sommes pas encore parvenus à réaliser la connectique entre le milieu extérieur et les canaux. En effet, il faut planter dans le gel de petits tubes métalliques connectés par des tuyaux à des réservoirs. Cependant, le montage précédent ne prévoyant rien pour tenir ces tubes, le gel à leur base finit par céder du fait de la tension exercée par les tuyaux extérieurs. Nous n avons donc pas pu injecter de la fluoroscéine dans l un des 36

38 canaux pour ve rifier la line arite de notre concentration en sel a travers notre syste me tri canal en gel. Un nouveau syste me de serrage permettant une mise en place plus aise e de la connectique est en cours de re alisation et fera l objet de prochains tests. (a) (b) Fig. C.2 Montage utilise pour permettre l e tanche ification et l observation du circuit microfluidique a 3 canaux en gel. La partie infe rieure est compose e d une feuille me tallique ajoure e pour permettre le passage d un objectif a fort grandissement (40x ou 60x) et a distance de travail re duite. La plaque supe rieure est une plaque de plexiglas e paisse. Elle est serre e avec un grand nombre de vis afin d avoir une pression uniforme sur tout l e chantillon et permettre au syste me d e tre e tanche. Le syste me est en permanence hydrate a l aide d eau laisse e dans les trous oblongues afin d e viter toute contraction du gel qui conduirait a des fuites. 37