Transcription

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3 Biopuces à tous les niveaux moléculaires Chromatine ADN Puces SNP Puces CNV ChIP-chip transcription ARN AAAAA traduction Puces à ADN Puces à exons Puces de couverture (Tiling-array) Protéine Puces à anticorps Puces à protéines Puces à tissus

4 Biopuces Différents types Sondes Cible Publication Transcriptome ADN ARN Schena et al. Science (1995) 270: Tissue-array Tissus Anticorps Kononen J. (1998) Nat. Med. 4: Fonction Protéines Ligands Zhu et al. Nature Genet (2000) 26: Protéome Anticorps Protéines De Wildt et al. Nature Biotech. (2000) 18: Fonction Cellules & Plasmides Ligands Ziauddin & Sabatini Nature (2001) 411: Interactome Protéines Protéines Zhu et al. Science (2001) 293:

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7 Puce à ADN Principe Matrice de sondes Echantillon marqué hybridation Mesure

8 Puces à ADN Applications Sondes Cible Publication Criblage de banques Transcriptome Oligo fingerprinting Reséquençage Phénotypage SNP CGH DNA-BP Suivi de réplication Détection de gènes ChIP-chip Validation de gènes ADN ADN ADN Oligo ADN Oligo ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN Gress TM et al. (1992) Mam. Genome 3: ARN Schena et al. (1995) Science 270: Oligos Drmanac S. et al. (1996) Genomics 37: ADN Kozal MJ et al. (1996) Nat. Med. 2: ADN Gingeras et al. (1998) Genome Res. 8: ADN Winzeler et al. (1998) Science 281: ADN Pollack JR. (1999) Nature 23: Protéines Bulyk et al. (1999) Nature Biotech. 17: ADN Khodursky et al. (2000) PNAS 97: ARN Penn et al. (2000) Nature Genet. 26: ADN Iyer et al. (2001) Nature 409: ARN Shoemaker et al. (2001) Nature 409: Taille des ARN ADN ARN Hurowitz et al. (2003) GenBiol 5: R2

9 Génotypage CNV: Copy-Number Variation

10 Del(7q)

11 Bacille Calmette-Guérin Behr et al. (1999) Science 284: A partir d une souche sauvage, et après 230 passages en culture (entre 1908 et 1921) isolement d une souche à virulence réduite mais ayant gardé son immunogénicité). A cause de l impossibilité de congeler les souches, les différents lots mondiaux en 1960 avaient plus de passages de différences. Mycobacterium bovis Caractérisation de souches Phénotypage

12 Puce de phénotypage Une souche de virus de la grippe caractérisé par ses variants d Hémagglutinine et de Neuraminidase: HxNy

13 Puce SNP SNP: Single Nucleotide Polymorphism Un SNP est un point de polymorphisme du génome, donc une mutation. Pour un SNP donné, on synthétise 2 oligonucléotides ayant la séquence connue et les 2 bases possibles en position centrale. GCGAATCGAGATAA G ATGGACCCGTGCTAA ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG On hybride la puce constituée de ces oligonucléotides avec l ADN d un individu. ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG Individu Homozygote G Individu Homozygote A Individu Hétérozygote A et G Génétique à haute résolution

14 Diagnostic génétique

15 Puce de reséquençage Pour toutes les positions à reséquencer, on synthétise 4 oligonucléotides ayant la séquence connue et les 4 bases possibles en position centrale. GCGAATCGAGATAGATGGACCCGTGCTAA ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATATATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATACATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG TCGAGATAGATGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGTTGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGCTGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGGTGGACCCGTTGGACCCGT CGAGATAGAAGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGATGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGACGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGAGGGACCCGTGGGACCCGTG A T C G On hybride la puce constituée de ces oligonucléotides avec l ADN d un individu. GCGAATCGAGATAAATGGACCCGTGCTAA On lit directement la séquence

16 Amplichip CYP450 Reséquençage pour adapter le traitement Pharmacogénomique Vendre le traitement et le diagnostic qui justifie le traitement. Médecine personnalisée

17 Puce à ADN Transcriptome Matrice de sondes ARN marqués hybridation Transcriptome

18 Puces à ADN propriété mesurée Espèce hybridée marn marn marqués in situ (pulse) marn marqués in situ (pulse- chase) marn mrna liés aux polysomes mrna liés aux membranes mrna liés aux polysomes mitochondriaux Propriété mesurée Transcriptome Taux de transcription Taux de dégradation Référence Schena et al. (1995) Science 270: Taux de dégradation Wang et al PNAS 99: Taux de traduction Localisation subcellulaire Localisation subcellulaire Johannes et al PNAS 96: Diehn et al Nature Genetics 25: Marc et al EMBO reports 31 (21)

19 Localisation membranaire Diehn et al. (2000) Nat. Genet. 25: 58-62

20 Lymphomes B à petites cellules Thieblemont et al. (2004) Blood 103: Profil d expression Signatures diagnostiques SLL MZL SLL MCL MCL MZL SLL MCL MZL L-selectin AKT1 GST

21 Cancer du sein Signatures prognostiques

22 Cancer of Unknown Primary 95% de prédiction Signatures diagnostiques mais surtout choix du traitement le plus adapté

23 Diagnostic - Pronostique Problème des pays émergents!!!

24 ChIP-chip Iyer et al. (2001) Nature 409: Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et hybridation sur puce à ADN (chip) Identifier tous les sites de fixation d un facteur de transcription sur la chromatine Comprendre les mécanismes de régulation

25 Qualité de l eau

26 Groupes sanguins 99,8% de spécificité contre 97% aux techniques classiques Coût réduit

27 Les concurrents Spectrométrie de masse 10 puces SNP 6.0 Très faible coût Avantageux pour de nombreux échantillons

28 Les concurrents Séquençage Pas besoin de connaître le génome, ni même l organisme Métagénomique Prix Gènes faiblement exprimés séquence absente en CNV

29 Séquençage / reséquençage CIMNA: immunomonitorage idem avec puces? Pays émergents