Les acides nucléiques

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1 acide nucléiques 1 Les acides nucléiques I) Structure. 1) Structure primaire, composition Les acides nucléiques sont des polymères constitués d un enchaînement d unité structurales, les nucléotides. Chaque nucléotide contient une base, un sucre et un groupement phosphate. Les bases : la base peut être soit une purine soit une pyrimidine. H noyau purique H 2 Adenine (6 amino purine) Guanine (2amino 6oxy purine) noyau pyrimidique H 2 Cytosine 2oxy 4amino pyrimidine CH 3 Uracile Thymine 2-4 dioxy pyrimidine 2-4 dioxy 5methyl pyrimidine Seules les bases adénine, guanine, cytosine et thymine sont présentes dans l AD ; dans l AR la thymidine est remplacée par l uracile. n peut se demander pourquoi on observe une telle différence, pourquoi n'y a t-il pas d'uracile dans l'ad?

2 acide nucléiques 2 H A U---- mutation ----C G---- Désamination oxydative ----C U---- réplication ----C G---- La désamination oxydative de la cytosine la transforme en uracile. Ce qui dans l AD est à l'origine d'une mutation puisque l uracile s hybride à l adénine et non à la guanine comme la cytosine. Comme il n y a pas d uracile dans l AD, cette mutation est reconnue par les enzymes de réparation et l uracile est corrigée en cytosine. S'il y avait de l'uracile dans l'ad, la mutation serait reconnue puisqu il y a une uracile en face d une guanine, mais les enzyme de réparation ne sauraient quelle base modifier. Mais alors pourquoi l AR possède t-il de l'uracile et non de la thymine? La synthèse de la thymine demande plus d'énergie que la synthèse de l'uracile puisqu il y a une méthylation en plus. Le changement de l uracile en thymine dans l AR est sans conséquence grave, ce n'est pas une mutation. Il y a aura peut être quelques protéines mutées pendant un temps court. En effet il y a plusieurs molécules d AR pour un même gène, cet AR a une durée de vie limitée, et le changement ne sera pas transmissible. le ribose et le désoxyribose 5' 5' H C H H C H 4' 3' 1' 2' 4' 3' 1' 2' H H H H Pour la numérotaiton, un prime a été ajouté pour distinguer les atomes des sucres, des atomes des bases. Cette numérotation est importante puisqu elle permet l orientation des polymères. n va en effet distinguer les extrémités 5 et 3. Ribose Deoxyribose Pourquoi y-a-t-il du désoxyribose dans l AD et du ribose comme dans l'ar? - le désoxyribose permet une meilleure stabilisation de l'hélice - il permet une différence avec le RA qui doit être dégradé (régulation de l'expression), les deux molécules ont des différences et sont dégradées le plus souvent par des enzymes différentes, les RAses ou les DAses. Le phosphate Il confère la propriété d'acide aux acides nucléiques Il confère la solubilité des acides nucléiques dans l'eau

3 acide nucléiques 3 L association de la base, du sucre et du phosphate constitue un ribonucléotide phosphate ou un désoxyribonucléotide phosphate selon le sucre. Le précurseur de la polymérisation est un nucléotide triphosphate. n identifie les phosphates par les lettres α, β et γ. Cette nomenclature est surtout utile lorsqu on va utiliser des isotopes radioactifs du phosphore pour identifier quel phosphore est marqué. - H 2 P P P g b a CH 2 H H nucléotide (ATP) omenclature base nucléoside nucléotide (base + sucre) (base + sucre + phosphate) Adénine désoxyadenosine damp (désoxyadenosine monophosphate) adénosine AMP dd AMP didésoxyadénosine monophosphate guanine désoxyguanosine dgmp cytosine désoxycytidine dcmp thymine thymidine dtmp uracile uridine UMP

4 acide nucléiques 4 5' CH 2 Base Le phosphate permet la polymérisation par liaison phosphodiester entre les carbones 3' et 5' du sucre. De ce fait les polymères sont orientés. n a une extrémité 5 et une extrémité 3. Cette orientation est importante car les enzymes qui catalysent cette polymérisation, les polymérases, synthétisent toujours de 5 vers 3. Certaines enzymes de dégradation, les nucléases, qui attaquent par une extrémité, les exonucléases, attaquent soit du côté 5 soit du coté 3 soit des deux cotés. - 3 P CH 2 Base - P CH 2 Base Modification des bases: Les 5 bases AGCT et U sont incorporées dans les polymères AD ou AR mais on peut en trouver d'autres qui correspondent à des modifications postérieures à la polymérisation Méthylation Exemple: la 5 methylcytosine peut se substituer à la cytosine de l'ad chez les eucaryotes, cette méthylation se situe à proximité d'une guanosine 5'C-G3'. Ces groupes méthyle n'affectent pas la capacité des bases qui les contiennent à former des liaisons hydrogènes. Ils sont ajoutés après la synthèse de l'ad et sont généralement associés avec des régions silencieuses du chromosome. Cette méthylation est très variable selon les espèces, 20% des cytosines sont méthylées chez les plantes alors que la méthylation est pour ainsi dire absente chez la drosophile. rôle : - dans la transcription. L'AD hyperméthylé n'est pas transcrit. La méthylation étant dans ce cas tissu spécifique, elle intervient dans la différenciation cellulaire. - dans la réparation de l'ad : lors de la réplication de l'ad il y a une correction des épreuves. Après avoir détecté un mésappariement, la reconnaissance du brin matrice se fait parce que ce brin est méthylé. - dans la protection contre des DAse de restriction. Ces DAses sont fabriquées par les bactéries pour dégrader les virus qui les infectent (phages). Ces DAses de restriction reconnaissent des séquences particulières sur l'ad, mais si elles digèrent l'ad du phage, elle seraient normalement capables de digérer l'ad bactérien. Pour éviter cela, certaines bases de l'ad bactérien sont méthylées aux sites de reconnaissance par la DAse de restriction.

5 acide nucléiques 5 Il existe des bases modifiées dans les AR, par exmeple dans les AR de transfert ou dans l'ar ribosomique. Ces maturations proviennent de maturation post-transcriptionelles, les bases sont incorporées non modifiées lors de la synthèse de l'ar, puis dans un deuxième temps elles sont modifiées. Ces modifications sont spécifiques, on trouve toujours les mêmes aux mêmes endroits. La séquence des bases sur l'ad. Le désoxyribose et l'acide phosphorique sont les mêmes tout au long de l'ad. Il n'en est pas de même pour les bases. Il y a un ordre, une séquence de bases caractéristique de chaque AD. Convention d'écriture 5' AGCT...3' (5' se réfère à la numérotation des atomes sur le désoxyribose) 2) Structure secondaire L'hélice d'ad L AD est constitué de deux brins antiparallèles, l extrémité 5 d un brin correspond donc à l extrémité 3 de l autre. A l'extérieur on trouve le squelette désoxyribose-phosphate qui confère à l AD sa solubilité dans l eau. A l'intérieur on trouve les bases perpendiculaires à l'axe de l'hélice (ressemble à un escalier en colimaçon). Les bases contribuent à la stabilité thermodynamique de la double hélice de 2 manières : grâce aux liaisons hydrogènes entre les bases grâce aux liaisons hydrophobes dues à l interaction entre deux bases consécutives. L hélice est dextrogyre, chaque base est positionnée avec une rotation de 36. Il y a 10 bases par tour, cette forme a été appelée B. Mais si on mesure le nombre de bases par tour dans l AD d une cellule, il y en a 10,4 au lieu des 10 prédites par le modèle. Il existe donc d'autre forme d'hélice type bases par tour sens B 10 dextrogyre A 11 dextrogyre C 9.33 dextrogyre Z 12 levogyre La forme Z existe dans un polymère où il y a alternance purine-pyrimidine, on la rencontre in vitro dans certaines conditions (haute concentrations en sel). Il a été possible d'obtenir de l'ad sous forme Z dans certaines conditions physiologiques, par exemple en méthylant les nucléotides et récemment on a des évidences de son existence in vivo en utilisant des anticorps spécifiques de la forme Z et qui ne reconnaissent pas la forme B Ces différentes formes ont une importance in vivo. En effet, les protéines qui se lient à l'ad sont le plus souvent spécifiques de la conformation.

6 acide nucléiques 6 AGCGGUCGAUCGAGCAUCGACGAUCGCGGGAU Les acides nucléiques simples brins, tel que les AR forment aussi des structures secondaires s il y a des bases complémentaires. n obtient des structures secondaires en tige boucle. Dans ce cas on obtient aussi des hélices. Mais ces hélices sont différentes des hélices de l'ad. Cette différence de conformation entre les hélices d'ad et d'ar est utilisée par les protéines qui intéragissent avec les acides nucléiques: les protéines qui interagissent avec l'ad ne reconnaissent pas l'ar et vis versa. A U C C G G A A G C C G U A A=U G C C G --AGCGGU CGGGAU-- 3) Le surenroulement l'ad est généralement surenroulé La double hélice représente l'ad comme une molécule linéaire avec les deux extrémités libres. Mais in vivo, l'ad n'a pas d'extrémité libre et est en fait circulaire, soit le génome est petit (exemple : le génome de certains virus, les plasmides) soit en général, il est constitué de plusieurs boucles. Ce superenroulement est visible en microscopie électronique, il entraîne un compactage de l'ad. Comme il est plus compact, il affecte la migration de l'ad en gel ou en gradient isopycnique (voir plus loin). Il peut être aboli si on fait une coupure sur un des deux brins (forme relaxé). In vivo le superenroulement est contrôlé par des enzymes qui introduisent le superenroulement, ce sont les topoisomérases. Des mutations qui affectent l'activité de ces enzymes ont été trouvées chez la bactérie, ce qui généralement affecte leur vitesse de croissance. Topoisomérase I : coupure d'un brin et resoudure, ils suppriment les supertours (sous tension ) vers une forme relaxé (sans tension). Il y a coupure du brin de DA-liaison phosphate libre du DA et une tyrosine du site actif de l'enzyme (conservation de l'énergie de la liaison phosphate). Les brins tournent puis il y a resoudure. Cette enzyme agit entre autre en amont de la fourche de réplication pour retirer les supertours positifs générés par la séparation des deux brins. Topoisomérase II ou gyrase: coupure des deux brins et surenroulement négatif. Exemple la gyrase établit un supertour négatif. La réaction est couplée à l'hydrolyse de l'atp. Gyrase reverse : la topoisomérase introduisant un supertour positif (gyrase reverse) a été trouvé chez les archaeobactéries qui vivent à 80 C.

7 acide nucléiques 7 Rôle et intérêt du surenroulement : Le DA surenroulé négativement est vrillé, il est donc plus compact que son équivalent circulaire relâché (E. coli mesure 1 µ de large et 2 de long, l'ad qu'il contient mesure 1560 µ). Toutefois ce n'est pas le seul moyen de compactage des acides nucléiques. Il est possible que le surenroulement négatif aide à séparer les deux brins, ce qui est important pour initialiser la réplication ou pour la transcription. Le surenroulement entraîne une structure secondaire qui affecte la reconnaissance des protéines, certains promoteurs ne sont efficace que si l'ad est sous forme sur enroulée. Le rôle des enzyme permettant le surenroulement positif est plus énigmatique, il semble qu'il permette la régulation des gyrases entraînant le surenroulement négatif. Dans certains cas, comme les archaeobactéries vivant à 80 C, elles joueraient sur la stabilité de l'ad qui autrement serait dénaturé à cette température. II Dosage et purification 1) Dosage. n peut doser les acides nucléiques grâce à l'absorption des bases en UV au alentour de 260 nm AMP: ε259 = M -1 cm -1 GMP: ε 253 = M -1 cm -1 CMP: ε 271 = M -1 cm -1 TMP: ε 267 = M -1 cm -1 UMP: ε 262 = M -1 cm -1 ε moyen à 260 nm est égal à M -1 cm -1. D = ε *C* l = C*l (C est en M) comme on travaille généralement avec des cuves de 1 cm D = 10 4 * C. Les nucléotides ne sont pas libres mais associés en polymères, la concentration en mole litre -1 n a donc pas beaucoup de sens, on préfère l exprimer en gramme par litre. Sachant que le poids moléculaire moyen d un nucléotide est égal à 300. D = 10 4 *C / 300 (avec C en g/l) n ne travaille pas avec des litres mais des millilitres. Dans ce cas D = 10 4 * C /300 (avec C en mg/ml) et pour simplifier D = 10 C /300 = C/30 (avec C en µg/ml) Une concentration de 30 µg/ml donne 1 D pour des acides nucléiques sans structure secondaire par exemple pour un oligonucléotide Mais lorsqu il y a des structures secondaires, ce n'est pas vrai. Si on fait la mesure on s aperçoit que 1 D ne correspond pas à 50 µg/ml pour l AD et 1 D correspond à 40 µg/ml pour l'ar. C est

8 acide nucléiques 8 normal si on se souvient qu'il y a une interaction entre les bases dans les structures secondaires de l'ar ou dans la double hélice. En effet à 260nm on ne dose pas l'ad ou l'ar mais les bases (AR et AD, et nucléotides), lorsqu elles sont en interaction, elles absorbent moins. Les protéines absorbent à 280 nm (ε trp = 5600 et ε tyr = 1200), si bien qu'on considère que si le rapport A280/A260 = 0.5, la solution est dépourvue de protéines. Les acides nucléiques peuvent aussi être dosés grâce à des colorants, un des plus utilisés est le bromure d éthidium qui s intercale entre les bases et qui émêt dans le rouge lorsqu il est excité par un rayonnement UV. Il colore l AD mais aussi les acides nucléiques simple brin tel que l AR. 2) Purification Les acides nucléiques sont de tailles très variables, La taille varie de celle d un AR de transfert à celle de l'ad chromosomique. Ils sont solubles dans l'eau mais pour les molécules de grande taille, il y a formation d'un gel. Le fractionnement cellulaire. Homogénat acides nucléiques totaux Le fractionnement cellulaire peut être utilisé pour purifier les acides nucléiques en fonction de leur localisation dans la cellule. n utilise la centrifugation différentielle. La technique consiste à purifier un composant de la cellule puis à extraire les acides nucléiques qu il contient. Au aura donc avec un constituant l ensemble des acides nucléiques qu il contient. Par exemple avec les mitochondries, on aura l AD mitochondrial, mais aussi les AR ribosomiques, les AR de transfert et les AR messagers présents dans la mitochondrie lors de la purification. surnageant surnageant 10 mn, 700g culot = noyaux 10 mn, g culot = mitochondries, chloroplastes 60 mn, g surnageant acides nucléiques nucléaires (AD, AR nucléaires, préar) acides nucléiques des organelles AR messagers, AR de transfert Pour solubiliser les cellules, il faut casser la membrane, on utilise des tensioactifs qui s'insèrent dans la membrane, l'isotonie (on fait gonfler la cellule jusqu'à l'éclatement, des moyens mécaniques (potter) et pour les bactéries on doit en plus solubiliser la paroi ce qui peut se faire à l aide d une enzyme (lysozyme). Séparation des acides nucléiques des protéines culot = ribosomes AR ribosomiques et ARm en cours de traduction In vivo, les acides nucléiques, indépendamment de leur nature ou de leur origine, sont en constante interaction avec des protéines. Par conséquent, dans toutes les préparations d acide nucléique, il est indispensable de détruire les interactions acides nucléiques-protéine et ensuite d éliminer ces dernières. n utilise couramment des dénaturants protéiques tels que le SDS (sodium dodecyl sulfate) et les sels de guanidinium. Ces composés rompent les interactions protéines-acides nucléiques comme les

9 acide nucléiques 9 interactions faibles responsables de la structure tertiaire des protéines. Les protéines sont donc détachées des acides nucléiques et dénaturées. L élimination des protéines peut ensuite se faire par une extraction à l aide de solvants organiques. n utilise généralement le phénol ou (et) le chloroforme qui ne sont pas miscibles à l eau. Les acides nucléiques ne sont pas dénaturés par ces solvants organiques, par contre les protéines sont dénaturés et précipitent. + 1/2 volume phénol + 1/2 volume chloroforme centrigugation 10 mn g phase aqueuse (ac. nucléiques) interface (protéines précipitées) phase organique Traitement enzymatique : pour éliminer les protéines on peut aussi utiliser des protéases telles que la protéinase K. Cette protéase reste active dans une solution à fort pourcentage de SDS (tensioactif dénaturant de la plupart des protéines, et donc les DAses qui pourraient dégrader l AD). Pour purifier sélectivement l'ad on peut faire un traitement à la RAse (purifiable des DAse par la chaleur). Pour purifier les AR on peut utiliser des DAse purifiée mais en fait il est difficile d'être sûr qu'il ne reste pas des traces de RAse. Chromatographie : La purification peut se faire aussi sur colonne. n peut utiliser des gels d échange d'anion puisqu on purifie des acides, on accroche les acides nucléiques par leur charge et on les décroche par la force ionique. n peut aussi utiliser des colonnes de silice ou de magnétite, les acides nucléiques s accrochent sur ces composés et peuvent être décrochés par l éthanol. Concentration des acides nucléiques : Précipitation à l'éthanol: il y a des molécules d'eau autour des acides nucléiques, on peut donc jouer sur les phénomènes d'hydratation des macromolécules en rajoutant de l'alcool à 70% en présence d un sel monovalent. Le sel a pour fonction de rentrer en compétition avec les molécules d eau. En présence d alcool, les acides nucléiques liés au sel, précipitent d'autant plus facilement que la molécule est importante. Cette précipitation a pour avantage de concentrer la solution et de pouvoir changer le solvant et ainsi d éliminer les petites molécules telles que les nucléotides libres.

10 10 - La centrifugation (isopycnique ou zonale). le principe est de séparer l'ad des autres composants par leur densité (Centrifugation isopycnique ) ou par leur masse (centrifugation zonale). La centrifugation isopycnique, Si on ajoute une solution de chlorure de césium dans un tube et qu on le fait tourner dans une ultracentrifugeuse pendant 24 heures à g, il se forme un gradient de densité. Si à la solution de chlorure de césium, on rajoute l extrait biologique, les macromolécules vont s équilibrer avec le gradient. Il s agit donc d une centrifugation à l équilibre, lorsque les particules atteignent leur densité de flottaison, elles arrêtent de migrer à l intérieur du gradient quel que soit le temps de migration ; les macromolécules ne migrent pas nécessairement du haut vers le bas du tube, les moins denses migrent du bas vers le haut Cette centrifugation est utile pour séparer les protéines (les moins dense), l AD et l AR (le plus dense) mais elle ne permet pas de séparer deux molécules d AR de taille différente, elles ont en effet la même densité. acide nucléiques Protéines AD linéaire AD surenroulé AR Centrifugation isopycnique CsCl + Bromure d éthidium La centrifugation isopycnique permet en outre de séparer l'ad surenroulé de l'ad linéaire ou relaxé. Pour ce faire on intercale entre les bases une molécule telle que le bromure d'ethidium. l'incorporation du bromure d'éthidium diminue la densité de l'ad. Comme on incorpore moins de Bromure d'éthidium dans l'ad surenroulé que dans l AD relaxé, la densité de l AD surenroulé est plus importante que la densité de l AD linéaire. De plus le bromure d'éthidium est fluorescent : lorsqu'on l'excite en UV il émet dans le rouge, de ce fait on peut le voir. H 2 + CH 2 CH 3 Bromure d ethidium Br - La centrifugation zonale permet de séparer des macromolécules de la même famille en fonction de leur masse. n séparera par exemple différentes protéines ou différents AR ou encore des complexes ribonucléoprotéiques. L échantillon est déposé en haut du tube et les molécules sédimentent vers le fond d autant plus rapidement que leur masse est importante. Contrairement à la centrifugation isopycnique, le temps a de l importance. Si on centrifuge trop longtemps, toutes les molécules se retrouvent au fond du tube. La centrifugation zonale permet de calculer une vitesse de sédimentation (l unité est le Svedberg, S). Pratiquement, on utilise un milieu dense pour ralentir les molécules, soit du saccharose, soit du acl, qu on peut au besoin déposer en gradient pour augmenter la résolution. Electrophorèse:

11 acide nucléiques 11 Cette méthode est utilisée pour séparer différentes molécules appartenant à la même classe. n sépare ainsi les protéines, les AR ou des morceaux d'ad selon leur masse et leur charge. Dans le cas des protéines, on utilise soit des conditions dénaturantes, en présence de SDS, les protéines sont séparés en fonction de leur taille, soit des conditions non dénaturantes. Dans ce dernier cas les protéines migrent à une vitesse qui dépend de leur charge et de leur masse. Les acides nucléiques portent une charge globale négative et la séparation s effectue uniquement selon la masse. Dans un champ électrique, il vont migrer vers l'anode. Sa vitesse de migration peut être contrôlée en le faisant migrer dans un gel avec des mailles plus ou moins serrées, ces mailles vont plus ralentir les fragments les plus gros, les plus encombrants. Pour fabriquer les mailles, on utilise deux sortes de gel : soit des gels d'agarose soit des gels de polyacrylamide. L'agarose est extraite d'algues, c'est un polymère dont la structure de base est Dgalactose-3,6 anhydrolgalactose. L'acrylamide est un monomère, en présence de radicaux libres (en général persulfate d'ammonium stabilisé par le TEMED), une réaction en chaîne est initialisée et on obtient un polymère. Si la réaction est faite en présence de. CH 2 CH 2 CH C H CH 2 H C CH 'méthylenebisacrylamide, on a formation d'un réseau de maille plus ou moins serrées en fonction de la concentration de l'acrylamide. C H 2 CH 2 + persulfate d'ammonium + temed CH C H 2 CH CH CH CH CH CH C C H H 2 2 Bis acrylamide l'ad migre en fonction de sa taille, les fragments les plus petits migrant le plus rapidement. Le gel d'acrylamide permet de séparer des fragments de 50 bp à 1 kb et le gel d'agarose permet de séparer des fragments de 0.5 à 40 kb. De plus on peut jouer sur les concentrations d agarose ou d acrylamide. Par exemple pour séparer des petits AD de 5-30 nucléotides on utilisera un gel à 20% d'acrylamide et pour des AD de nucléotides un gel à 5% d'acrylamide.

12 acide nucléiques 12 Il ne faut pas oublier qu'un génome de mammifère est de l'ordre de 10 9 bp, celui d'un phage ou d'un plasmide de l'ordre de quelques kb ou quelques dizaines de kb. n ne séparera sur gel que des fragments dépot 20 kb d'ad et non le génome complet. AD 2kb Migration - l'ad surenroulé, linéaire et circulaire ne migre pas à la même vitesse dans les gels en fonction du courant et de la force ionique du tampon. - n peut utiliser des gels non dénaturants pour la séparation et la 1 : génome eucaryote non digéré 2 : génome eucaryote digéré par une enzyme de restriction 3 : plasmide non digéré (forme surenoulée) 4 : plasmide digéré, une seule coupure 5 : plasmide digéré, deux coupures 6 : Phage λ coupé, plusieurs coupures 7: AR ribosomiques 8: AR de transfert 9: AR messagers 10: AR totaux (ribosomiques, messagers et de transfert) purification des fragments d'ad double brin mais aussi des gels dénaturants. Dans ce cas, le gel est polymérisé en présence d'un agent qui supprime l'appariement des bases (voir plus loin) par exemple l'urée, ou moins fréquemment la formamide - n peut modifier la migration de l'ad en jouant y accrochant des protéines (gel retardation). Cette méthode permet de montrer par exemple qu une protéine donnée se fixe sur un fragment d AD. + - Pour isoler des chromosomes on dispose d'une autre technique: le champs pulsé. Dans ce cas, on alterne régulièrement le sens du courant tout en privilégiant le sens de migration. - sens du courant + temps Exemple d utilisation de la centrifugation zonale et de l électrophorèse

13 n digère une préparation de chromosome par une DAse. Et on fait soit une digestion ménagée soit une digestion totale. Les extraits sont analysés par centrifugation zonale. n extrait l AD des pics absorbants à 260 nm et on le soumet à une électrophorèse. Dans le cas de la digestion ménagée on observe qu il existe des points de sensibilité à la DAse tous les 200 bases. Dans le cas de la digestion totale, on observe que 143 bases sont totalement protégées. n peut conclure de cette expérience que des nucléosomes sont espacés toutes les 200 paires de bases et sont constitués de protéines (les histones) et d un AD de 143 paires de bases. 13 acide nucléiques La centrifugation zonale permet de séparer des gros complexes (ici AD-protéines), alors que l électrophorèse est plus adaptée pour séparer des macromolécules de taille plus petite. Synthèse : Il est possible de synthétiser chimiquement de petits oligonucléotides (jusqu'à 50 bases) d'une manière chimique. III) Dénaturation et hybridation 1) Dissociation ou dénaturation D (260nm) 800 bp bp bp bp - gradient de centrifugation zonale digestion ménagée fractions gel d électrophorèse digestion totale fractions Lorsque l'ad double brin est chauffé à une température dite de fusion, ou Tm (pour melting temperature) les deux brins se séparent suite à une rupture des liaisons hydrogènes qui les maintiennent appariées. La double hélice se défait, les deux brins se séparent, on dit que l'ad est dénaturé (= perte de la structure secondaire). Ce terme est employé pour toutes les macromolécules. Pour les protéines, lorsqu on détruit les liaisons faibles, il y a perte de la structure tridimensionnelle, la protéine est dénaturée. Ce Tm dépend de deux facteurs principaux : du nombre de liaisons hydrogènes et de la composition du milieu. Le nombre de liaisons hydrogène lui même dépend : - de la longueur du fragment : le Tm augmente donc avec la longueur. Le nombre de liaisons hydrogènes est important en dessous de liaisons. Au delà, la dénaturation devient principalement un phénomène coopératif, et le nombre n est plus important. D (260nm) bp

14 acide nucléiques 14 - de la composition en base : l'augmentation de la proportion en GC augmente le Tm. Il y a en effet 3 liaisons hydrogènes entre les bases G et C et 2 entre les bases A et T. Donc plus la proportion en GC est importante, plus la température de fusion sera élevée. - de la présence de misappariement : les misappariements abaissent le Tm, puisqu au niveau du misappariement, il n y a pas de liaison hydrogène. Plusieurs éléments du milieu défavorisent les liaisons hydrogènes et seront utilisés pour faire varier le Tm. - la force ionique. L augmentation de la concentration en cations monovalents tel que le acl augmente le Tm. - Certains composés tels que la formamide ou l'urée abaissent le Tm - le ph est aussi important. A ph alcalin, l AD est dénaturé. A température ambiante, on utilise souvent le ah pour dénaturer l'ad. A ph neutre la forme prédominante est la forme céto, l augmentation de ph produit un changement en forme énole. Ce qui élimine les liaisons hydrogènes entre deux bases adjacentes. forme cetone ph alcalin forme énole La dénaturation de l'ad s'accompagne de modification importantes des propriétés physico-chimiques: D la viscosité augmente - l'absorption à 260 nm augmente, il n y a plus d'interaction entre les bases. Cette méthode permet d estimer le Tm. - la densité augmente. simple brin n peut séparer l AD simple brin du double brin par plusieurs méthodes : - par chromatographie sur colonne d'hydroxyappatite: ce sont des cristaux de phosphate de calcium. En forte concentration saline seuls les acides nucléiques double brin se fixent (ils peuvent ensuite être élués par du phosphate). - par filtration sur nitrocellulose, en effet seul l'ad simple brin se fixe, l AD double brin passe à travers. - en utilisant la différence de densité, en gradient isopycnique. Tm double brin Température

15 15 acide nucléiques 2) Hybridation L hybridation correspond à l'association de deux brins complémentaires d'acide nucléique. Cette hybridation peut être entre deux brins d AD, deux brins d AR ou un brin d AR et un brin d AD. La dénaturation est réversible. Quand la température est abaissée progressivement, au point de fusion, au Tm, les molécules peuvent s'hybrider selon la règle de complémentarité des bases. La réassociation dépend du Tm comme la dénaturation, pour qu il y ait hybridation, il faut que la température soit inférieure au TM. Mais en plus l hybridation dépend de la concentration en AD et du temps. Ces deux paramètres sont importants pour la rencontre entre les deux brins. Ainsi si on veut garder l'ad sous forme dénaturée on laisse l'ad soit à une température élevée, soit on le refroidit brusquement, on évite ainsi les mouvements moléculaires et donc la probabilité de rencontre entre deux brins complémentaires.