Master Sciences de la Vie et de la Santé Module commun «Méthodes et Outils de la Biologie» LES CYTOMETRIES DE FLUORESCENCE

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1 Master Sciences de la Vie et de la Santé Module commun «Méthodes et Outils de la Biologie» LES CYTOMETRIES DE FLUORESCENCE Cytométrie en Flux Cytométrie en Image Dominique DUMAS 17 Janvier 2007 Salle ED33 UMR LEMTA, IFR 111. Dr Dumas

2 Master Sciences de la Vie et de la Santé. Module commun «Méthodes et Outils de la Biologie» Rappels de Fluorescence (lumière, filtre...) Microscopies 3D et Applications 1 - Déconvolution 2 - Confocale 3 - Multiphoton Méthodologies développées : F-techniques 6 Cartographie FLIM 7 - Interactions moléculaires FRET (I-λ-τ) 8 - Diffusion moléculaire FRAP et FCS Cytométrie en Flux et Applications

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4 What we can observe and measure which scale? Molecular interaction x1000 Imaging Human eye Electronic Microscopy (TEM, SEM) Photonic Microscopy atom nucleosome Phage T2 chromosome Egg (fish) Humanity Sequoia molecule DNA chloroplast cell Fly bird Whale

5 Niveau d investigation 30 fois 8100 fois Macula de la rétine Cellules du cristallin (1 cm ) Le niveau d investigation conditionne la méthode d analyse

6 Méthodes d Imagerie Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) Radiographie 4000 fois (Lyzosome) (fixation, inclusion, coupe, vide..) Microscopie électronique Résolution Intégrité cellulaire Observation sur des cellules vivantes

7 Nature de la lumière. electromagnetic wave c = m.s -1 Wavelength (energy /color) CORRECTED OPTIC CORRECTED OPTIC visible Spectrum

8 Light / Matter interactions Photon s applications Production Absorption of Photons : Sun, Lamps, Lasers Excitation : * continuous : stationary conditions * pulsed or modulated : temporal resolution Detection P.M., Camera,... ELECTRONIC EXCITED STATES GROUND STATE Photoluminescence Molecular Emission Fluorescence Phosphorescence Visualization Information record Analysis Photophysics Imaging Reactivity Photochemistry (Industrial) Photochemical Engineering Photocatalysis Photopolymerization (SPL) Products - Objects

9 Diagramme de Jablonski S2 S s Excitation Eex Eem 10-9 s Emission <10-12 s S0 Eex > Eem λex < λem

10 État triplet Quenching (Energy Transfert... ) Eex Triplet 10-6 s Photodestruction Phosphoresence

11 Deuxième conséquence: la fluorescence Diagramme de Jablonski S2 S s Excitation Eex Eem 10-9 s Émission <10-12 s S0 Eex > Eem λex < λem

12 La Fluorescence Light / Matter interactions Photon s applications E= hc/ λ 1P : λ (450 nm) 2P : 2 λ (900 nm) hv Excited S1 S 1 Emission Ex < Em (1P) Ex > Em (2P) UV Vis NIR IR Photon Absorption 1P / 2P (NLO) S 0 Fondamental S0 Spectral Frequency Time-resolved Lifetime Spatial 3D Orientation Anisotropy

13 Light / Matter interactions Photon s applications E = hc/λ Stokes shift E = /λ (kcal/mol) nm Absorption Fluorescence Phosphorescence E High energy Low energy Short wavelength Long wavelength λ UV Visible Silica Pyrex λ (nm)

14 Fluorescence Excitation Spectrum Intensity of emission as a function of exciting wavelength Chromophores are components of molecules which absorb light They are generally aromatic rings The wavelength of absorption is related to the size of the chromophores Smaller chromophores, higher energy (shorter wavelength) Stokes Shift the energy difference between the lowest energy peak of absorbance and the highest energy of emission Fluorescnece Intensity Fluorescein molecule Stokes Shift is 25 nm 495 nm 520 nm Wavelength

15 Fluorescence: scale,, résolution Resolutions / Tracers Environment Parameters Spectral Frequency λ f Temporal Time τ Orientation Order Spatial Space Fluorescent Tracers Intrinsic and/or Extrinsic OPTICAL SENSORS Scale use : Macroscopic Microscopic Molecular Viscosity Order Polarity Pressure Temperature ph Free Volume...

16 Deactivation of the singlet state S1 : sensitive to the environment Concentration of fluorescent probe Quenching Fluorescein Rhodamine B _ HO (Na) O O O Et _ + Cl N Et O O C OH.. Et N Et rotation Laser : He-Ne, 543 nm (green) λ ex = 544 nm ; λ f = 580 nm C X (X = -H, -N=C=S) OH (Na) Quenching by I - Low concentration pink color Large concentration Deep orange/red color Solvent (ph) Pyranin HO 3 S (Na) OH (Na) homogeneous pathway at the entrance Skin Effect Ethanol Water HO 3 S (Na) SO 3 H (Na)

17 Fluorescence : Use in Banknotes Control, in Credit Cards Control Not a quantitative measure!! Revelation only if light

18 Caractéristiques de la fluorescence λ f ; τ ; Φ f (I f ) λ f τ Φ f longueur d onde d émission (λ f max : au maximum) temps de vie de l état excité ; τ = 1/Σk i rendement quantique de fluorescence nombre de photons émis / nombre de photons absorbés Φ f = I f / I a ; valeur absolue ΣΦ i = 1 (excepté pour les réactions radicalaires) I f Intensité de fluorescence ; dépendant de l appareil Ι f = Φ f I a

19 Formation et désactivation de l état singulet Réactivité Photochimique k reaction [S 1 ] [A, B ] Formation Triplet Passage Intersystéme k isc [S 1 ] Transfert d Energie k et [S 1 ] Absorption I a Etats Singulets S 1 [S 1 ] = I a / Σk i τ = 1/Σk i Internal Conversions k ic [S 1 ] Fluorescence k f [S 1 ] Inhibition k q [S 1 ] [Q] Excimère (états excités dimère) ou Formation d Exciplexe k a [S 1 ] [M] Etat Fondamental S 0

20 Deactivation of the singlet state S1 : sensitive to the environment fluorescence lifetime log I 0 /I I int k = 1 / t with k = k r + k nr Dt (ns) intrinsic environment Area : Fluorescence Intensity Dependant Concentration Environment :, FRET Independant Concentration

21 Durée de vie des états excités Energie Etats Singulet et Triplet Signal I F = I t=0 e -t/τ S 1 Abs. Fluorescence, k f Phosphorescence, k ph T 1 Relaxation Exp [-t/τ] S 0 Temps τ nat = 1 / k F I F = I t=0 e - K f t τ nat : temps nécessaire à I F pour atteindre 1/e de sa valeur initiale I t=0 en absence de tout processus de désactivation autre que la fluorescence. I F : décroissance selon un processus monomoléculaire I t=0 intensité initiale à un temps zéro K F : constante de vitesse d émission de fluorescence

22 Chromophore used in biology? Organic Inorganic : Qdots Synthetic : Natural : natural Φf as close to 1 as possible ( Φf 1) * Planar molecule - Resonance - Conjugation (xanthenic dyes, aromatic hydrocarbons) * Restricted torsion * Non active for photochemisty (no photobleaching) Φisc as low as possible * To know the effects of the medium on the fluorescence (dependence/environment) Qdots (semi conductor)

23 Chromophore used in biology? - Autofluorescence - molécules naturelles (chlorophyle, collagène, tétracycline ) -Fluorochromie induite -réaction chimique - (noradrénaline, histamine après contact avec formaldéhyde...) UV Vert Rouge combinaison saine cancereuse PEAU (source, OLE 01/00) crème contenant de l acide δ aminolevulinique, précurseur de la protoporphyrine (PpIX), photosensibilisant tumeurs

24 Chromophore used in biology? - Fluorescence induite par réaction enzymatique - hydrolyse - substrat non fluorescent, produit fluo -Fluorochromie directe - coloration - IP, BrdU, Hoescht pour les Acides nucléiques... -Fluorochromie indirecte - combinaison immunomarquage, hybridation in situ cellule Marqueur cellulaire Ac primaire Ac secondaire fluorochrome Hoescht Ac (anticorps) primaire: souris ou lapin anti-vwf, ICAM-1 ou cavéoline-1 humains Ac secondaire: chèvre anti-igg de souris ou lapin conjugué à FITC ou Alexa Fluor-488

25 Detection : Specificity of marker / structure Endoplasmic Reticulum RER (DiOC6, ER-Tracker ) Golgia (NBDC6-Ceramids, Bodipy ) Mitochondria (Mitotracker, RH123, JC-1) Lysosomes (Lysotracker, Orange Acridine) Nucleus, DNA (Hoechst 33342, Orange Acridine) Immunology (peptide,proteine, oligonucleotide, )

26 Detection : Specificity of marker / structure Fluorescents markers : * F-actin : Toxin (phalloidin) - rhodamine (Ref : R416, Molecular Probes, Or, USA). * F-actin : Oregon green 514 phalloidin (O7465, Molecular probes, Or, USA). * CD49d (VLA4) : Monoclonal antibody IgG1 (mouse) - FITC. (Ref: 1404, Immunotech, France). * CD49e (VLA5) : Monoclonal antibody IgG2b (mouse) - FITC. (Ref: 1854; Immunotech, France). * FAK : Monoclonal Antibody Anti- FAK (IgG1). * MMP-9 : Anti-human MMP-9 antibody. IgG (mouse). (Ref: MAB936, R&D Systems, UK). * IL-1β : Human IL-1b - FITC. IgG1 (mouse). (Ref : IC201F, R&D Systems, UK). * IL-1β : Human IL-1b - PE. IgG1 (mouse). (Ref : IC201P, R&D Systems, UK). * Secondary Mab : Goat anti-mouse IgG1-heavy chain specific - FITC (Ref:, Bethyl Lab Inc, USA). * Caspase 3 : Cascapse-3 Fluorometric assay. (Ref : BF1100, R&D Systems, UK). * PS-Speck : Microscope Point Sources Kit 0.17 µm. (Ref : P7220, Molecular probes, Or, USA). * Permeabilization kit : Ref: CPK 100, Valbiotech, France. * rhil-1 RI : Anti-Human IL-1 RI Antibody.IgG (mouse). (Ref : MAB269, R&D Systems, UK). * rhil-1 β : Recombinant Human IL-1b (Ref : 201-LB, R&D Systems, UK). * LPS : Lipopolysaccharide from Escherichia Coli serotype O (Ref: L9023-5MG, Sigma, France). * Collagene Type I : Anti-Human collagen Type I (mouse). (Ref : M43665M, Interbiotech, France). Collagene Type I : Monoclonal (human-bovine-sheep) Anti-collagene Type I. Collagene Type II : Anti-Human collagen Type II (goat). (Ref: T33320G, Interbiotech, France). * IgG1 : Anti-mouse IgG1 (goat). (Ref : A90-105, Interbiotech, France).

27 Cases of GFP Variants! Yellowship,, corail Aequoria victoria FRET system with GFP variant Jelly Fish

28 Multiphoton Microscopy: specific excitation in IR light GFP 488 nm egfp YFP GFP Variants Synoviocyte in culture Monophoton Multiphoton 880 nm 900 nm 920 nm Actas de Bioquimica Vol D Dumas et al.

29 Major advances in photophysics in the last decade Multiphoton Microscope (IR illumination) Optic fiber (endoscopy) Modulator (AOM, EOM) (live specimen) (real time) CCD CMOS MICROSCOPE (cell scale) Spectrometer NLO (tissue) APD PMT (kinetics parameters) DATA PROCESSING (fitting model)

30 Principle of a spectrofluorimeter : Imaging? transmission reflection fluorescence EXCITATION Monochromator Excitation MICROSCOPE Sample Cell I f (a.u.) hν Selection of λ ex Fluorophore Emission Filter Dichroïque AOBS Objective λ (nm) Detector (CCD, PMT, APD...) Excitation Filter Lamp Laser Analysis at 90 Photonic / Electric with amplification Selection of λ f hν PM Detector EMISSION Monochromator Emission

31 Optique Interférence dans un microscope: La lumière diffractée à l objet atteint l objectif et génère, par interférence dans son plan focal, une distribution d intensité caractéristique d une structure particulière de cet objet. Plan focal de l objectif Lumière diffractée 1er ordre : sinα = λ / d Tache d Airy Exemple du cliché de diffraction d une bille Exemples de 5 fentes de réseau: de la lumière parallèle tombe sur le réseau et une partie se propage dans la même direction et est concentrée au foyer de l objectif. Sont également représentés les faiscaeux de 1er ordre diffractés sur le réseau qui sont mis au point sur le plan focal arrière de l objectif. La direction des faisceaux de 1er ordre diffractés par le réseau résulte du triangle A,B,C, qui est représenté agrandi.

32 Formation d une image à travers la lentille de l objectif La lumière diffracte à travers tout objet Cette diffraction, qui se caractérise par une déviation du trajet lumineux, est fonction de : - la longueur d onde (λ) - l épaisseur de la structure de l objet (d) diffractée directe diffractée

33 Diffraction

34 Résolution et disques d Airy Taille Profil d intensité (PSF) Ouverture numérique de l objectif Limite de résolution

35 Resolution en optique Objectif : - ON = n x sin U avec n l index de réfraction du milieu U le demi-angle d ouverture - Brillance : proportionnelle à (ON) 4 - Résolution : 1.22 x λ / 2.ON - Profondeur de champ : environ 0.2 µm (ON 1.4) Conditions idéales : Ouverture numérique - objectif ayant la plus grande ON possible - champ d illumination le plus petit possible - système optique limitant la contribution des objets situés en dehors de la mise au point dans l image définitive Pouvoir résolutif

36 Méthodes de fluorescence. Avantages : Faiblement invasif Sensibilité (10-12 mole -1 ) Spécificité de la détection Multi marquage Problèmes : Bruit de fond Fading (usure du fluorophore) Phototoxicité espèces réactives de l oxygène

37 Master Sciences de la Vie et de la Santé Module commun «Méthodes et Outils de la Biologie» CYTOMETRIE EN IMAGE MICROSCOPIES CONFOCALE, MULTIPHOTON Dominique DUMAS UMR LEMTA, IFR 111. Pr Stoltz Dr Dumas

38 IMAGERIE CELLULAIRE EN FLUORESCENCE Microscopies 3D optiques et déflouage I.Déconvolution II. Confocale III. Multiphoton Modes de résolution en Microscopies de Fluorescence Imagerie (I) Spectro-imagerie (λ) et FLIM (λ) Méthodologies développées Diffusion moléculaire FRAP Interactions moléculaires FRET (I-λ-τ)

39 Méthodes de déflouage Acquisition Microscopie à balayage Laser laser Post-acquisition Microscopie Conventionnelle lampe Continu Impulsion brève Monophoton Multiphoton Confocal Déconvolution

40 La microscopie à balayage Amélioration du contraste par réjection de la lumière «vagabonde» (stray light) caméra diaphragme de champ photodétecteur pinholes miroir dichroïque excitation miroir dichroïque excitation Imagerie «plein champ» objectif spécimen plan focal Imagerie «à balayage»

41 Types de microscopies Microscopes de fluorescence à champ large (Wide field fluorescence microscopes) Capteurs CCD à haute résolution et sensibilité, rapidité Microscopes confocaux à balayage laser (Confocal laser scanning microscopes) Détecteurs : photomultiplicateurs, 3D Microscopes à balayage laser et excitation bi- (multi-) photonique (Two- (or multi-) photon laser scanning microscopes) Avantages : excitation restreinte au volume focal, résolution temporelle

42 Microscopie Conventionnelle C à Epifluorescence optique

43 Contraste de phase et DIC Nomarski en microscopies Contraste de phase Dic

44 Microscopie Conventionelle à épifluorescence PROVIS AX70 (OLYMPUS) CCD Emission Filter Dichroïc Mirror PMT Excitation Filter Objective Piezo-electric system

45 Microscopie Conventionnelle C à Epifluorescence optique Miroir Dichroïque Filtre Excitation Lampe Filtre Emission Filtre Excitation Filtre Emission Objectif Objet

46 Microscopie à Epifluorescence limitations Microscopie optique : Une image contient des informations provenant des plans inférieurs et supérieurs au plan de focalisation. Il a été déterminé que seule 1% à 2% de l'information provient effectivement du plan de focalisation. Lentille frontale de l objectif Plan de focalisation (1-2%) Spécimen Plans adjacents Tache d Airy Flou généré par les plans adjacents supprimer l'information hors plan de focalisation déflouer

47 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring -z 0 +z +z 0 -z Series of optical sections PSF. Bead (0.17 µm). Step : 0.25 µm DEBLURRING - DECONVOLUTION OTF/PSF Position z Objective Functio n of co nvolution Out-off focus plane Lamp Emission Filter Dichroïc Mirror Excitation Filter Moving device in z axis : quartz piezo mounted on objective Functio n of deco nvolution f : real object n : noises h : Point Spread Function (PSF) : deconvolution symbol g = h f + n Mathematical reversion Focus plane Out-off focus plane

48 I. Restauration d Images : déconvolution Scanning Optical Microscopy scène originelle observations dégradées Fonction de convolution Plans adjacents + Plan Focal Fonction de déonvolution f : real object n : noises h : Point Spread Function (PSF) : deconvolution symbol g = h f + n Plans adjacents -

49 I) Restauration d image : déconvolution Description g = h f + n Y PSF h X Image Originale f Image visualisée g Convolution bruit g : Image «floue» observée en microscopie h : PSF f : Distribution vraie du marqueur fluorescent Z X

50 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring Fonction de Transfert Optique PSF et déflouage PSF PSF X100 / NA 1.30 X100 / NA 1.65 Chondrocyte Rat cultivé en alginate/éponge. 60x/1.25NA

51 I. Restauration d Images : déconvolution Description g = h f + n Y PSF h X Image Originale f Image visualisée g Convolution bruit g : Image «floue» observée en microscopie h : PSF f : Distribution vraie du marqueur fluorescent Z X

52 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Method of Carrington Methode of Carrington compromise robustness/exactitude * convergence * smoothing variation between original data and estimated data smoothing applied to data * itération Restored image : A deconvoluated image that has been processed, free of noise and haze. During restoration, algorithm uses an experiments masking files and raw specimen image.

53 I. Restauration d Images : déconvolution EPR TM System Deconvolution (iteration : 15)) Vert : GFP Rouge : Mitochondrie 10 µm UMR M Ouzine. UMR M Ouzine. GFP - MIA Bcl2 - MIA

54 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring EPR TM System Deconvolution Before After Caveolin Human Umbilical Vascular Endothelial Cell (HUVEC)Humain

55 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring Témoin 20 J/ cm 2 Contrôle rhil1 Static Dynamic Fib F3

56 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring 3D organization du cytosqueleton Chondrocyte cultived in monolayer (humin) Femoral Head (murin) Chondrocyte cultived in alginate bead 3D (human) Chondrocyte cultived in alginate sponge 3D (human) Arthritis cartilage (human)

57 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring Chondrocyte cultived in alginate bead 3D (human) Control Condition Of osteoarthritis rhil-25 UI ml -1 interleukine F-actin FAK

58 I. Conventional Optical Scanning Microscopy: Deblurring Control - rheine + rheine Monolayer (2D) +LPS +LPS Monolayer (2D) +IL-1β +IL-1β Alginate bead (3D) +IL-1β +IL-1β

59 I. Restauration d Images : déconvolution Gene Therapy : Transfection In Vivo GF Protein Chondrocytes Cell Transfection by electroporation on femroel head rat. C N Expression of cytoplasmic vector GFP in rat chondrocytaire electroporation in Vivo

60 I. Restauration d Images : déconvolution Control Control J7 J30 Expression of cytoplasmic vector GFP in rat chondrocytaire lectroporation (IGR) in Vivo

61 Rappels Résolution et Imagerie Résolution optique théorique (Nyquist) Résolution latérale: r = 0,4 λ /.N * λ = 488 nm et O.N = 1.4 r = 140 nm Distance de trame : 47 nm (3 points de trame soit 140 nm / 3). Image affichée expérimentale Format de l image (balayage) : 1024 x 1024 pour un champs de 150 µm Soit 146 nm soit un facteur 3. Format : taille du champs (zoom)

62 Méthodes de déflouage Acquisition Microscopie à balayage Laser laser Post-acquisition Microscopie Conventionnelle lampe Continu Impulsion brève Monophoton Multiphoton Confocal Déconvolution

63 II. Microscopie Confocale à balayage Laser Axe Z Microscopie champ large Microscopie confocale complémentarité

64 II. Microscopie Confocale à balayage Laser Laser 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-parinaric acid

65 II. Microscopie Confocale à balayage Laser laser galvanométre Optique de balayage pupille objectif focus

66 II. Microscopie Confocale à balayage Laser focal Plane Fluorescent Cell X Y y X Galvanometer Scanning X-Y X z Y laser

67 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Photomultiplier Dichroïc Mirror Pinhole Laser Source Objective Sample Scanning

68 II. Microscopie Confocale à balayage Laser specimen λ Moteur pas à pas Miroir vibrant Laser gaz Ar/Kr S 1 Diaphragme (pin-hole) PMT S 0 31

69 II. Confocal Laser Scanning Microscopy

70 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Phalloïdine- RhodamineActin Anticorps contre T.cruzi - FITC DNA - Dapi

71 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Coupe xz

72 II. Microscopie Confocale à balayage Laser Prisme FLIM AOBS Transmission : 98 % Lumière blanche Lumière décomposée MP Accordabilité :nm FLIM

73 II. Microscopie Confocale à balayage Laser x, y, z, λ, t 2 lignes Exc Radio frequences 1 et 2 Détecteur λ Laser(s)

74 II. Microscopie Confocale à balayage Laser et analyse spectrale I λ Accordabilité :nm

75 Spectral imaging in Microscopy : cross-talk and sequentiel mode * balayage simultaneous Ch1 Ch2 Merging sequencial Ch1 Ch2 Merging

76 Spectral imaging in Microscopy:deblurring (compensation) Record lambda stack of single labeled controls CFP CGFP GFP YFP

77 II. Microscopie Confocale à balayage Laser et analyse spectrale x, y, z, λ, t Autofluorescence /GFP Transfert Energie λ - Optimiser la fenêtre spectrale / signature du produit - Collection du signal (bruit, autofluorescence ) - Identification dynamique de l autofluorescence - Discrimination / multiples marquages - Caractérisation interactions moléculaires (liée-libre) - Distance inter-moléculaire in vivo (donneur-accepteur) - Techniques ratiométriques (rapport de l) (FISH, ph, ions, ) I λ

78 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Natalia De Isla D.Dumas Chondrocyte / Tête Fémorale Adhésion cellulaire (CD44)

79 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Helicobacter D.Dumas, F.Plenat.

80 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Biomatériaux sur Films PLGA Réseau Collagène Type 3 Fibroblaste (tendons) TGF 5 µg/ml TGF 0.1 µg/ml Témoin

81 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Cytotoxicity Oxidative Stress DiOc6 - Mitochondria

82 II. Confocal Laser Scanning Microscopy Connexine Noyau Cardiomyocyte N.Tran, D.Dumas, JF.Stoltz, JP Villemot

83 II. Confocal Laser Scanning Microscopy N.Tran, D.Dumas, JF.Stoltz, JP Villemot

84 III. Microscopie en régime Multiphoton Intérêt du régime Multiphoton en biologie appliqué à des échantillons denses et opaques * Régime Multiphoton * Confinement de l absorption 2P * Modulation de l excitation * Excitation 2P / équivalent UV-Vis * Rapport signal/bruit * Fenêtre spectrale (IR) / Profondeur d analyse * Marquage multiple * Photodégradation *

85 III. Multiphoton Microscopy : fluorescence SPE /TPE Maria Göppert-Mayer predicting the two-photon absorption process (1930) SPE (single photon exci.) TPE (two photon exci.) S1 S1 λa σ a2 σ a λe > λa T λe < λa S0 λa ωe < ωa S0 λa σ a1 ωe > ωa Linear Absorption Emission σ SPE = σ a = cm 2 Non linear Absorption Emission σ TPE = σ a1 σ a2 T = cm s

86 III. Microscopie en régime Multiphoton specimen specimen λ λ 10 ns Laser gaz Ar/Kr Laser solide Titane sapphire fs, 80 MHz fréquence de tir S 1 S 1 S 0 S 0

87 III. Microscopie en régime Multiphoton DENSITE TEMPORELLE : Source LASER IR pulsée temps 100fs #45xΤ 100fs 100fs 10ns 10ns 10ns 10ns 10W P P 100kW F= 100MHz P = 100kW Puissance moyenne 1W Mode continu t Mode pulsé t

88 III. Microscopie en régime Multiphoton DENSITE SPATIALE : Objectif à grande ouverture numérique dilution spatiale confinement temporel temps confinement spatial confinement temporel

89 III. Microscopie en régime Multiphoton : propriétés de l excitation ion 2P Sectionnement optique (microscopie 3D) Microscopie confocale Excitation bi-photonique Axe optique Tache de diffraction en microscopie conventionnelle Eliminer la lumière hors focale Créer de la lumière uniquement dans le plan focal

90 III. Microscopie en régime Multiphoton : propriétés de l excitation ion 2P PSF d une bille de 0.17µm de diamètre A_MICROSCOPIE CONVENTIONELLE Incrément en Z=0.25µm/Bin1x1/filtre neutre 50%/temps d intégration1.9s /Objectif 60x B_MICROSCOPIE CONFOCALE MODE MONOPHOTONIQUE Incrément en Z=0.25µm/Beam expander3/objectif 63x/ Zoom=8/ Moyennage par plan=3/pinhole=600µm/ PMTgain=457/vitesse de balayage=400hz C_MICROSCOPIE CONFOCALE MODE MULTIPHOTONIQUE Incrément en Z=0.25µm/Beam expander3/objectif 63x/ Zoom=8/ Moyennage par plan=3/pinhole=600µm/ PMTgain=899/ vitesse de balayage=400hz

91 III. Multiphoton Microscopy : 2P excitation confined to focal plane Photobleaching of rhodamine Monophoton Biphoton Alginate Bead /fluorescein 1P 2P 1P (488 nm) : double cone 2P (760 nm) : Limited to the area illuminated 1P 2P Log N Interest of Multiphoton Microscopy * Modulation of excitation power * Excitation 2P / UV-Vis * SNR improved (higher contrast) * Spectral window (IR) / analysis in depth * Numerous labellings (overlapping spectra) * Photodestruction reduced outside the focal plane * Z Probability / NLO effect

92 III. Multiphoton Microscopy : 2P excitation confined to focal plane SPEF FITC Solution Cone Fluorescence TPEF Fluorescent Spot in focal plan Excitation 488nm Excitation 976nm Objective x10

93 III. Multiphoton Microscopy : high repetition rate laser Exemple of femtosecond Ti:Sa oscilator Mira 900 (mode-locked laser) : Diode-Pumped Lasers Verdi 8W - high frequency 76 MHz - short laser pulse 120 fs - round trip time 13.2 ns spectrometer Oscilloscope femtoseconde Mira F-900 laser Microscope Electrooptic Modulator (EOM) galvanometer miror PMT NDD

94 III. Multiphoton Microscopy: electrooptic modulator in light chopper mode Power modulation : 100 MW to 10 µw! -ND - EOM/ AOM EOM Photodiode Fast (FLIM) Power Meter Shutter IR EO-Crystal : - 3x3 mm2-5w nm-1050 nm -Transmission : 95% - Extinction Ratio : 1/254 - Half-wave Voltage 264V Spectrometer LIV 20 EOM DRIVER (LINOS) laser attenuation EOM

95 Multiphoton Microscopy: excitation for Multiprobes DAPI 800 nm DiI FITC Coumarin

96 III. Multiphoton Microscopy: excitation for Multiprobes Nucleus (Hoescht) F-Actin (Phalloidin-Alexa Fluor TM 594 nm) ICAM-1 (Ac-Alexa Fluor TM 488 nm ) 3 lasers (UV, Arg488, HeN543) Illumination unique : réponses multiples 2P excitation 780 nm NLO Mode : 1 scan for 3 colors!

97 III. Multiphoton Microscopy: excitation for Multiprobes HUVEC cultures on Biomaterial Cell Adhesion (CD29) Nucleus Hoescht Multiphoton Laser Mira 900 Coherent Inc 780nm CD-29 IgG + anti-igg-alexa Fluor TM 488 nm Monophoton Laser Arg 488 nm PAH PDL F-Actine Phalloidine-Alexa Fluor TM 594 nm Monophoton Laser HeNe 543 nm PEI/PSS/PAH PEM-PAH PEM-PDL PEI/PSS/PAP/PLA/PDL C.Bourra

98 III. Multiphoton Microscopy : absorption in deeper tissue Specular Reflection (Descartes) λ 1 λ 1 λ 1 Spatial and temporal Distribution of Energy inside the tissue: laser (l), Power (P), Surface (S) Nb photons.s -1. area unit -1 Single Diffusion (Mie) λ 1 λ 1 Multiple Diffusion (Diffusion Mie) λ 1 λ 1 Spectral Window Absorption (Beer-Lambert) λ 1 λ 2 λ 3 law of Beer-Lambert (I=I O exp -µ a z) µ a : absorption coefficient (cm -1 ) δ a : penetration depth (1/µ a ) λ 5 λ 4 600nm 1200 nm

99 III. Multiphoton Microscopy : 2P excitation Deeper imaging in confocal : 20 µm Explants (skin, articular cartilage, vessel ) 3D Constructions for graft (cardiomyocyte, chondrocyte, ) Biomaterials and vectors (macroparticles ans nanoparticles, hydrogels ) Culture of fibroblast in monolayer Labelling : cytoskeleton, cytoplasm Fresh skin of rats (autofluorescence)

100 III. Multiphoton Microscopy : 2P excitation * high contrast * deeper layer 1P - 89 µm Femoral Head - rat Chondrocytes labelled 2P-193 µm Laser Argon 488 nm, Vert Oregon- Phalloidine Laser femtoseconde Maitai Cohérent. 780 nm, Hoescht

101 III. Multiphoton Microscopy : 2P excitation Depth of penetration 64 µm 219 µm 1,6 mm 15 µm 22 µm 30 µm Laser Argon. 488 nm, Vert Oregon- Phalloidine Laser femtoseconde MIRA 900 Coherent Inc. 780 nm, Hoescht Laser femtoseconde MIRA 900 Coherent Inc. 780 nm, Alexa-488 TM Rat femoral Head Bead

102 III. Multiphoton Microscopy: percutaneous absorption of PAH Depth : 300 µm Hairless rat skin (no hair) PAH: toxic polluant Benzo(a)pyrene DiO-BaP DiO-BaP DiO 820 nm 150 µm by Immunocyto chemistry Autofluorescence Rat Hairly (with hair) AO-BaP-DiO

103 III. Multiphoton Microscopy: cardiomyocytes ocytes (rabbit heart) depth : 500 µm Connexine Nucleus Cardiomyocyte

104 III. Multiphoton Microscopy: chondrocytes (cartilage) depth : 450 µm Femoral head (chondrocyte) Cellular Adhesion (CD44)

105 III. Microscopie en régime Multiphoton 1P 2P Avantages * Absorption confinée au volume focal - pas de déflouage - pas de photodégradation / plans adjacents Inconvénients * Résolutions xyz inférieures (x2) 1P/ 2P (λ, Εxc, fluorophore ) * Temps de mise en oeuvre (mn) * Photodégadation (x2,5) / plan focal * Effets thermiques IR (eau, [fluorophore] ) * Coût d acquisition et de maintenance - Barrette de diode (laser de pompe) - Classe IV * Stabilité puissance (lasers de pompe) * Recul nécessaire - effets cellulaires (DNA/3P) - caractéristiques spectrales * Diaphragmes confocaux ouverts - efficacité de collection maximale - quantification * Mode NDD (Non Descanné) * Proche IR - pénétration / tissus - cellules vivantes (UV) - échantillons épais et/ou opaques Modes de résolution de la fluorescence - faisceau polarisé - mode impulsionnel Résolution Temporelle Durée

106 New molecular tools in Multiphoton Microscopy (F-techniques) SHG: Second Harmonic Generation Spectrofluorimetry: Fluorescence Spectral microscopy (λ) FLIM : Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (τ) FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer FRAP : Fluorescence Recovery after Photobleaching FCS :Fluorescence Correlation Spectroscopy Conclusion : Multimodality

107 FRAP Fibroblaste Hydrophile Diffusion passive 5,6 CarboxyFluoresceine DiAcetate Très hydrophobe Fluorescent λexc :495 nm λem: 520 nm. JR.Stines, Thèse 2004 hydrolyse des groupements acétates

108 FRAP intercellulaire : fonctionnalité des connexines Cellules Kb Distribution Connexine / Fonctionnalité des Gap Cx43 Hoescht Oxonol JR Stines, M. Abacci, D.Dumas

109 FRAP intercellulaire : fonctionnalité des connexines Cellules Kb Distribution Connexine / Fonctionnalité des Gap Cx32 Hoescht Oxonol JR Stines, M. Abacci, D.Dumas

110 FRAP Caractérisation de la capacité de communication cellulaire (gap junction) Extinction de fluorescence %F Retour de fluorescence Temps Zero 10 seconds 30 seconds

111 FI FRAP recouvrement de fluorescence après photoblanchiment 30 FM intensité en u.a cellule cible cellule temoin La fraction mobile R en % qui est égale à : R = F Fo Fi Fo temps en secondes Le coefficient de diffusion D en cm 2 /sec qui est égal à : Avec F, intensité de fluorescence finale, F0, intensité de fluorescence après photoblanchiment, Fi, intensité de fluorescence avant photoblanchiment. D = 2 ω 4 T γ Avec ω, rayon du faisceau laser, γ, facteur de correction dépendant du degré de photolyse, T, temps de ½ recouvrement.

112 FRAP Avant photoblanchiment Fibroblast es KB FaDu Après photoblanchiment à t = 0 Après photoblanchiment à t = 15min

113 FRAP Fibroblaste 1 0,8 0,6 0,4 0, Tem ps (s) Diagnostic optique? FaDu 1 0,8 0,6 0,4 0, T emps (s) M. Abbaci, DEA

114 FRAP intercellulaire : fonctionnalité des connexines FI recouvrement de fluorescence après photoblanchiment 30 FM intensité en u.a cellule cible cellule temoin La fraction mobile R en % qui est égale à : R = F Fo Fi Fo temps en secondes Le coefficient de diffusion D en cm 2 /sec qui est égal à : Avec F, intensité de fluorescence finale, F0, intensité de fluorescence après photoblanchiment, Fi, intensité de fluorescence avant photoblanchiment. D = 2 ω 4 T γ Avec ω, rayon du faisceau laser, γ, facteur de correction dépendant du degré de photolyse, T, temps de ½ recouvrement.

115 Résolution temporelle et FLIM Sonde: λexc/λem τa (ns) τb (ns) BCECF 490/ (acid) 3.8 (base) Fluo-3 490/ (no Ca 2+ ) 0.79 (Ca 2+ ) Lucifer Yellow 3.3 Sodium Green 1.1 ( Na + ) 2.4 ( Na + ) Hoechst 2.2 (pas acc., 7-AAD) 1.4 (accepteur,7-aad) FITC 490/ (ph > 7) 3.0 (ph < 3) TRITC 543/ 2.0 Rhodamine 700 Rhodamine 700 Cy3 Cy5 659/ / / 1.6 (ph 9) 1.55 (H 2 O) (ph 6) 2.99 (Ethanol) 0.5 (anticorps conjug.) GFP free (S65T) 488/ CFP YFP

116 Microscopie en régime FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Image Intensité Image Lifetime histogramme distribution Lifetime courbe déclin Lifetime Paramètres Fit

117 FLIM : durée de vie des états excités TCSPC Oscillateur femtoseconde Laser de pompe Oscilloscope Analyseur de spectre Microscope Modulateur électro-optique Photodiode rapide Miroirs galvanométriques Carte d acquisition TCSPC PMT NDD Imagerie Imagerie de durée de de durée vie de fluorescence de vie de fluorescence Module SPC730 B&H

118 FLIM : durée de vie des états excités TCSPC Signal I F = I t=0 e -t/τ - approche quantitative / fluorescence stationnaire - discrimination / bruit de fond - imagerie de concentration (ions, protéines ) - segmentation (contraste ) / multimarquages - variations environnementales Relaxation Exp [-t/τ] Temps I F = I t=0 e - K f t I F : décroissance selon un processus monomoléculaire I t=0 intensité initiale à un temps zéro K F : constante de vitesse d émission de fluorescence Histogramme des retards des photons : uniques comptés. L histogramme de ces retards correspond au déclin de fluorescence

119 FLIM en TCSPC Comptage de Photons Uniques Corrélés dans le Temps ou TCSPC Basée sur la détection de photons de fluorescence unique Laser femtoseconde Microscope confocal Echantillon Emission de fluorescence PMT Photodiode Start Stop Amplificateur Déclin de fluorescence Analyseur Multicanal Convertisseur Temps Amplitude Déclin exponentiel ou multiexponentiel Détermination de la durée de vie de fluorescence (12 ns max)

120 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy : control beads lex: : 770 nm Confocal PMT1, PMT2, PMT3. Segmentation / tresholding sur τ Constellation Beads from Molecular probes lex: : 770 nm FLIM NDD t Distribution I t

121 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy : GFPvariant in the cells ls Variants GFP Synoviocytes en culture pcdna-gfp Psec-EGFP Psec-YFP GFP : 2,4 ns EGFP : 2,1 ns YFP : 3,6 ns

122 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy : spectral overlap / long and short lifetime A B 100 µm YFP Emission spectra of CHO CFP-YFP CFP Pyr YFP Emission spectra of CHO CFP-YFP + Pyren Photons Nb Pyrene (32,6 ns) YFP (2,7 ns) Tim e (ns )

123 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy : rat skin Detection of toxic (Pyrene Pyrene etbenzo(a) (a)pyrene) (repetition rate/τ 120ns)

124 FRET : mesure des interactions moléculaires * Mesure des interactions moléculaires par FRET «Proximité moléculaire» a) Intramoléculaire Orientation Interaction dipolaire ex kt(r) = f(1/r 6 ) Configuration «ouverte» distance em D r A em b) Intermoléculaire Configuration fermée Efficacité Protéine A Protéine B Complexe Protéine-protéine 0 70Å distance

125 F-TECHNIQUES.. TECHNIQUES..used in Biology FRET : fluorescence resonance energy transfer (Perrin 1932, Fôrster 1946) Homo-FRET : (Gaviola and Pringsheim 1924, Perrin 1932) F. And JB Perrin BRET : Bioluminescence resonnace energy transfer (Xu, Piston, Jonhson 1999) CRET : Chemiluminescence resonance energy transfer (Campbell) Luciferase / luciferin LRET : Luminescence resonance energy transfer (Szalay) DRET : Dexter resonance energy transfer (Dexter) QRET: Quencher resonance energy transfer T. Förster Fret and fluorescence : Cyanobacterium and chlorophyll!!

126 FRET en Micoscopie Confocale Förster Resonance Energy Transfer Techniques qualitatives Basées sur l intensité de fluorescence : Rapport d intensité donneur/accepteur pb-fret (FRET par Photoblanchiment) Techniques quantitatives Basées sur le temps de vie de fluorescence : Comptage de photons

127 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer Dipolar Interaction ex kt(r) = f(1/r 6 ) D r A em em Molecule 1 Molecule 2 Fluorescence DONOR ACCEPTOR Fluorescence Intensity Absorbance Absorbance λ

128 Intermolecular Energy transfer from singlet Distance Donor/Acceptor 10 Å Short distance Exchange mechanism Overlap of the more external electronic orbitals of D and A Limited by the collisions frequency (diffusion rate) Same multiplicity by pair D*/A* and D o /A o S1 D + S0 A S0 D + S1 A DEBYE formula k D = 4πNσD 25 to 100 Å Molecular level distance FÖRSTER resonance Overlap between the fluorescence spectrum of D* and the absorption of A o Energetic coupling (non radiative) No multiplicity change S1 D + S0 A S0 D + S1 A S1 D + T1 A S0 D + T2 A Probability 1/R Å Long distance Radiative way Overlap between the fluorescence spectrum of D* and the absorption of A o Lifetime of D* not modified by the presence of A o (a way to detect this ET) Fluorescence emission S1 D S0 D + hν f Followed by S0 A + hν f S1 A Base of the fluorescent relay

129 FRET : mesure des interactions moléculaires Rate of Transfert D Energie : k T (r) = 1/τ D (R o /r) 6 r : distance entre donneur et accepteur R o : distance de Förster (chevauchement spectral) τ D : Durée de vie de fluorescence du donneur

130 FRET : mesure des interactions moléculaires DONNEUR ACCEPTEUR FRET λ Donneur et Accepteur Extinction A et D [D] / [A]? Contamination spectrale 488 nm (DiO) 543 nm (DiI) λ FRET-τ τ DA en présence de l A τ indépendant [fluorophore] / environnement

131 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer and molecular proximity kinetics of oxidized-ldl 488 nm LDL DiO FRET DiI dio dii - Fixation (FRET +) - Internalisation (FRET +) 575 nm FRET - Vesiculation (FRET +) - Degradation (FRET -) Endocytosis of LDL Exc 488 nm Shear Stress : 9,6 dyn/cm 2 Durée : 3h50 Zoom : 1,22

132 Spectral- FRET: oxidized-ldl 488 nm LDL FRET DiO DiI 575 nm dio FRET dii kinetics of oxidized-ldl - Fixation (FRET +) - Internalisation (FRET +) M. Traore, D. Dumas. 10 mn 110 mn - Vesiculation (FRET +) - Degradation (FRET -)

133 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer 20 Evolution moyenne des intensités de fluorescence: plans 3 à MFI Imaris Surpass Win (reconstruction surfacique) 110 I moyenne Time (mn)

134 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer and molecular proximity Kinetics of degradation of LDL by FRET fixation internalization degradation Contrôle + TNF-a Time (min x 10-1) Temps (min x 10-1)

135 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer Detection of early apoptosis on U937 cell (human promonocytic leukemia cells) 7-keto-cholesterol (fluo) induces apoptosis (programmed dead) Donor : 7-keto-cholesterol, λex: 750 nm Acceptor : Nile Red, λex: 488 nm Nile Red yellow Red Polarity of SPL D.Dumas, E.Kahn, G.Lizard Yellow

136 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer D A Shift toward the red channel (polar lipide : 7-kéto-cholestérol/Nile Red) λex: 750 nm

137 FRET: Fluorescence Resonance Energy transfer and colocalization? λex: 488 nm λex: 750 nm Nile Red Yellow component Lipids 7-Keto-cholesterol/Nile Red Red component Polar Lipids (Sphingolipide) Effect and distribution of 7-Keto-cholesterol Vesiculation of polar lipids (SLP) Colocalization? Resolution of optical system?

138 FRET: GFP variants and colocalisation Co-localisation FRET FRET

139 FRET: GFP variants and colocalisation CFP YFP FRET Energy Transfert from donor (CFP) to acceptor (YFP) Spectral Unmixing process FRET visualized

140 FRET: GFP variants CFP (donneur) Excitation 458 nm Détection nm C2/CFP YFP(accepteur) FRET 514 nm 458 nm nm nm C2/YFP Problems : surexpression of GFP crosstalk CFP/YFP ratio

141 FLIM - FRET :agglutination des globules rouges GR GR GR GR GR GR GR-DiO + GR-Dii + Ab316 3µl Alexa-488 TM Alexa-488 TM B A C A B C FRET Alexa488 FRET A B PB: 550 nm τ D τ D=A DiI DiI C GR GPA mab IgG 7 nm GPA GR DiI à 488 nm (ε 8000 M-1 cm-1) Alexa-488 TM (ε M-1 cm-1), [Alexa488 TM ]= 20[DiI])

142 FLIM- FRET: hemoagglutination FRET-τ Distribution of Alexa488 lifetime UA ps agglutinant proximity E λ E τ FRET-τ 3D Anti-GPA % 8 % % 29 % Anti-GPB % 68 % % 83 %

143 FLIM- FRET: Voltage sensitive dye (membrane potential) Voltage Sensitive Dye Human skin fibroblast Acceptor emission Inverted polarity [KCl] + valinomycin Donor emission Oxonol excitation Acceptor (DHPE) Donor (oxonol) (Phospholipid-TRITC) (DiBAC 4 (3)) What about cancerous cells? - Carcinogenesis - Tumor progression

144 FLIM - FRET : potentiel membranaire λ em TRITC. surface membrane interne dépolarise V hyperpolarise Donneur Mobile (oxonol) DiBAC4(3) Accepteur PL-TRITC (DHPE-TRITC Fibroblaste Dépolarisarion (KCl + valinomycine) 1 Biofonctionnalité (biomatériaux) 0,8 0,6 0,4 0, ps 1 0,8 0,6 0,4 0, ps Clin. Microc. D Dumas et al. (sous presse)

145 En résumé : - Outil moléculaire robuste et informatif - Choix des couples partenaires FRET - Excitation donneur/accepteur - Mode spectral ou temporel - Imagerie de contraste FRET ou efficacité de transfert - Mises au point (modèle et expérimental) - peu expérimenté au niveau des tissus - assistance recommandée

146 Multiphoton Microscopy y for tissue imaging : Therapy Photodynamic Murine tumor (EMT6 cells) of female BALB/c mice. Sub-cutaneous injection of murine EMT6 cells on the hind legs Red fluorescent PS (Foscan; Biolitec) injected in dark condition Green Fluorescent beads (polystyrene) injected 5 mn before sacrifice Tumors removed for multiphotn imaging Size tumor: 4-5 mm (10 days).

147 Distribution of mthpc in Tumor and vessel Emision peak at 560 nm : beads Fluorescence Peak at 633 nm : mthpc derivative (5mg/kg, incubation 3h) Vessel Tissue Depth of penetration:150 µm Vascularization and vessel network Surface reconstruction (Imaris)

148 Intratumoral distribution of mthpc derivative (MP 800 nm) Green Channel: Beads (0.22 µm) Red Channel: mthpc (PDT) 30 mn after PS injection 1h 0-15 mn: from vessel to tumour (co-localisation) >20 mn: major location in tumor >1h: complete location in tissue 2h 4h 15h

149 FLIM : mthpc in cancerous cells (photosentitizer( photosentitizer) Monomere / Excimere 800 ps / 1700 ps Intensity Image Lifetime Image MCF-7 Incubation: 12h L.Bolotine, Dumas D, E.Werkmeister, L. Marchal.

150 FLIM : mthpc derivative in tumour Beads/ PS Tumor Intensity Image Lifetime Image 2000 ps / 4000 ps L.Bolotine, Dumas D, E.Werkmeister, L. Marchal.

151 SHG: Second Harmonic Generation in multiphoton mode (NLI) I SHG Fluo 2PE λd1 = 0,5 λi1 λd2 = 0,5 λi2 λd3 = 0,5 λi3 E(λ) > 0,5 λi1 E(λ) > 0,5 λi2 E(λ) > 0,5 λi3 λi3 λi2 λ λi1 Optical activity of chiral molecule : non-mirror symmetric forms (enantiomers) (Chirality : property of a object not to be superposable to its image in a mirror)

152 SHG of Human Artery 2P- Functional Imaging without stain Human umbilical artery (luminal side) E. Werkmeister, H. Kerdjoudj, D.Dumas

153 SHG of collagen and fibers Collagene I Fibers Egg Muscle (souris) E. Werkmeister, L. Bolotine, D.Dumas (poster)

154 SHG/2P imaging of vascularization network on skin surface SHG Vessel network mthpc derivative Merged

155 SHG/2P imaging of vascularization inside tumour SHG Vessel network mthpc derivative Merged

156 Kinetics Parameters measured in 2P excittaion - high energy (very fast bleach, ms) - no photobleaching outof focal plane * Diffusion of molecules * Directional Mouvement * Exchange / compartments

157 Transforming Growth Factor receptor : R1 / R2 macromolecular mobility How to measure kinetics parameters? Objective : Method for monitoring receptor dimerization at the membrane of live cells? To probe Conformational Dynamics in Signalling TGF-β Receptors via FCS Microscopy To precise distance between the extracellular domains of TFG-β dimers Structure of TGF-β1 TGF-β2 receptor immunolabeled

158 Transforming Growth Factor receptor : R1 / R2 macromolecular mobility FRAP recovery FRET Fret efficiency Distance (1/R 6 ) FCS Nb molecules / Vol Coeff Diffusion

159 FCS in Multiphoton mode: Fluorescence Correlation Spectroscopy Fluctuation of molecules diffusing in and out of the excitation volume detected and recorded as a function of intensity (counts) vs. Time. Decay of the autocorrelation of the fluorescence and diffusion constant of molecules. Cross-correlation to follow multiple species.

160 Data in Fluorescence Correlation Spectroscopy Excitation volume (pl) limited to confinment plane Data available : lateral and rotation diffusion reaction and binding kinetics conformational dynamics aggregation states stochiometry of complex molecules

161 FCS: Autocorrelation curves of ALEXA-488 labeled antibody F(ab) 2 I II-alexa488 I-II-Alexa488 0,20 0,18 O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o 0,16 O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o 30 nm N = nm N = 1.5 autocorrelation G(τ) 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o 0,02 0, nm N = 6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 τ [s] One-component diffusion model Diffusion rate of the free antibody is D = 21 µm 2 /s

162 Macromolecular Mobility of receptor : TGF-β RII in MSC autocorrelation G(τ) 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 Ab ALEXA 488 O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o MSC Receptor II O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o Ab ALEXA 488 free diffusion in a solution D = (21 ± 1)µm 2 /s MSC-Receptor II D = (6 ± 1) µm 2 /s 0,00 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 τ [s] N = 1.75 ± 0.25 λexc: 820 nm

163 MSC Stimulation with TGF-β and mobility of TGF-β RII receptor MSC stimulation with TGF-β FCS on MSC surface autocorrelation G(τ) 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o Stimulation O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o Non-Stimulation O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o O r i g i n D e m o Non-stimulation N = 0.7 ± 0.1 D = 7 ± 1 Stimulation [TGF-β] = 10 ng/ml N = 0.42 ± 0.05 D = 9.1 ± 0.3-0,05 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 τ [s] λexc: 820 nm

164 MP METAMICROSCOPE Fluorescence resolved: Wide- Field Real-Time Multiphoton Microscope Laser Ti:Sa I, λ,τ,, <r>, z,t No dye Natural dye Pulsed Diode LED Synchroton (Soleil) TIRF Raman / CARS FRET- Spectral FRET-FLIM SHG/ THG FCS Polarisation 4π Deblurring process Confocal Microscope High Frequency Multimodal Multidimensional Microscope (German-French Biophotonic project) FRET FRAP Imaging

165 CONCLUSION : at this time IMaging OSM-D MonoFocal 1P 2P MultiFocal 1P 2P 2PM Quantitative I (AU) τ (s) ? Deblurring Thickness Sample FRAP Living Cells +/ FCS +/ Spatial Resolution Multifocal: Numerous Lens, / Multipoint 2PM : Multiplexed Multiphoton Multifocal Microscopy

166

167 Cytométrie :

168 Master Sciences de la Vie et de la Santé Module commun «Méthodes et Outils de la Biologie» CYTOMETRIE EN FLUX Dominique DUMAS UMR LEMTA, IFR 111. Pr Stoltz Dr Dumas

169 Les Bases en Cytométrie en Flux La fluidique Flux Cellulaires fluidique Signaux Fluorescence Faisceau laser focalisé CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE : FOCALISATION Cellules en suspension dans du tampon aspirées par un conduite de grand diamètre grâce à une surpression dans la chambre passent dans une buse de faible diamètre Débit cellulaire constant, diamètre inférieur : vitesse augmente (10 3 /cellules s -1 ) Focalisation du flux de cellules : défilement une à une devant le faisceau Laser

170 Les Bases en Cytométrie en Flux configuration instrumentale PMT 5 PMT 4 Echantillon Filtres Dichroïques PMT 3 Flux cellule PMT 2 Diffusionr Bandpass Filtres PMT 1 Laser

171 Les Bases en Cytométrie Lumière de diffraction -Taille -Volume -Granulosité Laser Détection aux Petits angles (1<20 ) Lumière diffractée dans l axe Diffusion par la surface membranaire à la même λ que la lumière incidente. Signal de diffraction FSC (Forward Scatter): relié à la taille. Fenêtrage FCS/SSC Cellules mortes Microparticules (plaquettaires..) Microorganismes Détection aux grands angles 90 Lumière réfractée et réfléchie Diffusion de la lumière (organites) hétérogéité du contenu cellulaire SSC (Side Scatter) : granulosité

172 Les Bases en cytométrie de flux représentation de données Histogramme de distribution des fréquences (amplitude/nb événements par canal) Aspécificité BSA (Immuno) Contrôle positif Contrôle négatif Contrôle isotypique (Ig) Repésentation biparamétrique :Cytogramme (scattogramme) FL2-CD4 CD4 --> > FL1-CD3 % positivité couleurs CD3-CD4- black CD3+CD4- blue CD3-CD4+ cyan CD3+CD4+ green

173 Le muti-marquage marquage et cross-talk..et la compensation FITC F L 1 FITC détecteur FL2-%FL1 + - gain=1 FITC -PE F L 2 PE détecteur + gain=1 - PE -FITC

174 Le muti-marquage marquage et cross-talk..données et compensation Non compensé vs Compensé FL2 FL1 Aucunement Partiellement Totalement

175 Le traitement des données Rampe linéaire ou Log? -Positivité (%) - autofluorescence - Nb récepteurs - Ratio IMF (Ca2+, densité antigénique, ph) -Populations rares (CD34+ sang total..) -Kit de quantification CV (unités) Moyenne CV=3.0 %CV Définition = St.Dev x 100 MEAN

176 Le traitement des données Cytométrie quantitative et calibrant IMF / ABC: Préparation de l échantillon Hétérogénité des appareils et réactifs (consommable, titre ) Calibration des appareils et attitude consensuelle (protocole, % positivité ) Exploitation des résultats (mode Lin/Log, quadrants ) Seuil de positivité arbitraire : fixé à 10 1 en unités Log à 4 décades (1024) Autofluorescence + isotypique : 1ére décade Phénotypage immunoquantitatif : activité fonctionnelle (phénotype/fonction) Hétérogénéité d expression de molécules (hémoglobinurie paraxystique nocture..) IMF (amplitude du signal) : en Nb sites antigéniques / cellules - Fixation monovalente de l Ac - Saturation Équivalent au Nb de molécules d Ac fixé (densité antigénique) Calibrant (étalon) : billes de latex recouvertes de Qté croissantes d Ig Droite d étalonnage (IMF/ Nb molécules fixées ABC (antibody Binding capacity)

177 Le traitement des données Cytométrie quantitative et calibrant Antibody Binding Capacity Specific Binding 100,000 Non-specific Binding Detection Level 10,000 1, Cellules Calibrants J.Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories BMS 602 LECTURE 9.PPT Page 177