4.0 Techniques d électrophorèse capillaire

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1 4.0 Techniques d électrophorèse capillaire 1

2 Conversion d unités 1 Joule (J) 1 kg.m 2.s -2 1 centipoise (cp) 10-3 kg. m -1.s Pa.s 1 psi x10 3 Pa 1 Coulomb (C) 1 J.V -1 1 kg.m 2.s -2.V -1 2

3 Revue de l électrophorèse classique Électrophorèse : Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l influence d un champ électrique Technique complémentaire à la chromatographie liquide Modes de séparation Classique (papier ou acétate de cellulose, gel) Capillaire (solution libre ou zone, milieu micellaire, gel, focalisation isoélectrique, isotachophorèse, électrochromatographie) J.W. Jorgenson 1 est considéré comme le chercheur qui a mis en marche le domaine de l électrophorèse capillaire de zone en Le premier appareil commercial est apparu en J.W. Jorgenson and K.D. Lukacs, Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries, Anal. Chem. 53 (1981)

4 Revue de l électrophorèse classique Électrophorèse classique (papier ou cellulose) Protéines du sérum humain normal 4

5 Acrylamide : CH 2 CH-CO-NH Électrophorèse capillaire Revue de l électrophorèse classique Électrophorèse classique (gel 1D) Puits d échantillons Échantillon traité avec SDS Bis-acrylamide : CH 2 CH-CO-NH-CO-CHCH 2 Réservoire de tampon supérieur SDS : CH 3 - (CH 2 ) 10 - CH 2 - O - SO 3-, Na + Cathode Plaques de verre Gel coloré Bandes d analytes Anode Réservoir de tampon inférieur Gel de séparation: SDS, polyacrylamide entre deux plaques de verre 5

6 Revue de l électrophorèse classique Électrophorèse classique (gel 2D) 6

7 Revue de l électrophorèse classique + Électrophorèse classique (gel 2D) SDS-PAGE dénaturation séparation par masse - + gradiant de ph (ampholytes), séparation par pi 7

8 Electrophorèse capillaire : appareillage Anode (+) Haut Voltage (+/ 30 kv) capillaire détecteur Acquisition de données Cathode (-) Échantillon Caractéristiques typiques: Longueur totale (L t ): 20 à 60 cm Longueur au détecteur (L d ): cm ID: 25 à 75 µm; OD: 375 µm Réservoirs de Tampon (1 ml) Voltage appliqué (V): kv Volume injecté: 1-10 nl 8

9 Silice : Matériel le plus utilisé pour les capillaires - tubes résistants (polyimide) et de petit diamètre - haute constante diélectrique (isolant) - haute transmission UV - faible fluorescence 9

10 Avantages de l ÉC Un même capillaire (peu dispendieux) peut être utilisé pour séparer plusieurs types de solutés Haut rapport surface/volume (dissipation efficace de la chaleur) Technique simple (instrumentation) et rapide (haut voltage) Efficacité (N) élevée H A + B u + Cu Petit volume d échantillon ( 20 µl pour injecter 1-10nL) et peu de déchets (quelques ml) Automatisation facile 10

11 Modes de séparation en électrophorèse capillaire MODE Solution libre (FSCE, Free solution ou de zone, CZE) Milieu micellaire MEKC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) Gel CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Focalisation isoélectrique capillaire (CIEF) Isotachophorèse capillaire (CITP) Électrochromatographie capillaire (CEC) Séparation - Mobilité libre dans une solution électrolyte - Rapport charge/masse - Interactions polaires / non-polaires avec les micelles (mécanisme de partage) et FSCE pour les solutés chargés - Taille de molécule (tamis moléculaire) - Point isoélectrique (pi) - Différences de conductivité - Partage entre phase stationnaire et phase mobile + électro-osmose 11

12 12

13 Applications pratiques de ces modes Mode Petits ions Petites molécules Analyte peptides protéines ADN FSCE / CZE X X X X MECK X X X CGE X X CIEF X X CITP X X X X CEC X X X 13

14 Migration en ÉC Deux phénomènes Électro-osmose : écoulement (flux) du tampon induit électriquement dans le capillaire par la présence d une double couche électrique à l interface de la silice fondue et du tampon (solution électrolyte) Électrophorèse : déplacement d une espèce chargée, dans un milieu donné, sous l influence d un champ électrique, E. 14

15 Électro-osmose Paroi du capillaire : SiOH + H 2 O SiO - + H + Les silanols sont faiblement acides l ionisation commence à des ph 3 (pk a 6) Si O Si O Si O Si O Si O Si O - O - O O - OH L ajout d un électrolyte (tampon) mènera à la formation d une double couche électrique aux paroies internes du capillaire : Acide faible Sel de l acide faible HA + H 2 O A - + H 3 O + NaA + H 2 O AH + Na + + OH - 15

16 Électro-osmose 4.0 Électrophorèse capillaire Si O Si O Si OH O Si O - O Si O Si O - O - O - O - O Si OH O Si O - couche adsorbée la solution (H couche diffuse (H 2 O et 2 O et contre- ions): δ ++ en gros contre-ions): δ + vers le rayon du capillaire Potentiel (mv) ζ couche diffuse épaisseur de la double couche électrique Distance du paroi de capillaire (nm) 16

17 Électro-osmose 4.0 Électrophorèse capillaire + HV 17

18 Électro-osmose 4.0 Électrophorèse capillaire + Déplacement de la solution anode + HV cathode 18

19 Profil des pics en ÉC pressure driven parabolic flow A temps voltage driven electroosmotic flow A temps Le débit électro-osmotique issu de la couche diffuse est uniforme et possède un profil étroit. Par contraste, celui issu des systèmes à pompage (pression, HPLC) est parabolique Le débit électro-osmotique ne cause pas un élargissement significatif de la bande 19

20 où 4.0 Électrophorèse capillaire Vitesse électro-osmotique : v eo µ E eo ε ς E 4 πη v eo est la vitesse électro-osmotique ou flux électro-osmotique, EOF (cm/s) µ eo est la mobilité électro-osmotique (cm 2 V -1 s -1 ) E est le champ électrique (V/cm) ε est la constante diélectrique du milieu ζ est le potentiel Zeta (quelques mv) η est la viscosité du milieu (cp) Le flux électro-osmotique dépend du milieu (ph, force ionique, viscosité, solvants organiques, additifs, etc.) et est suffisamment fort pour entraîner tous les analytes vers le détecteur (cathode) 20

21 Électrophorèse Le mouvement d une particule dépend de la force électromotrice, F EM, et la force de friction, F FR, exercée par le milieu : anode + F FR F EM cathode E Champ électrique : E dv dx distance V anode V cathode entre cathode et anode 21

22 où 4.0 Électrophorèse capillaire F EM q i E et F FR i r i q est la charge électrique possédée par un ion i (C), E est le champ électrique (V/cm), f est le coefficient de friction (cp m), *pour un ion sphérique* η est la viscosité du milieu (cp), v i est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique r est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (forme sphérique) (m) f v où f 6π η à l équilibre («état stationnaire») : F EM F FR donc q i E f v i v i q i E f qi 6πηr i E 22

23 où 4.0 Électrophorèse capillaire v ep Vitesse électrophorétique µ ep E q 6πηr v ep est la vitesse électrophorétique (cm/s) µ ep est la mobilité électrophorétique (cm 2 V -1 s -1 ) E est le champ électrique (V/cm) q est la charge de l analyte η est la viscosité du milieu (cp) r est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (forme sphérique) (cm) La mobilité électrophorétique, µ ep, et donc la vitesse électrophorétique, v ep, dépendent de l analyte (charge et rayon) et du milieu (ph, composition du tampon, viscosité, etc.). E 23

24 Séparation en ÉC Le mouvement d un soluté chargé à travers le capillaire est la somme des deux phénomènes : électrophorèse + électro-osmose On définit la vitesse apparente (vitesse totale) d un soluté, v app, et la mobilité apparente, µ app, comme : v µ app app 4.0 Électrophorèse capillaire v µ ep ep + v + µ eo eo q ( où µ ep et µ eo 6π η r ε ς 4π η ) v app ( µ ep + µ eo )E mais: v app L t d m et E V L t donc t m L v d app Ld Lt ( µ + µ ep eo )V où t m : est le temps de migration (s) 24

25 Séparation en fonction de la charge? ordre d élution + - ANODE v eo CATHODE v ep v app Mais aussi: + + v q 6πη r i E

26 Séparation en fonction du rapport charge / masse q q vep µ ep si M r vep r M r r + si q vep si q r Anode (+) N N N N N N N N N N N Cathode ( ) 26

27 Exercice 1 Quelle est la mobilité électrophorétique des espèces suivantes? cationic (+) species (307s) EOF marker (neutral: 353s) anionic (-) species (396s) Signal migration time Séparation effectuée à 20 kv dans un capillaire de 60 cm (50 cm au détecteur) 27

28 Exercice 1 Solution - EOF (v eo ) : vitesse apparente (v app L D /t) d un composé neutre v eo L D /t m 50 cm/353 s cm/s - Mobilité électro-osmotique (µ eo ) : déterminée à partir de l EOF (v eo ) et du champ électrique (E). E V/L T V/60 cm 333 V.cm-1 µ eo v eo /E cm.s -1 / 333 V.cm cm 2.V -1.s -1 - Vitesse électrophorétique (v ep ) d un soluté anionique : déterminée par son temps de migration (t m ) et la mobilité électro-osmotique v app L d /t m 50 cm/396 s cm.s -1 CHM Migneault 2971 H2006 CHM2971-C9 et 10 H

29 Exercice 1 Solution Mobilité électrophorétique d un soluté anionique : déterminée à partir de sa vitesse électrophorétique (v ep ) et du champ électrique (E). v app v ep + v eo donc v ep v app - v eo cm.s cm.s cm.s -1 µ ep v ep /E cm.s -1 /333 V.cm cm 2.V -1.s -1 où le signe négatif implique une mobilité électrophorétique dirigée dans le sens contraire du flux électroosmotique 29

30 Exercice 1 Solution Vitesse électrophorétique (v ep ) d un soluté cationique : déterminée par son temps de migration (t m ) et la mobilité électro-osmotique v app L d /t m 50 cm/307 s cm.s -1 Mobilité électrophorétique d un soluté anionique : déterminée à partir de sa vitesse électrophorétique (v ep ) et du champ électrique (E). v app v ep + v eo donc v ep v app - v eo cm.s cm.s cm.s -1 µ ep v ep /E cm.s -1 /333 V.cm cm 2.V -1.s -1 où le signe positif implique une mobilité électrophorétique dirigée dans le sens même du flux électroosmotique 30

31 Injection en ÉC Hydrodynamique Pression Vide 4.0 Électrophorèse capillaire Volumes d injection Vol inj P t inj π d 128η L Vol inj : volume injecté (nl) P: différence de pression (mbar) d : diamètre interne du capillaire (cm) t inj : temps d injection (s) η : viscosité (sans unités, p/r eau) L T : longueur totale du capillaire (cm) T 4 Effet d aspiration (différence de hauteur) P ρg h Vol inj P t inj π d 128η L T 4 ρ : densité (g/cm 3 ) g : constante gravitationnelle (980 g.cm -2 ) h : différence de hauteur (cm) 31

32 Injection en ÉC Électrocinétique Vol inj ( µ ep + µ eo ) π r L D 2 V inj t inj µ : mobilité (cm 2.V -1.s -1 ) r : rayon du capillaire (cm) t inj : temps d injection (s) L D : longueur au détecteur (cm) V inj : Voltage d injection (V) 32

33 Choix du tampon 33

34 Tampons 34

35 Effet du ph sur le flux électro-osmotique (v eo ) du tampon µ eo (x 10-4 ) (cm 2 V -1 s -1 ) Si Si Si Si / / / / O - O - O - O - Si Si Si Si / / / / O - HO O - HO Si Si Si Si / / / / HO HO HO HO ph 35

36 Effet du ph sur la mobilité électrophorétique d un analyte Ex. 1 : Acide benzoïque C 6 H 5 -COOH C 6 H 5 -COO - + H + pk a 4.20 α α Ph-COOH α Ph-COO ph Mobilité effective d un ion: 0 µ α µ i α i : degré de dissociation de chaque groupe qui peut être dissocié µ 0 i : est la mobilité absolue de chaque ion. i i 36

37 Effet du ph sur la mobilité électrophorétique d un analyte Ex. 2 : Acide aminé 37

38 Effet du ph sur la mobilité électrophorétique d un analyte 38

39 4.0 Électrophorèse capillaire Propriétés des acides aminées Nom Alanine Arginine Acide aspartique Asparagine Cystéine Acide glutamique Glutamine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Méthionine Phénylalalin e Proline Sérine Thréonine Tryptophan Tyrosine Valine Symbol A, Ala R, Arg D, Asp N, Asn C, Cys E, Glu Q, Gln G, Gly H, His I, Ile L, Leu K, Lys M, Met F, Phe P, Pro S, ser T, Thr W, Trp Y, Tyr V, Val Volume Surface A.A. Zamyatin, Protein Volume in Solution, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24(1972) pka C' pka N' pka R pi à 25 C

40 Exercice Donnez la structure des 3 a.a. analysés et leur forme au ph de travail Assignez les pics sur l électrophérogramme Déterminer le EOF Déterminer la mobilité des trois a.a. Absorbance 98 s 153 s 247 s ph 6,1 Temps L t 31,4 cm L d 20,9 cm d i 75 µm d o 360 µm V 20 kv 40

41 Exercice 2 Solution En consultant la table des propriétés physiques des acides aminées (a.a.), on en retire les valeurs qui suivent. Ainsi, à l aide des pk a et des points isoélectriques (pi), il est possible de déterminer l état de l ionisation des groupements acides et basiques sur chaque a.a. pk a -(C ) 2,35 pk a -(N ) 9,78 pi 6,06 pk a -(C ) 2,18 pk a -(N ) 8,98 pk a -(R) 10,53 pi 9,47 pk a -(C ) 2,10 pk a -(N ) 9,82 pk a -(R) 3,86 pi 2,98 ph de travail 6,1 ph pi a.a. neutre ph < pi a.a. chargé (+) ph > pi a.a. chargé (-) 41

42 Exercice 2 Solution L ordre de sortie en mode normale (de l anode (+) vers la cathode (-) ) est: les analytes chargés positivement en premiers, les neutres en second et les analytes chargés négativement en derniers EOF 98 s 153 s 247 s Le flux electro-osmotique (EOF) est donné par le pic de la glycine puisque l acide aminé est neutre Le calcul de la mobilité est effectué tel que dans l exercice 1: µ Lys 1,20 X 10-4 cm 2.V -1.s -1 µ Gly µ EOF 2,14 X 10-4 cm 2.V -1.s -1 µ Asp - 8,16 X 10-4 cm 2.V -1.s -1 42

43 Formules intéressantes: Dérivons une formule qui permet le calcul de la mobilité électrophorétique (µ ep ) en une seule étape v v µ µ eo ep ep ep L t v eof d app v ep E Ld L V v t et eo et 1 tm v L t app d m E 1 t eof V L L t L t eof t d d m L d 1 tm 1 t eof Ainsi, il est possible de calculer directement µ ep en une seule étape! Aussi, la mobilité électro-osmotique (µ eo ) en une seule étape! µ eo L d Lt 1 V t eof 43

44 Tampons et effet de la force ionique µ eo ε ς 4π η * Contrôler le réchauffement joule 44

45 Tampons et effet de la force ionique µα 45

46 Tampons et additifs 46

47 Tampons et additifs: cyclodextrine AGENT CHIRAL 47

48 Tampons et additifs: cyclodextrine 48

49 Tampons et additifs: complexation 49