Un modèle de régulation - la répression catabolique et l opéron lac chez Escherichia coli

Transcription

1 BMC Un modèle de régulation - la répression catabolique et l opéron lac chez Escherichia coli cours de Guennadi SEZONOV

2 Les diapos du cours en couleur peuvent être téléchargées sur :

3 les enseignants de BMC421/2009 Céline Fabret Pierre-Louis Blaiseau Claude Gerbaud Guennadi Sezonov

4 Céline Fabret

5 Pierre-Louis Blaiseau

6 Claude Gerbaud

7 Guennadi Sezonov

8 La lecture conseillée

9 Introduction de l adaptation enzymatique au principe de régulation de l expression des gènes chez les bactéries

10 J Monod à l Institut Pasteur Participe avec A. Lwoff à deux congrès de Cold Spring Harbor qui vont marquer l'orientation de sa carrière. en 1946, où il prend connaissance des travaux de Beadle et Tatum sur la reproduction de Neurospora et de leur hypothèse d'une relation entre gènes et enzymes et, en 1947, le 11th Growth Symposium où il donne une conférence intitulée : The phenomenon of enzymatic adaptation

11 Le phénomène d adaptation enzymatique les bactéries sont intelligentes!! Certaines enzyme apparaissent dans les cellules seulement en présence de leurs substrats. Ce phénomène a été baptisé par J. Monod «adaptation enzymatique» enzyme inductible minimum 5-10 molécules par cellule sans induction «la fuite» maximum jusqu à molécules par cellule

12 Le phénomène de la diauxie E. coli choisit son sucre croissance bi-phasique dans le milieu contenant le glucose et le lactose

13 Diauxie

14 1959 le modèle de l opéron lactose de F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff 1 postule l existence des gènes régulateurs et des gènes de structure; 2 constate que les gènes peuvent former des unités de régulation et de transcription - OPERONS 3 explique la nature (protéine) et le principe de l action du répresseur LacI notion de l OPERATEUR; du PROMOTEUR et de l INDUCTEUR

15 F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff Prix Nobel opéron - opérateur - promoteur - répresseur - inducteur

16 Partie 1 l opéron lac revisité

17 Opéron définition du terme et principaux éléments structuraux Opéron une unité de régulation et de transcription composée de plusieurs gènes placés sous contrôle du même promoteur promoteur A B C D terminateur operateur Les éléments structuraux d un opéron incluent : - un promoteur et un terminateur de transcription - les gènes structuraux - une région régulatrice appelée opérateur

18 Opéron lactose la position carte génétique 7,8 min

19 Opéron lactose la position, les gènes carte génétique 7,8 min gènes PlacI laci séquences régulatrices lacz lacy laca 1083 pb 3075 pb 1254 pb 612 pb

20 Opéron lactose la position, les gènes, les ARNm carte génétique 7,8 min gènes PlacI laci séquences régulatrices lacz lacy laca 1083 pb 3075 pb 1254 pb 612 pb ARNm ARNm laci ARNm polycistronique laczya- sa demi-vie est de 3 min

21 Opéron lactose la position, les gènes, les ARNm et les protéines carte génétique 7,8 min gènes PlacI laci séquences régulatrices lacz lacy laca 1083 pb 3075 pb 1254 pb 612 pb ARNm ARNm laci ARNm polycistronique laczya- sa demi-vie est de 3 min protéines répresseur LacI b- galactosidase demi-vie 5 heures b-galactoside perméase b-galactoside transacétylase

22 La régulation de la transcription de l opéron lac vision simplifiée Deux états de l opéron lactose sont régulés par le répresseur LacI Fermé Ouvert - en l absence de lactose - en présence du lactose

23 L état «fermé» est assuré par LacI en l absence de lactose ARN polymérase inhibition par LacI de l initiation de la transcription par l ARN polymerase REPRESSION le tétramère LacI, la forme active du répresseur

24 En présence du lactose le répresseur est inactivé par un inducteur - allolactose l opéron est induit inducteur changement de conformation de LacI

25 Le cycle d induction et de répression de l opéron lac lac est faiblement exprimé même sans lactose - la «fuite» de l opéron lactose devient disponible entrée du lactose et induction de l opéron opéron lac fortement réprimé opéron lac pleinement induit il n y a plus de lactose le répresseur «ferme» l opéron lac

26 le défaut du modèle lac simple le modèle n explique absolument pas la croissance diauxique

27 Partie 2 les propriétés des protéines codées par l opéron lac et le gène laci LacZ LacY - LacA - LacI - b -galactosidase b-galactoside perméase thiogalactosidetransacétylase répresseur transcriptionnel

28 b-galactosidase LacZ -réactions enzymatiques -substrats -phénomène de l a-complémentation

29 Les réactions enzymatiquesde la b galactosidase C4 C6 isomérisation du lactose clivage en Gal et Glu

30 La structure de la b-galactosidase: un tétramère portant un ion de Mg2+ Mg2+ monomère tétramère

31 Résumé: b galactosidase les substrats et les inducteurs b-galactosides Substrat Inducteur lactose, allolactose Xgal (chromogène) + + métabolisable + - IPTG - + ONPG (chromogène) non métabolisable + - glucose, maltose - -

32 Les inducteurs de l opéron lac Inducteur métabolisable allolactose Inducteur non- métabolisable ou «gratuit» - IPTG

33 ONPG - dosage enzymatique de la b-galactosidase dans un milieu liquide ONPG nitrophényle-galactoside non coloré galactose +ONP (jaune) lac-

34 Les phénotypes Lac+ et Lac- sur différents milieux de croissance -LB + Xgal - MacConkey - M63 lactose

35 Visualisation de l activité enzymatique de la b-galactosidase dans un milieu solide contenant X-Gal Lac- Lac+ Lac+ blanches bleues bleues peu de colonies beaucoup de colonies X-Gal bromo- 5- chloro-4-indolyl- b D - galactoside

36 Réactions chimiques avec le X-Gal produisant la coloration bleue nécessite l oxygène indigo

37 Le milieu MacConkey: la fermentation qui donne la coloration [MK avec les oligopeptides] +lactose Souche lac+ Souche lac+ un colorant sensible au ph Souches lac-

38 Le milieu M63 (milieu minimum)+ lactose une souche Lacdans ce milieu, le lactose est la seule source de carbone une souche Lac+

39 L opéron lac et les mutants laczsauvage lac mutation non polaire (ex. ponctuelle) mutation polaire (insertion d un Tn) effet polaire - - -

40 La complémentation a N 1025 aa C LacZ+ Lac+ 985 aa aan-terminale Lacfragment w 40 aa 40 aa (fragment a) Lac- 985 aa + 40 aa???

41 La complémentation a N 1025 aa C LacZ+ Lac+ 985 aa aan-terminale Lacfragment w 40 aa 40 aa (fragment a) Lac- chromosome avec le fragment w plasmide avec le fragment a Dans un diploïde a w Lac+

42 Complémentation a - interaction non covalente entre les deux fragments fragment a fragment w

43 La complémentation a - les vecteurs de clonage

44 Le gène lacz comme un gène rapporteur chez les eucaryotes Exemple 1: embryogenèse chez la souris Exemple 2: embryogenèse chez la Drosophile

45 LacY - b-galactoside perméase - la protéine qui transporte le lactose

46 LacY une protéine intégralement transmembranaire 12 hélices transmembranaires de LacY

47 La fonction de la protéine LacY une perméase des b galactosides - transporteur du lactose -LacY sauvage transporte également le mélibiose (glucose a D-galactoside) -LacY* - une forme mutée de LacY est capable de transporter le maltose

48 Le mécanisme de Lactose/H+ symport

49 Perméase LacY les substrats (résumé) b-galactosides transportés obligatoirement par LacY rentrent par d autres voies indépendamment de LacY lactose + - Xgal - + IPTG - + glucose - - mélibiose + 37 C et 43 C + à 37 C - à 43 C

50 Répresseur transcriptionnel LacI

51 Le répresseur LacI agit comme tétramère -domaine de fixation à l ADN -domaine de fixation de l inducteur domaine d oligomérisation

52 LacI le site de liaison à l ADN reconnu dans l operateur lac une séquence répétée inversée comme pour beaucoup de protéines régulatrices se fixant à l ADN

53 3 séquences opératrices de l opéron lac PlacI laci promoteur lacz lacy laca O3-82 O1 +11 O O3 O1 formation d une boucle d ADN

54 La répression par LacI nécessite la présence de trois opérateurs TD1

55 LacI un obstacle stérique pour l ARN pol ~40 molécules de LacI par cellule = 10 tétramères

56 Le répresseur LacI l action de l inducteur

57 Un peu de génétique les mutations laci -, laci S et laco C

58 transcription Mutation lacien l absence de LacI fonctionnelle, l opéron lac est exprimé de façon constitutive c est une mutation recessive

59 Mutation laci S LacI S ne peut pas se lier à l inducteur l opéron lac est réprimé de façon constitutive c est une mutation dominante negative

60 Mutation O C LacI ne se fixe plus sur son operateur l opéron lac est exprimé de façon constitutive c est une mutation dominante

61 Conclusion: le phénotype «Lac constitutif» peut être observé à la suite des mutations qui touchent des site distincts - soit le gène laci - soit l operateur o Réfléchir sur la distinction entre les deux cas

62 Régulation de l expression du gène laci Comment les ribosomes terminent la traduction de l ARNm laci tronqué?

63 Les principales étapes de la traduction releasing factors

64 P A l action de SsrA un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les marn sans codon STOP

65 P A l action de SsrA un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les marn sans codon STOP La structure de l ARN SsrA

66 P A l action de SsrA un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les marn sans codon STOP Le rôle de la protéine SmpB La structure de l ARN SsrA

67 P A SsrA un ARN trans-messager qui sauve la traduction d un ARNm sans codon STOP

68 Régulation de l expression du gène laci SsrAtmARN SsrA tag AANDENYALAA 11 aa peptide TD3

69 Partie 3 l opéron lac et la répression catabolique pourquoi en présence de lacose+glucose l opéron lac ne s exprimera pas??

70 Cette régulation s explique parfaitement bien par l action de LacI enzyme inductible minimum 5-10 molécules par cellule sans induction «la fuite» maximum jusqu à molécules par cellule

71 ??????????????????????????????????

72 Quelle que soit la proportion entre les deux sucres les bactéries ne se trompent pas le phénomène de diauxie

73 La synthèse de la b-galactosidase ne commence que en phase lag apres la consommation du glucose DO unités de b-gal b-gal glucose lactose

74 La répression catabolique (la préférence pour le glucose) un phénomène général

75 Symbiosis Central metabolism Virulence Motility Nitrogen utilization Chemotaxis Repression Catabolite (glucose) flux de phosphates 5%-10% of all bacterial genes!!!! Lactose catabolic operons Maltose Arabinose Rhamnose

76 le transport des glucides est couplé à leur phosphorylation histidine protèine spécifique non spécifique enzyme I

77 La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose -la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure -si le glucose est présent - la forme phosphorylée de EIIA-Glu s accumule si le glucose est absent

78 La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose lactose X -la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est présent et transporté -Cette forme bloque l activité du transporteur LacY. -Le lactose ne rentre pas c est «l exclusion de l inducteur» -l opéron lac reste réprimé par le répresseur LacI

79 La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose X lactose -la forme phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est absent -lactose est transporté par LacY -la répression par LacI est levée mais l opéron lac s exprime seulement si une autre protéine, CRP, est présente et activée

80 La protéine EIIAGlu est le senseur principal de la présence du glucose X lactose catabolite répresseur protéine adenylate cyclase opéron lactose d autres gènes régulés par la répression catabolique

81 Les deux conformations de CRP activateur transcriptionneml incapable de se lier à l ADN sans son effecteur AMPc se fixe à l ADN en présence de l AMPc

82 L adénylatcyclase catalyse la synthèse de l AMP cyclique (AMPc) à partir de l ATP l adénylatecyclase est codée par le gène cyaa

83 avec AMPc sans AMPc

84 en présence de glucose l adenylate cyclase n est pas activée lactose X catabolite répresseur protéine X X adenylate cyclase

85 en l absence de glucose l adenylate cyclase est activée et la forme active CRP est presente X lactose catabolite répresseur protéine CRP adenylate cyclase opéron lactose???? quel cible?

86 La double régulation de l opéron lac activation par CRP et répression par LacI promoteur lac AMPc site de fixation de CRP operateur lac libre transcription par RNApol CRP activée répresseur LacI inactif en présence du lactose et en l absence de glucose CAP+AMPc active la transcription de l opéron lac

87 La position du site de fixation de CAP dans le promoteur de l opéron lac

88 Quel est le rôle de CRP dans la régulation de l opéron lac? 1 - c est un activateur transcriptionnel 2 son rôle n est pas accessoire, sans CRP l opéron lac n est pas transcrit

89 Le mécanisme d action de CAP opérons lactose, arabinose -50 opéron galactose ARNPol.alfa sans CAP le complexe ouvert ADN/ARNpol n est pas stable promoteur canonique TTGACA TATAAT T 69 T 79 G 61 A 56 C 54 A T 77 A 76 T 60 A 61 A 56 T 82 promoteur lac TTTACA TATGTT promoteur lacuv5 indépendant de CAP TATAAT

90 4 états de l opéron lac - état 1

91 4 états de l opéron lac - état 2

92 4 états de l opéron lac - état 3

93 Double verrouillage en l absence de lactose et en l absence de glucose CAP CAP favorise la formation d une boucle de 93pb LacI tétramère

94 4 états de l opéron lac - état 4

95 Comment le glucose active la répression catabolique? Modèle 1 inhibition de l activité de l AMP cyclique par EIIA-Glu variation de la concentration de l AMPc Modèle 2 inhibition de l activité de la lactose perméase (exclusion de l inducteur) par le système PTS X

96 TD4

97 TD5 EIIBC sans action de CRP sur le gène ptsg il n a pas de répression catabolique

98 TD6 Inhibition de l entrée du lactose par le lactose lui-même Troisième clef de la régulation???

99 Comment EIIA-Glu agit sur l adénylate cyclase TD7

100 Partie 4 X opéron lactose

101 Combien de gènes lacz chez E. coli? étaler laczlacy+ laca+ sur milieu minimum+lactose soit soit il existe une autre activité b-gal pas d activité b-gal autre que codée par lacz

102 ebga «evolved» beta galactosidase

103 La fuite transcriptionnelle de l opéron lac ou le paradoxe d une régulation parfaite l opéron lac est faiblement exprimé même en l absence de l inducteur LA FUITE Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?

104 La fuite transcriptionnelle de l opéron lac ou le paradoxe d une régulation parfaite opéron lacest faiblement exprimé même en l absence de l inducteur Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique? avec la fuite -après une longue absence le lactose est ajouté dans le milieu - les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZ pour transporter le lactose et produire l inducteur - allolactose - l induction du système est donc possible; l opéron lac s exprime; le lactose est massivement transporté et consommé sans fuite

105 La fuite transcriptionnelle de l opéron lac ou le paradoxe d une régulation parfaite lac est faiblement exprimé même en l absence de l inducteur Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique? avec la fuite -après une longue absence, le lactose est ajouté dans le milieu - les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZ pour transporter le lactose et produire l inducteur - allolactose - l induction du système est donc possible; l opéron lac s exprime; le lactose est massivement transporté et consommé sans fuite -après une longue absence le lactose est ajouté dans le milieu -aucune molécule LacY n est présente dans la bactérie; -le lactose ne rentre pas -l opéron lac n est pas induit -pire encore, l opéron lac ne peut jamais être induit - E. coli meurt de faim en baignant dans le lactose

106 Et le gène laca? Acetyl-CoA Thiogalactosidetransacetylase est capable d acétyler des b-galactosides non métabolisables pour les détoxifier et de les éliminer des cellules. Ses substrats naturels sont inconnus. Acetyl-CoA + isopropylb-d-thiogalactoside CoA + acetylatedisopropylb-d-thiogalactoside

107 L opéron lactose est-t-il là pour assurer la dégradation du lactose? - peu de lactose dans le tract digestif des adultes - le lactose n est pas l inducteur direct de l opéron lac - beaucoup de b-galactosides sont libérés pendant la digestion des plantes Les membranes des chloroplastes contiennent beaucoup de b-galactosyl-glycérol -b-galactosyl-glycérol est à la fois un substrat de la b-galactosidase et un très fort inducteur de l opéron lac

108 le gènes lac ont été transférés dans le génome d E. coli par le transfert horizontal les gènes laci et lacz n ont pas le même % de GC que lacya. L opéron lac à été rassemblé des sources différentes.

109 Partie 5 Travaux pratiques BMC421: les principales expériences

110 Les principaux buts de ces TP - identifier les génotypes d une collection de mutants par les approches phénotypiques, par le dosage de la b-galactosidase et par l analyse à l aide de la PCR les gènes visés - lacz, lacy, laca, laci, cya, crp - laca a t il un rôle dans la catabolisme du lactose? - le mutant cya, peut il être sauvé par l ajout de l AMPc exogène? -peut on «sauver» ces mutants cya- par un milieu de culture d une souche lac+ (bio feeding)? - la fuite de l opéron lac en l absence de lactose, existe-t- il vraiment?

111 Les principaux buts de ces TP - construire par la transduction avec le bactériophage P1 et à partir de simples mutants laci-::cmr et cyaa::km un double mutant laci::cm cyaa-. Question posée quel sera le phénotype de ce mutant en l absence à la fois de la régulation positive et de la régulation négative AMPc site de fixation de CRP operateur lac libre transcription par RNApol X CRP activée X répresseur LacI inactif

112 Les principaux buts de ces TP construire par l approche de génétique inverse les mutants knock-out pour les gènes crr, ptsg, ptsh, cya ou crp. Analyse moléculaire de ce mutants. - étudier par le dosage de l activité de la b galactosidase le phénotype de ces mutants pour déterminer si l effet de glucose est toujours observable et si le rôle de crp et de cya est vraiment important crr ptsh crp cya ptsg

113 Délétion propre par la recombinaison homologue avec un fragment linéaire courte région de homologue l extrémité 5 du gène courte région de homologue l extrémité 3 du gène TD7 cassette de remplacement 5 KmR 3 X recombinaison homologue lacy laca cynx X lacy laca::kmr cynx mutant laca::kmr

114 Les principaux buts de ces TP -- analyser directement la quantité de l ARMm produit dans le mutant déréprimé LacI- et comparé avec la souche sauvage (RT-PCR)

115 Les principaux buts de ces TP La lecture critique et la discussion de 7 articles scientifiques pour -mieux comprendre le sujet -comparer vos résultats avec les résultats publiés par des chercheurs chevronnés TD1 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6 TD7

116 fin