Les protéines recombinantes

Transcription

1 Les protéines recombinantes Produire des protéines de manière contrôlée et en grande quantité 1 Les cellules hôtes 2 Les vecteurs recombinants 3 Purification des protéines recombinantes 1

2 1 Les cellules hôtes Bactérie (Escherichia coli) Levure (Saccharomyces, Pichia pastoris, ) Baculovirus de cellules d insecte (Sf9) Cellules de plante, de mammifère (Chinese Hamster Ovary CHO) 2

3 1 Les cellules hôtes Avantages et inconvénients des différents systèmes d expression 3

4 1 Les cellules hôtes Avantages et inconvénients des différents systèmes d expression Systèmes d expression de protéine E. coli Avantages Rapidité Faible coût Manipulation génétique facile et haut rendement de protéine Inconvénients Pas de modif post tranductionnelles pour les prot. eucaryotes Protéines parfois non repliées S. cerevisiae Rapidité moyenne Faible coût Repliement et modif. post traductionnelles possibles. Prot. sécrétées ou intracellulaires N glycosylation différente par rapport aux prot. mammifères. Nécéssite un peptide signal pour la sécrétion Précautions pour la manipulation Baculovirus/cellules d insecte Rapidité moyenne Prot. sécrétées ou membranaires Repliement et modif. post traductionnelles possibles. N glycosylation différente par rapport aux prot. mammifères. coûteux «scale up» difficile 4

5 2 Les vecteurs recombinants Insertion de la séquence d ADN d intérêt dans le vecteur plasmidique Transfection du vecteur dans les bactéries ( ou autres cellules) 5

6 Clonage d un fragment d ADN 1 Insertion de l ADN dans le vecteur 2 Transfection du vecteur recombinant dans les cellules (E. coli par ex.) 3 Amplification du vecteur dans les cellules 4 Sélection des cellules contenant le vecteur recombinant 6

7 2 Les vecteurs recombinants Insertion d un gène dans un vecteur 7

8 2 Les vecteurs recombinants pbr322 : plasmide bactérien de résistance n pb Deux marqueurs de sélection (résistance aux antibiotiques ampi et tétra) Carte de restriction du plasmide pbr322. 8

9 2 Les vecteurs recombinants 9

10 2 Les vecteurs recombinants Le gène d intérêt est coupé par des enzymes de restriction (RE). Le plasmide est coupé avec les mêmes enzymes de restriction. Le gène est inséré dans le plasmide et puis «religué» par la ligase. Le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie (transformation). 10

11 Les enzymes de restriction Enzymes coupant l ADN à une séquence nucléotidique particulière (le site de restriction) 11

12 Les enzymes de restriction EcoR1 Sticky end Sma1 Blunt end 12

13 Les enzymes de restriction 13

14 Les enzymes de restriction 14

15 Les enzymes de restriction 15

16 ADN recombinant 16

17 La ligation Réaction T4 DNA ligase 17

18 De nombreux vecteurs plasmidiques Exemple : puc avec gène de sélection amp et gène lacz 18

19 Sélection des bactéries ayant le plasmide recombinant bactérie plasmide résistance état du gène lacz croissance sur Ampicilline couleur du clone sur Xgal bact. [AmpS] aucun aucune délété pas de clone bact. [AmpS] puc natif à l'ampicilline fonctionnel + bleu bact. [AmpS] puc recombiné à l'ampicilline interrompu + blanc 19

20 De nombreux vecteurs plasmidiques adaptés à un type cellulaire contenant des étiquettes (tag) pour permettre la purification pgex : obtention d une protéine de fusion GST prot pet :introduction d une séquence polyhistidine GST : glutathione S transférase 20

21 21

22 La purification de la protéine Protéine de fusion (GST) La GST se lie à la glutathione. La protéine de fusion GCT protéine est éluée. 22

23 La purification de la protéine Protéine de fusion (GST) 23

24 La purification de la protéine Protéine étiquetée poly His 24

25 La purification de la protéine Chromatographie d affinité 25

26 La purification de la protéine Protéine étiquetée poly His 26

27 La purification de la protéine 27

28 Production de l insuline humaine 28